专利名称：一种筛选抗烟草黑胫病放线菌的方法
技术领域：
本发明涉及一种筛选抗烟草黑胫病放线菌的方法，属植物保护技术领域。
背景技术：
烟草黑胫病(Phtophthro nicotinae Breda de Hann)于1896年首次发现于印尼爪哇，现已是世界性烟草的毁灭性病害之一，从苗期到成株期都可发生。我国于1950年发现于黄淮烟区，目前全国大部分烟草种植区均有此病发生。长期以来，生产上对该病的控制主要依靠化学农药来进行防治，而化学防治难以长期持续有效，还严重污染环境。
抗烟草黑胫病放线菌是一类很重要的农用抗生素产生菌，70％以上的农用抗生素均为放线菌产生，在植物病原真菌病害的生物防治中起着非常重要的作用。常规方法大多采用孢子萌发法、菌丝生长速率法等离体筛选模型，由于缺乏在活体植株的防效验证，有些对孢子萌发和菌丝生长抑制活性较高的产物在温室盆栽烟苗上却不表现出防效，造成筛选结果不可靠，并影响到实际应用。将菌丝生长速率法、离体叶片法和温室盆栽活体试验集成于有效筛选抗烟草黑胫病放线菌，目前尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于克服传统技术中的不足，而提供一种使筛选结果可靠的抗烟草黑胫病放线菌的筛选方法。
本发明将离体筛选模型(菌丝生长速率法、离体叶片法)与活体筛选模型(温室盆栽烟苗)相结合，建立了一套结果可靠的抗烟草黑胫病放线菌的筛选方法。
本发明的筛选抗烟草黑胫病放线菌的方法，包括菌丝生长速率初筛活性菌株、离体叶片法复筛出活性菌株步骤，及温室盆栽活体试验验证活性菌株步骤其中(1)菌丝生长速率初筛活性菌株步骤中所用的烟草黑胫病菌株从烟草病株上分离出，用V8汁培养基和燕麦培养基培养，25℃保存备用；将Φ5mm的烟草黑胫病菌菌丝块接种于已带发酵液提取物的V8汁培养基中，菌丝块沿培养皿周缘放置，每皿放置4块，每处理3个重复，置于28℃培养箱中，黑暗培养7天后观察记录，分析抑菌效果，初步筛选出对烟草黑胫病菌(Phtophthro nicotinae Breda de Hann)菌丝生长抑制率大于70％的活性菌株；
(2)离体叶片法复筛出活性菌株步骤中剪取长势均匀一致的叶片，喷施丝生长速率初筛活性菌株步骤中得到的活性菌株发酵液提取物，晾干后，置于铺有湿纱布的塑料盘内，用0.5cm的菌饼针刺创伤接种8块/叶；然后放置于保温保湿接种箱内，每处理3片叶；设清水为空白对照，待空白对照发病后观察记录，计算防治效果，复筛出对烟草黑胫病防治效果大于70％的活性菌株；(3)温室盆栽烟苗验证步骤中将在V8汁培养基培养10d的烟草黑胫病菌种连同培养基一起切碎，与蛭石充分混匀，装入纸杯内，移植长至4-5叶期的烟苗，每杯2株，3重复/处理；加入经离体叶片法复筛出的活性菌株发酵液提取物，5mL/杯；然后置于28℃培养箱中保湿培养；设空白对照处理，加灭菌水，接种培养5天后，检查烟苗发病情况，计算病情指数及相对防治效果，筛选出抗烟草黑胫病放线菌有防治效果的放线菌菌株。
通过本发明的方法，筛选到了一批具有较好抗烟草黑胫病活性的放线菌菌株，入选菌株在抗烟草黑胫病的离体及活体筛选模型上均具有较好活性，为下一步追踪分离活性化合物提供了可靠结果。本方法还具有简便、操作、易有效地筛选出防治烟草黑胫病的放线菌等优点。
具体实施例方式以下是本发明的实施例，但本发明的内容并不局限于此。
一、菌丝生长速率法初筛活性菌株1.烟草黑胫病指示菌的制备烟草黑胫病菌(Phtophthro nicotinae Breda de Harm)，从烟草病株上分离并用V8汁培养基和燕麦培养基培养，25℃保存备用。
2.抗烟草黑胫病放线菌的制备a.放线菌菌株的制备选用的实验菌株为334株从云南各地土壤中采集和分离得到的放线菌菌株。分别将菌株接种于斜面上，28℃培养168h。
斜面培养基酵母膏4g、葡萄糖4g、麦芽膏5g、复合维生素5mg、微量盐1mL、琼脂粉20g、水1000mL、pH7.2。
b.发酵液的制备将菌株从生长好的斜面接种于100mL种子液中，种子液220rpm、28℃振荡培养48h后，再按10％的接种量接种于100mL发酵液中，220rpm、28℃振荡培养120h。
种子培养基酵母膏4g、葡萄糖4g、麦芽膏5g、复合维生素5mg、微量盐1mL、水1000mL、pH7.2。
发酵培养基大豆粉20g、蛋白胨2g、葡萄糖20g、淀粉5g、酵母膏5g、NaCl4g、K2HPO40.5g、MgSO4.7H2O 0.5g、CaCO32g、水1000mL、pH7.8。
c.发酵液的后处理上述发酵液加入等体积乙醇，经振荡8h后，离心(3000rpm，10min)，取上清液，并在旋转蒸发仪上50℃蒸去乙醇，水相用冻干仪冻成干粉后保存备用，测定活性时用无菌水溶解、稀释定容到发酵原液的浓度。
3.抗烟草黑胫病放线菌的筛选将Φ5mm的烟草黑胫病菌菌丝块接种于已带发酵液提取物的V8汁培养基中，菌丝块沿培养皿周缘放置，每皿放置4块，每处理3重复。置于28℃培养箱中，黑暗培养7天，记载生长与否。若生长形成菌落，以mm为单位十字交叉测量菌落直径，减去菌饼的直径，取平均值。计算各杀菌剂平板上的生长速率，并以在空白对照培养基平板上的生长速率比较，分析各发酵液提取物对黑胫病菌的抑菌效果。
菌落直径(mm)＝测量菌落直径-5.0mm抑菌百分率(％)＝(对照组菌落直径-处理组菌落直径)/对照组菌落×100对照药剂分别为53％雷多米尔锰锌可湿性粉剂1000倍处理和72.2％普力克1000倍处理。
本实验获得28株对烟草黑胫病菌丝生长抑制率大于70％的放线菌菌株。
二、离体叶片法复筛活性菌株烟草黑胫病指示菌的制备及抗烟草黑胫病放线菌的制备同菌丝生长速率初筛活性菌株中的制备方法，不同之处在于，对抗烟草黑胫病放线菌的筛选采用离体叶片法实验进行。
采用离体叶片法对抗烟草黑胫病放线菌的筛选供试植物为烟草，品种为红花大金元。剪取长势均匀一致的叶片，喷施经菌丝生长速率初筛后得到的活性菌株发酵液提取物，晾干后，置于铺有湿纱布的塑料盘内，用0.5cm的菌饼针刺创伤接种8块/叶；然后放置于保温保湿接种箱内。每处理3片叶，设清水为空白对照。待空白对照发病后，测定叶片发病率，并进行病情分级，以病情指数来计算防治效果。
分级标准0级无症状；1级病斑直径0.1cm-1.0cm；3级病斑直径1.1cm-2.0cm以下；5级病斑直径2.1cm-3.0cm；7级病斑直径3.0cm以上。
病情指数＝∑(各级病斑×相对级数值)/(调查总病斑数×7)×100防治效果(％)＝(CK病情指数-施药后病情指数)/CK病情指数×100对照药剂同丝生长速率初筛活性菌株步骤中所用药剂。
采用离体叶片法实验获得20株对烟草黑胫病防治效果大于70％的放线菌。
三、温室盆栽活体验证采用温室盆栽活体试验步骤为供试植物烟草，品种为红花大金元。将在V8汁培养基培养10d的烟草黑胫病菌种连同培养基一起切碎，与蛭石充分混匀，装入纸杯内，移植长至4-5叶期的烟苗，每杯2株，3重复/处理；加入经离体叶片法筛选后得到的活性菌株发酵液提取物，5mL/杯；然后置于28℃培养箱中保湿培养。设空白对照处理，加灭菌水。接种培养5天后，检查烟苗发病情况，计算病情指数及相对防治效果。
抗抗烟草黑胫病药效的计算采用下列两公式病情指数＝∑(各级病株×相对级数值)/(调查总株数×7)×100防治效果(％)＝(CK病情指数-施药后病情指数)/CK病情指数×100当计算出的防治效果(％)≥70％时，可认为该菌株发酵液供试样品具有较好的抗烟草黑胫病活性。
本实施例通过温室盆栽活体试验，确定获得9株对烟草黑胫病防治效果大于70％的放线菌。
权利要求
1.一种筛选抗烟草黑胫病放线菌的方法，包括菌丝生长速率初筛活性菌株、离体叶片法复筛出活性菌株步骤，其特征在于该方法还包括温室盆栽活体试验验证步骤其中(1)菌丝生长速率初筛活性菌株步骤中所用的烟草黑胫病菌株从烟草病株上分离出，用V8汁培养基和燕麦培养基培养，25℃保存备用；将Φ5mm的烟草黑胫病菌菌丝块接种于已带发酵液提取物的V8汁培养基中，菌丝块沿培养皿周缘放置，每皿放置4块，每处理3重复，置于28℃培养箱中，黑暗培养7天后观察记录，分析抑菌效果，初步筛选出对烟草黑胫病菌(Phtophthro nicotinae Breda de Hann)菌丝生长抑制率大于70％的活性菌株；(2)离体叶片法复筛出活性菌株步骤中剪取长势均匀一致的叶片，喷施丝生长速率初筛活性菌株步骤中得到的活性菌株发酵液提取物，晾干后，置于铺有湿纱布的塑料盘内，用0.5cm的菌饼针刺创伤接种8块/叶；然后放置于保温保湿接种箱内，每处理3片叶；设清水为空白对照，待空白对照发病后观察记录，计算防治效果，复筛出对烟草黑胫病防治效果大于70％的活性菌株；(3)温室盆栽烟苗验证步骤为将在V8汁培养基培养10d的烟草黑胫病菌种连同培养基一起切碎，与蛭石充分混匀，装入纸杯内，移植长至4-5叶期的烟苗，每杯2株，3重复/处理；加入经离体叶片法复筛出的活性菌株发酵液提取物，5mL/杯；然后置于28℃培养箱中保湿培养；设空白对照处理，加灭菌水，接种培养5天后，检查烟苗发病情况，计算病情指数及相对防治效果，筛选出抗烟草黑胫病放线菌有防治效果的放线菌菌株。
全文摘要
本发明涉及一种筛选抗烟草黑胫病放线菌的方法，属植物保护技术领域。本方法包括菌丝生长速率法初筛活性菌株、离体叶片法复筛出活性菌株步骤，及温室盆栽活体试验验证步骤。首先用菌丝生长速率法，初筛出对烟草黑胫病菌Phtophthro nicotinae Bredade Hann菌丝生长抑制率大于70％的放线菌发酵液提取物；再对菌丝生长速率法得到的提取物，用离体叶片法和温室盆栽烟苗复筛其对烟草黑胫病的防治效果，筛选出应用前景好的抗烟草黑胫病放线菌。本方法筛选到的具有较好抗烟草黑胫病活性的放线菌菌株，入选菌株在抗烟草黑胫病的离体及活体筛选模型上均具有较好活性，为追踪分离活性化合物提供了可靠结果。本方法还具有简便、操作、易有效地筛选出防治烟草黑胫病的放线菌等优点。
文档编号C12N1/20GK1778894SQ20051001105
公开日2006年5月31日 申请日期2005年10月12日 优先权日2005年10月12日
发明者曾莉, 李铭刚, 刘树芳, 李一青, 李家瑞, 崔晓龙, 文孟良 申请人:云南大学