专利名称：缩胆囊素活性片段的串联表达及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域。具体涉及表达缩胆囊素基因的重组质粒的构建、缩胆囊素基因在大肠杆菌中的表达和缩胆囊素基因工程产物的纯化。本发明进一步涉及重组缩胆囊素多肽对猪、兔、牛、鸡等动物的主动免疫技术及其应用。
背景技术：
缩胆囊素(Cholecystokinin，CCK)是一种调节动物采食量的有效因子。缩胆囊素又称胆囊收缩素或促胰酶素，是由小肠粘膜的I细胞分泌的多肽类激素。CCK前体为130个氨基酸，逐步分解成为小分子的CCK，目前发现的CCK有CCK-83，CCK-58，CCK-39，CCK-33，CCK-12，CCK-8和CCK-4。其不同部位主要在羧基端，但长度延伸在氨基端。餐后血浆中主要为大分子CCK，包括CCK-58，CCK-39，CCK-33和CCK-12。这些大分子CCK经胰蛋白酶水解后均成为8肽的氨基酸残基，即CCK-8。CCK-8具有CCK分子的全部活性，与8肽的胃泌素结构相似，都具有相同的氨基末端序列Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2，该序列是CCK和胃泌素发挥其生物活性所必需的。CCK存在于脑和胃肠道中，是脑内含量较高的一种脑肠肽(brain-gutpeptide)类物质。CCK在各部位的含量则差别很大。在胃肠道，CCK可以促进胆囊、胃和幽门括约肌的收缩；促进远端十二指肠和空肠蠕动；促进胆汁、胃酸、胰液的分泌；增强胰酶的活性；促进胰岛素、胰高血糖素、降钙素的释放；调节胰多肽在肠道和胰液中的释放；抑制胃排空等功能。CCK受体有两种CCK-A受体和CCK-B受体，其中CCK-A受体在外周器官含量很高，而CCK-B受体在中枢神经系统中含量很高。CCK-A受体有两个结合位点高亲和力位点和低亲和力位点。近年来的研究表明CCK是和CCK-A的低亲和力位点结合使动物产生饱感从而使动物采食停止。
CCK可以降低多种动物的采食量。CCK-A受体基因敲除大鼠表现为肥胖、易饥饿、采食增加(Schwartz等，1999)。研究发现，在多种动物中，无论是外源性CCK，还是机体自身生成的内源性CCK都能使机体产生饱感(Della等，1979，1981；Gibbs等，1973；Mc Laughlin等，1980)。外源性注入CCK也会降低动物的采食量。中枢和外周引入CCK具有相同的降低采食量的作用，CCK作为神经递质直接在脑内产生饱感。小剂量CCK就可以有效地抑制动物采食，在狗、鼠、兔、猴等多种哺乳动物及人体实验研究中发现，无论生理剂量或药理剂量的CCK都能抑制进食后的胃排空活动(Doong等，1998)，进而抑制动物采食。血浆CCK浓度与胃排空率呈反比关系。
对CCK免疫的研究已经开展了较长时间，早期研究表明，利用免疫调控技术可有效调控体内激素的分泌，从而调节动物的生产性能(Della等，1981；Lawrence等，1986；Pekas，1991，1993；Schanbacher等，1994)。目前，在猪和一些反刍动物上已有以CCK为抗原进行主动免疫和被动免疫的研究报道，结果表明对动物生产性能有一定的调控作用。Jens等(1978)用CCK-33单独免疫兔子，在加强免疫3次后，获得了效价很高的抗CCK-33的抗血清，说明CCK有一定的抗原性，可以用来接种动物使之产生抗体。而国内，陈均辉(1992)用CCK-8大分子与牛血清蛋白(BSA)联结形成全抗原免疫兔子，加强免疫后也获得了高滴度的抗CCK-8抗血清。虽然CCK免疫调控在猪、羊上有一定效果，但为了在生产中能够应用该技术，必须寻找到一种CCK免疫原，其免疫用量少，免疫过程方便可行，抗体相对稳定、易于保存使用，而且能大量生产抗体，又符合动物保护法规的方法。
用CCK作抗原主动免疫动物可以提高动物的采食量和增重。Pekas和Trout(1990)用CCK免疫生长猪后，其采食量和增重分别提高了8.2％和10.6％，胴体重提高8.7％，体长增加2.4％，对瘦肉/脂肪的比值和蛋白质/脂肪的比值没有影响，但CCK免疫猪的胴体瘦肉和脂肪重增加。由此可见，CCK免疫后，猪的生长速度增加是因为胴体增重增加，但对胴体组成没有影响。Mclaughlin等(1985)用CCK主动免疫鼠后发现，处理组比对照组的采食量增加了9％(P＜0.04)，增重提高了17％(P＜0.02)。这些研究结果表明应用CCK主动免疫动物对于动物的采食具有一定的促进作用，但结论也仅限于一些哺乳动物，对于其它动物方面的效果还有待进一步实验证实。
以上研究都是将化学合成的，或者是从动物组织中分离纯化的CCK或其活性部分与大分子物质(如BSA等)偶联，然后免疫动物。但还没有采用大肠杆菌表达CCK或其活性片段(如CCK-33肽、CCK-8肽)的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一个获得缩胆囊素活性片段多串联体的方法。
本发明提供的获得缩胆囊素活性片段多串联体的方法的关键，是构建表达缩胆囊素33肽的多串联体的重组质粒。该质粒是采用基因工程方法获得的，具体构建方法如下(1)根据鸡cck基因的碱基序列及大肠杆菌高频密码子，设计合成cck-33基因，基因序列为GGTTCTACTGGCCGCTTCTCTGTCCTTGGCAACCGTGTACAGAGCATTGATCCGACG CACCGTATTAATGACCGTGACTACATGGGCTGGATGGATTTT。
(2)将cck-33基因插入pRSETA质粒，获得重组质粒pRSETA-1CCK，具体操作如下根据人工合成的cck-33基因设计特异性引物P1(5′-CATGGATCCGGTTCTACTGGCCGCT-3′)/P2(5′-CATGAGCTCCCAAAATCCATC CAGCC-3′)，采用PCR方法，以人工合成的cck-33基因为模板，扩增cck-33基因片段。。扩增cck-33基因片段的PCR反应体系(200μL)组成如下20μL 10 ×buffer，16μL dNTPs，2μL Taq酶，1.5μL引物P1，1.5μL引物P2，0.5μL人工合成的cck-33基因模板，最后加水至总体积达到200μL。PCR温度循环程序如下循环194℃ 3min；循环2～3194℃ 40sec，56℃40sec，72℃ 60sec；循环3272℃ 10min。扩增产物在4℃保存。用2％琼脂糖凝胶(含0.5μg/mL溴化乙锭，EB)电泳检测PCR产物，观察到大小约120bp的特异性条带。
用SacI和BamH I在37℃分别消化cck-33基因的PCR产物和质粒pRSETA，接着在T4连接酶的作用之下，连接已消化的cck-33基因的PCR产物和质粒pRSETA。用连接产物转化大肠杆菌DH5α。经Ampr抗性筛选，获得插入了cck-33基因的转化子。然后用特异性引物P1/P2对含有cck-33基因的转化子进行PCR筛选。检测cck-33基因片段的PCR反应体系(20μL)组成如下2μL 10×buffer，1.6μL dNTPs，0.2μL Taq酶，0.5μL引物P1，0.5μL引物P2，1μL待检菌液，最后加水至总体积达到20μL。PCR温度循环程序如下循环194℃ 3min；循环2～3194℃ 40sec，56℃ 40sec，72℃ 60sec；循环3272℃ 10min。扩增产物在4℃保存。用2％琼脂糖凝胶(含0.5μg/mL溴化乙锭，EB)电泳检测PCR产物，观察到大小约120bp的特异性条带。
对PCR筛选阳性的细菌，挑取单菌落接种于3mL LA培养基中，37℃，200r/m振摇培养16～20h，抽提质粒，再经限制性内切酶消化和序列测定，获得重组质粒命名为pRSETA-1CCK。
(3)根据BamHI和Bg1II互为同尾酶的特性，构建cck-33基因2串联体(简称2cck)，具体操作如下将重组质粒pRSETA-1CCK用两组酶在37℃进行消化第一组用BamHI和HindIII进行消化，回收较小的片段；第二组用BglII、HindIII和CIAP进行消化，回收较大的片段。接着在T4连接酶的作用之下，连接回收的大片段和小片段。用连接产物转化大肠杆菌DH5α。经Ampr抗性筛选，获得携带2cck的重组子。然后用特异性引物P1/P2对含有2cck的重组子进行PCR筛选。检测2cck的PCR反应体系(20μL)组成如下2μL 10×buffer，1.6μL dNTPs，0.2μL Taq酶，0.5μL引物P1，0.5μL引物P2，1μL待检菌液，最后加水至总体积达到20μL。PCR温度循环程序如下循环194℃ 3min；循环2～3194℃ 40sec，56℃ 40sec，72℃ 60sec；循环3272℃ 10min。扩增产物在4℃保存。用2％琼脂糖凝胶(含0.5μg/mL溴化乙锭，EB)电泳检测PCR产物，观察到约230bp的特异性条带。
对PCR筛选阳性的细菌，挑取单菌落接种于3mL LA培养基中，37℃，200r/m振摇培养16～20h，抽提质粒，再经限制性内切酶消化和序列测定，获得的重组质粒命名为pRSETA-2CCK。
(4)在pRSETA-2CCK的基础上构建cck-33基因的4串联体(简称4cck)，具体操作如下
将重组质粒pRSETA-2CCK用两组酶在37℃进行消化第一组用BamHI和HindIII进行消化，回收较小的片段；第二组用BglII、HindIII和CIAP进行消化，回收较大的片段。接着在T4连接酶的作用之下，连接回收的大片段和小片段。用连接产物转化大肠杆菌DH5α。经Ampr抗性筛选，获得携带4cck的重组子。然后用特异性引物P3(5’-GATAAGGATCGATGGGGATCC-3’)/P4(5’-ATGGTACCAGCTGCAGATCT-3’)对含有4cck的重组子进行PCR筛选。对PCR筛选阳性的细菌，挑取单菌落接种于3mL LA培养基中，37℃，200r/m振摇培养16～20h，抽提质粒，再经限制性内切酶消化和序列测定，获得的重组质粒命名为pRSETA-4CCK。
采用相同的方法，分别获得携带CCK-33基因6串联体(简称6cck)、8串联体(简称8cck)的重组质粒，相应地命名为pRSETA-6CCK、pRSETA-8CCK。
获得表达CCK-33肽多串联体的重组质粒后，用重组质粒转化大肠杆菌，获得表达CCK-33肽多串联体的基因工程菌，然后在IPTG的诱导之下，表达CCK-33肽多串联体，并对表达产物进行鉴定和纯化。以CCK-33肽4串联体(简称4CCK)的表达为例，方法如下(1)经测序鉴定的重组质粒pRSETA-4CCK转化E.coLi BL-21(DE3)受体菌，挑取单个重组菌落，接种于3mL LA液体培养基中，37℃振摇培养5h后，用特异性引物P3/P4进行PCR鉴定，阳性菌为可表达cck-33基因4串联体的基因工程菌，命名为E-4CCK。
(2)取E-4CCK在LA平板上于37℃划线培养16～20小时。挑取单个菌落在LA液体培养基中于37℃培养12～16小时，将菌液置于4℃冰箱保存。按1％比例接种LA液体培养基，37℃，200r/m振摇培养至OD600值达0.5左右时，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，分别在加入IPTG后0、1、2、3、4小时取菌液，用SDS-PAGE进行鉴定。用CCK阳性血清对表达的融合蛋白进行Western Blot分析。
SDS-PAGE方法如下将细菌悬液于10000r/m离心1min，取沉淀。加入一定量的双蒸水，重悬细菌。将样品保存在4℃冰箱备用。参照汪家政等(2000)编《蛋白质手册》方法制备SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)。成层胶浓度为5％，分离胶浓度为12～15％，根据所检测的目的产物的分子量而定。将待检样品煮沸5min，取10μL加入凝胶点样孔中，在电场作用下进行电泳。电泳缓冲液为Tris-甘氨酸。电压为80v/cm，待溴酚蓝到达成层胶底部时电压升高到160v/cm。待溴酚蓝接近凝胶底部时，停止电泳，取下凝胶，置于1％考马斯亮蓝溶液中染色过夜，用脱色液脱色。
Western Blot分析方法如下SDS-PAGE电泳结束后，不对凝胶进行染色。剪一张与凝胶相同大小的硝酸纤维素膜及两张滤纸，与电泳之后的凝胶一起在室温浸泡在转移缓冲液中15min，按海绵-滤纸-凝胶-硝酸纤维素膜-滤纸-海绵的顺序安装转印夹。将夹中有膜的一侧接正极，并在15V的电压下转移1.5h。转移后的膜用5％脱脂奶粉封闭过夜，弃去封闭液，用TBS洗膜三次。弃去TBS，加入用1％脱脂奶粉1000倍稀释的兔抗CCK-8肽阳性血清(SIGMA公司)，温和振摇3h。弃去一抗血清，用TBS洗膜三次，每次约10min。弃去TBS，加入用1％脱脂奶粉50倍稀释的二抗(辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG抗体，华美公司)，温和振摇至少1h。弃去二抗，用TBS洗膜三次，每次约30min。弃去TBS，加入DAB溶液显色，轻摇硝酸纤维素膜，待显色达一定程度，用双蒸水洗膜终止显色反应。
(3)将IPTG诱导表达的E-4CCK菌体收集后，于0℃冰浴上进行超声破碎、离心后，沉淀用8mol/L的尿素进行溶解。用50％Ni-NTA纯化树脂在变性条件下进行纯化。具体操作如下将1000mL基因工程菌E-4CCK在IPTG诱导表达4h取样，4℃10000r/m离心2min，收集菌体并保存在-20℃；将表达的保存细菌菌体沉淀置冰上解冻15min，加20mL Buffer B悬浮细菌，将悬浮液在冰浴条件下置摇床上温和摇动30min，充分变性裂解包涵体，然后在冰浴中进行超声破碎，超声时间为6秒，间隔时间为8秒，功率为400W，破碎次数40次。4℃ 10000r/m离心20min，取上清液进行纯化。
将纯化柱中装入20mL的Buffer B，将50％Ni-NTA纯化树脂混匀，取出4mL装柱，待树脂沉淀好后，将纯化柱的开关关闭，用Buffer B平衡纯化柱，约需12h。用Buffer B清洗纯化柱。待Buffer B即将流尽(但不能流干)时将裂解上清2mL缓慢加入到纯化柱中，然后依次用4mL BufferC、4mL Buffer D、4mL Buffer E过柱洗脱，并分别收集样品。将以上样品进行SDS-PAGE分析。纯化用缓冲液Buffer B、Buffer C、Buffer D、Buffer E必须新鲜配制，其组成如下Buffer B100mmol/L NaH2PO4、10mmol/L Tris HCL、8mol/L尿素，pH8.0；Buffer C100mmol/L NaH2PO4、10mmol/L Tris-HCL、8mol/L尿素，pH6.3；Buffer D100mmol/L NaH2PO4、10mmol/L Tris-HCL、8mol/L尿素，pH5.9；Buffer E100mmol/L NaH2PO4、10mmol/L Tris-HCL、8mol/L尿素，pH4.5。
经50％Ni-NTA树脂纯化的蛋白再用透析袋透析。用棉绳将透析袋的一侧系紧，将适量的蛋白纯化溶液装在透析袋内，再将透析袋的另一侧用棉绳系紧；将装有纯化蛋白的透析袋放置在大体积的透析液I中，4℃下在磁力搅拌器上进行搅拌4～5h。依次更换透析液II、III、IV、V、VI、VII、VIII，重复上述操作过程。最后透析袋放置在大体积的生理盐水中，4℃下在磁力搅拌器上进行搅拌4～5h。透析袋埋在硅胶里进行蛋白浓缩，将浓缩后的蛋白取出放在4℃冰箱保存。透析液的组成如下透析液I6mol/L尿素、10mmol/L Tris-HCL、0.1mol/L NaH2PO4，pH4.5；透析液II6mol/L尿素、10mmol/L Tris-HCL、0.1mol/L NaH2PO4，pH5.5；透析液III4mol/L尿素、10mmol/L Tris-HCL、0.1mol/L NaH2PO4，pH5.5；透析液IV4mol/L尿素、10mmol/L Tris-HCL、0.1mol/L NaH2PO4，pH6.5；透析液V2mol/L尿素、10mmol/L Tris-HCL、0.1mol/L NaH2PO4，pH6.5；透析液VI2mol/L尿素、10mmol/L Tris-HCL、0.1mol/L NaH2PO4，pH7.5；透析液VII10mmol/L Tris-HCL、0.1mol/L NaH2PO4，pH7.5；透析液VIII10mmol/L Tris-HCL、0.1mol/L NaH2PO4，pH8.5。
本发明提供的表达CCK-33肽多串联体的重组质粒的特征为(1)本发明提供的重组质粒pRSETA-1CCK、pRSETA-2CCK、pRSETA-4CCK、pRSETA-6CCK、pRSETA-8CCK都具有序列表中序列1的核苷酸序列，或序列1的串联体序列。序列1又称为cck-33基因，由99个碱基对组成，是根据鸡cck基因的碱基序列及大肠杆菌高频密码子而设计的。序列1的串联体序列，是用若干个碱基将两个cck-33基因以首尾相连的方式，将若干个cck-33基因连接起来形成的序列。对于序列1和序列1的多串联体，采用PCR方法可以扩增出特异性条带，也可以采用DNA序列测定的方法进行确定。
(2)本发明提供的重组质粒的表达产物具有序列表中序列2的氨基酸序列，或序列2的串联体序列。序列2又称为CCK-33肽，是由序列1编码的。序列2的串联体序列，是用若干个氨基酸将两个CCK-33肽以首尾相连的方式，将若干个CCK-33肽连接起来形成的序列。采用抗CCK-33肽的特异性抗体，或者抗CCK-8肽的特异性抗体，或者抗其它形式的CCK的特异性抗体，都可以检测到该多肽产物。
(3)本发明提供的重组质粒还包括具有cck等同序列的质粒。cck等同序列，是与cck-33基因的核苷酸序列，或CCK-33肽的氨基酸残基序列相比有一个或若干个核苷酸或氨基酸残基的差别，包括碱基或氨基酸残基的改变、缺失、添加、或插入，或与cck-33基因序列中的连续24个碱基以上的区段有75％以上的同源性。
本发明提供的重组CCK-33肽多串联体具有重要的应用价值。应用之一是将所述的重组CCK-33肽多串联体作为抗原，采用重组CCK-33肽多串联体直接免疫或将其与佐剂同时免疫猪、牛、兔、鸡等动物，可以促进动物采食，提高生产性能。
本发明提供的重组CCK-33肽多串联体的第二个应用，是采用重组CCK-33肽多串联体直接免疫或将其与佐剂配合制成疫苗免疫蛋鸡，通过收集免疫鸡的鸡蛋，可以大量获得抗CCK的特异性抗体。
本发明提供的重组CCK-33肽多串联体的另一个应用，是将所述的重组CCK-33肽多串联体作为抗原，应用于包括但不限于ELISA(酶联免疫吸附试验)，检测动物血清中的CCK特异性抗体。
本发明具有明显的优点和效果。(1)本发明根据大肠杆菌偏爱密码子设计基因序列，采用基因工程的方法表达CCK-33肽多串联体，表达量高，成本低。(2)本发明获得的CCK-33肽多串联体具有很好的免疫原性。CCK在动物体内主要以羟基端酰胺化的CCK-8和CCK-33的形式存在。由于CCK-33和CCK-8的分子量太小，不能直接作为抗原免疫动物，一般需要将它们与大分子物质(如BSA)偶联。而本发明将CCK-33肽进行串联，获得的CCK-33肽多串联体分子量大，抗原位点增加，免疫原性好，因此不需要与大分子物质偶联就可以作为抗原免疫动物。和化学合成方法获得CCK蛋白相比，该方法具有明显的优点。
以下结合实施例和附图对本发明提供的表达CCK-33肽多串联体质粒的构建、表达产物的特征分析、应用途径作具体说明。
图1为cck-33基因及其多串联体构建示意图。pRSET A为克隆质粒载体，pRSETA-1CCK为插入了cck-33基因的重组质粒，pRSETA-2CCK为插入了cck-33基因2串联体(2cck)的重组质粒，pRSETA-4CCK为插入了cck-33基因4串联体(4cck)的重组质粒，pRSETA-6CCK为插入了cck-33基因6串联体(6cck)的重组质粒，pRSETA-8CCK为插入了cck-33基因8串联体(8cck)的重组质粒。BamHI、HindIII、BglII、SacI是质粒上的限制性内切酶位点。
图2为cck-33基因及其多串联体的PCR鉴定结果图。泳道1或2是cck-33基因及其多串联体的PCR产物，泳道M为DNA分子量标记。A为cck-33基因PCR产物，B为cck-33基因4串联体(4cck)PCR产物，C为cck-33基因8串联体(8cck)PCR产物。
图3为用限制性内切酶BamH I和HindIII分别对重组质粒pRSETA-1CCK、pRSETA-2CCK、pRSETA-4CCK、pRSETA-6CCK和pRSETA-8CCK进行双酶切的电泳鉴定图。M为DNA分子量标准DL2000；1泳道为pRSETA-1CCK质粒酶切产物，外源片断大小约为120bp；2泳道为pRSETA-2CCK质粒酶切产物，外源片断大小约为230bp；3泳道为pRSETA-4CCK质粒酶切产物，外源片断大小约为450bp；4泳道为pRSETA-6CCK质粒酶切产物，外源片断大小约为700bp；5泳道为pRSETA-8CCK质粒酶切产物，外源片断大小约为1100bp。
图4为大肠杆菌表达CCK-33肽4串联体(4CCK)表达产物的SDS-PAGE(12％)检测图。M为蛋白质分子量标准；1～5泳道为在1mmol/L的IPTG诱导下的含有CCK-33肽4串联体(4CCK)表达产物的细菌裂解物，诱导表达时间分别为0h、1h、2h、3h和4h。箭头所指为CCK-33肽4串联体(4CCK)表达产物。
图5为大肠杆菌表达的CCK-33肽6串联体(6CCK)表达产物的SDS-PAGE(12％)检测图。M为蛋白质分子量标准；1～4泳道为在1mmol/L的IPTG诱导下的含有CCK-33肽6串联体(6CCK)表达产物的细菌裂解物，诱导表达时间分别为0h、1h、2h和3h。箭头所指为CCK-33肽6串联体(6CCK)表达产物，分子量约为27kD。
图6为CCK-33肽4串联体表达产物的免疫印迹(westernblot)检测图。M为蛋白质分子量标准；1为CCK-33肽4串联体(4CCK)表达产物。
图7为CCK-33肽4串联体(4CCK)表达产物亲和层析纯化过程中不同阶段组分的SDS-PAGE检测图。M为蛋白质分子量标准；1～2为洗脱液E洗脱组分；3为洗脱液D洗脱组分；4为洗脱液C洗脱组分；5～6为洗脱液B洗脱组分；7为未经纯化的含有4CCK表达产物的细菌裂解物；8为不含有4CCK表达产物的细菌裂解物。
图8为CCK-33肽4串联体(4CCK)融合蛋白透析后的SDS-PAGE检测图。M为蛋白分子量标准；1-2泳道为透析后的4CCK融合蛋白，分子量约约为21kD。
实施方法1、表达缩胆囊素33肽的重组质粒的构建首先根据鸡cck基因的碱基序列及大肠杆菌高频密码子，设计合成cck-33基因，基因序列为GGTTCTACTGGCCGCTTCTCTGTCCTTGGCAACCGTGTACAGAGCATTGATCCGACGCACCGTATTAATGACCGTGACTACATGGGCTGGATGGATTTT。然后，将cck-33基因插入pRSETA质粒，获得重组质粒pRSETA-1CCK，具体操作如下根据人工合成的cck-33基因设计特异性引物P1(5’-CATGGATCCGGTTCTACTGGCCGCT-3’)/P2(5’-CATGAGCTCCCAAAATCCATCCAGCC-3’)，采用PCR方法，以人工合成的cck-33基因为模板，扩增cck-33基因片段。扩增cck-33基因片段的PCR反应体系(200μL)组成如下20μL10×buffer，16μL dNTPs，2μL Taq酶，1.5μL引物P1，1.5μL引物P2，0.5μL人工合成的cck-33基因模板，最后加水至总体积达到200μL。PCR温度循环程序如下循环194℃ 3min；循环2～3194℃ 40sec，56℃ 40sec，72℃ 60sec；循环3272℃ 10min。扩增产物在4℃保存。用2％琼脂糖凝胶(含0.5μg/mL溴化乙锭，EB)电泳检测PCR产物，观察到特异性条带。
用SacI和BamHI在37℃分别消化cck-33基因的PCR产物和质粒pRSETA，接着在T4连接酶的作用之下，连接消化的cck-33基因的PCR产物和质粒pRSETA。用连接产物转化大肠杆菌DH5α。经Ampr抗性筛选，获得插入了cck-33基因的转化子。然后用特异性引物P1/P2对含有cck-33基因的转化子进行PCR筛选。检测cck-33基因片段的PCR反应体系(20μL)组成如下2μL 10×buffer，1.6μL dNTPs，0.2μL Taq酶，0.5μL引物P1，0.5μL引物P2，1μL待检菌液，最后加水至总体积达到20μL。PCR温度循环程序如下循环194℃ 3min；循环2～3194℃ 40sec，56℃40sec，72℃ 60sec；循环3272℃ 10min。扩增产物在4℃保存。用2％琼脂糖凝胶(含0.5μg/mL溴化乙锭，EB)电泳检测PCR产物，观察到特异性条带(图2)。对PCR筛选阳性的细菌，挑取单菌落接种于3mL LA培养基中，37℃，200r/m振摇培养16～20h，抽提质粒，再经限制性内切酶消化和序列测定，获得重组质粒命名为pRSETA-1CCK。
2、表达缩胆囊素33肽2串联体(2CCK)的重组质粒的构建在获得表达CCK-33肽重组质粒pRSETA-1CCK的基础上，根据BamH I和Bgl II互为同尾酶的特性，构建cck-33基因的2串联体(2cck)，具体操作如下将重组质粒pRSETA-1CCK用两组酶在37℃进行消化第一组用BamHI和HindIII进行消化，回收较小的片段；第二组用BglII、HindIII和CIAP进行消化，回收较大的片段。接着在T4连接酶的作用之下，连接回收的大片段和小片段。用连接产物转化大肠杆菌DH5α。经Ampr抗性筛选，获得携带2cck的重组子。然后用特异性引物P1/P2对含有CCK-33基因2串联体的重组子进行PCR筛选。PCR方法参照“实施方法1”。对PCR筛选阳性的细菌，挑取单菌落接种于3mL LA培养基中，37℃，200r/m振摇培养16～20h，抽提质粒，再经限制性内切酶消化和序列测定，获得的重组质粒命名为pRSETA-2CCK。
3、表达缩胆囊素33肽4串联体(4CCK)的重组质粒的构建在获得表达缩胆囊素33肽2串联体(2CCK)重组质粒pRSETA-2CCK之后，在pRSETA-2CCK的基础上，根据BamHI和Bg1II互为同尾酶的特性，构建表达CCK33肽4串联体(4CCK)的重组质粒，具体操作如下将重组质粒pRSETA-2CCK用两组酶在37℃进行消化第一组用BamHI和HindIII进行消化，回收较小的片段；第二组用Bg1II、HindIII和CIAP进行酶消化，回收较大的片段。接着在T4连接酶的作用之下，连接回收的大片段和小片段。用连接产物转化大肠杆菌DH5α。经Ampr抗性筛选，获得携带CCK-33基因4串联体(4cck)的重组子。然后用特异性引物P3(5’-GATAAGGATCGATGGGGATCC-3’)/P4(5’-ATGGTACCAGCTGCAGATCT-3’)对含有4cck的重组子进行PCR筛选。PCR方法参照“实施方法1”。电泳检测PCR产物，观察到特异性条带(图2)。对PCR筛选阳性的细菌，挑取单菌落接种于3mL LA培养基中，37℃，200r/m振摇培养16～20h，抽提质粒，再经限制性内切酶消化和序列测定，获得的重组质粒命名为pRSETA-4CCK。
4、表达缩胆囊素33肽6串联体(6CCK)的重组质粒的构建在获得表达缩胆囊素33肽2串联体(2CCK)重组质粒pRSETA-2CCK和表达缩胆囊素33肽4串联体(4CCK)重组质粒pRSETA-4CCK之后，根据BamHI和BglII互为同尾酶的特性，构建表达CC-K33肽6串联体(6CCK)的重组质粒，具体操作如下将重组质粒pRSETA-2CCK用BamHI和HindIII在37℃进行消化，回收较小的片段；将重组质粒pRSETA-4CCK用BglII、HindIII和CIAP进行消化，回收较大的片段。接着在T4连接酶的作用之下，连接回收的大片段和小片段。用连接产物转化大肠杆菌DH5α。经Ampr抗性筛选，获得携带6cck的重组子。然后用特异性引物P3/P4对含有6cck的重组子进行PCR筛选。PCR方法参照“实施方法1”。对PCR筛选阳性的细菌，挑取单菌落接种于3mL LA培养基中，37℃，200r/m振摇培养16～20h，抽提质粒，再经限制性内切酶消化和序列测定，获得的重组质粒命名为pRSETA-6CCK。
5、表达缩胆囊素33肽8串联体(8CCK)的重组质粒的构建在获得表达缩胆囊素33肽2串联体(2CCK)重组质粒pRSETA-2CCK和表达缩胆囊素3 3肽6串联体(6CCK)重组质粒pRSETA-6CCK之后，根据BamH I和BglII互为同尾酶的特性，构建表达CCK-33肽8串联体(8CCK)的重组质粒，具体操作如下将重组质粒pRSETA-2CCK用BamHI和HindIII在37℃进行消化回收较小的片段；将重组质粒pRSETA-6CCK用BglII、HindIII和CIAP进行消化，回收较大的片段。接着在T4连接酶的作用之下，连接回收的大片段和小片段。用连接产物转化大肠杆菌DH5α。经Ampr抗性筛选，获得携带cck-33基因8串联体(8cck)的重组子。然后用特异性引物P3/P4对含有8cck的重组子进行PCR筛选。PCR方法参照“实施方法1”。电泳检测PCR产物，观察到特异性条带(图2)。对PCR筛选阳性的细菌，挑取单菌落接种于3mLLA培养基中，37℃，200r/m振摇培养16～20h，抽提质粒，再经限制性内切酶消化和序列测定，获得的重组质粒命名为pRSETA-8CCK。
6、缩胆囊素33肽4串联体(4CCK)在大肠杆菌中的表达与鉴定首先，将经过测序鉴定的重组质粒pRSETA-4CCK转化E.coLi BL-21(DE3)受体菌，挑取单个重组菌落，接种于3mL LA液体培养基中，37℃振摇培养5h后，用特异性引物P3/P4做PCR鉴定，阳性菌为可表达4CCK的基因工程菌，命名为E-4CCK。
然后，取E-4CCK在LA平板上于37℃划线培养16～20小时。挑取单个菌落在LA液体培养基中于37℃培养12～16h，将菌液置于4℃冰箱保存。按1％比例接种LA液体培养基，37℃，200r/m振摇培养至OD600值达0.5左右时，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，分别在加入I PTG后0、1、2、3、4h取菌液，用SDS-PAGE进行鉴定。用CCK阳性血清对表达的融合蛋白进行Western Blot分析。
SDS-PAGE方法如下将细菌悬液于10000r/m离心1min，取沉淀。加入一定量的双蒸水，重悬细菌。将样品保存在4℃冰箱备用。参照汪家政等(2000)编《蛋白质手册》方法制备SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)。成层胶浓度为5％，分离胶浓度为12％。将待检样品煮沸5min，取10μL加入凝胶点样孔中，在电场作用下进行电泳。电泳缓冲液为Tris-甘氨酸。电压为80v/cm，待溴酚蓝到达成层胶底部时电压升高到160v/cm。待溴酚蓝接近凝胶底部时，停止电泳，取下凝胶，置于1％考马斯亮蓝溶液中染色过夜，用脱色液脱色。电泳结果(图4)表明，4CCK融合蛋白的分子量约为21kD。随着诱导时间的延长，表达产物的量逐步增加，3h后趋于稳定。用VL凝胶成像系统BioID++程序对电泳结果进行扫描分析，结果如下(表1)。
表1 CCK33肽4串联体(4CCK)在细菌总蛋白中的含量(％)
Western Blot分析方法如下SDS-PAGE电泳结束后，不对凝胶进行染色。剪一张与凝胶相同大小的硝酸纤维素膜及两张滤纸，与电泳之后的凝胶一起在室温浸泡在转移缓冲液中15min，按海绵-滤纸-凝胶-硝酸纤维素膜-滤纸-海绵的顺序安装转印夹。将夹中有膜的一侧接正极，并在15V的电压下转移1.5h。转移后的膜用5％脱脂奶粉封闭过夜，弃去封闭液，用TBS洗膜三次。弃去TBS，加入用1％脱脂奶粉1000倍稀释的兔抗CCK-8肽阳性血清(Sigma公司)，温和振摇3h。弃去一抗血清，用TBS洗膜三次，每次约10min。弃去TBS，加入用1％脱脂奶粉50倍稀释的二抗(辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG抗体，华美公司)，温和振摇至少1h。弃去二抗，用TBS洗膜三次，每次约30min。弃去TBS，加入DAB溶液显色，轻摇硝酸纤维素膜，待显色达一定程度，用双蒸水洗膜终止显色反应。在21kD位置可见一特异性条带(图6)。
7缩胆囊素33肽4串联体(4CCK)的纯化将IPTG诱导表达的E-4CCK菌体收集后，于0℃冰浴上进行超声破碎、离心后，沉淀用8mol/L的尿素进行溶解。用50％Ni-NTA纯化树脂在变性条件下进行纯化。具体操作如下将1000mL基因工程菌E-4CCK在IPTG诱导表达4h取样，4℃10000r/m离心2min，收集菌体并保存在-20℃；将保存的细菌菌体沉淀置冰上解冻15min，加20mL Buffer B悬浮细菌，将悬浮液在冰浴条件下置摇床上温和摇动30min，充分变性裂解包涵体，然后在冰浴中进行超声破碎，超声时间为6秒，间隔时间为8秒，功率为400W，破碎次数40次。4℃ 10000r/m离心20min，取上清进行纯化。
往纯化柱中装入20mL的Buffer B，将纯化树脂50％Ni-NTA混匀，取出4mL装柱，待树脂沉淀好后，将纯化柱的开关关闭，用Buffer B平衡纯化柱，约需12h。用Buffer B清洗纯化柱。待Buffer B即将流尽(但不能流干)时将裂解上清2mL缓慢加入到纯化柱中，然后依次用4mLBuffer C、4mL Buffer D、4mL Buffer E过柱洗脱，并分别收集样品。纯化用缓冲液Buffer B、Buffer C、Buffer D、Buffer E必须新鲜配制，其组成如下Buffer B100mmol/L NaH2PO4、10mmol/L Tris HCL、8mol/L尿素，pH8.0；Buffer C100mmol/L NaH2PO4、10mmol/L Tris-HCL、8mol/L尿素，pH6.3；
Buffer D100mmol/L NaH2PO4、10mmol/L Tris-HCL、8mol/L尿素，pH5.9；Buffer E100mmol/L NaH2PO4、10mmol/L Tris-HCL、8mol/L尿素，pH4.5。
将以上样品进行SDS-PAGE分析，可见Buffer E的洗脱物中有较纯的目的蛋白(图7)。
经50％Ni-NTA树脂纯化的蛋白再用透析袋透析。用棉绳将透析袋的一侧系紧，将适量的蛋白纯化溶液装在透析袋内，再将透析袋的另一侧用棉绳系紧；将装有纯化蛋白的透析袋放置在大体积的透析液I中，4℃下在磁力搅拌器上进行搅拌4～5h。依次更换透析液II、III、IV、V、VI、VII、VIII，重复上述操作过程。透析液组成如下透析液I6mol/L尿素、10mmol/L Tris-HCL、0.1mol/L NaH2PO4，pH4.5；透析液II6mol/L尿素、10mmol/L Tris-HCL、0.1mol/L NaH2PO4，pH5.5；透析液III4mol/L尿素、10mmol/L Tris-HCL、0.1mol/L NaH2PO4，pH5.5；透析液IV4mol/L尿素、10mmol/L Tris-HCL、0.1mol/L NaH2PO4，pH6.5；透析液V2mol/L尿素、10mmol/L Tris-HCL、0.1mol/L NaH2PO4，pH6.5；透析液VI2mol/L尿素、10mmol/L Tris-HCL、0.1mol/L NaH2PO4，pH7.5；透析液VII10mmol/L Tris-HCL、0.1mol/L NaH2PO4，pH7.5；透析液VIII10mmol/L Tris-HCL、0.1mol/L NaH2PO4，pH8.5。
最后透析袋放置在大体积的生理盐水中，4℃下在磁力搅拌器上进行搅拌4～5h。透析袋埋在硅胶里进行蛋白浓缩，将浓缩后的蛋白取出放在4℃冰箱保存。将浓缩后的蛋白进行SDS-PAGE检测，电泳图上可见透析后的蛋白只有一条带(图8)。
8、缩胆囊素33肽6串联体(6cck)在大肠杆菌中的表达首先，将经过测序鉴定的重组质粒pRSETA-6CCK转化E.coLi BL-21(DE3)受体菌，挑取单个重组菌落，接种于3mL LA液体培养基中，37℃振摇培养5h后，用特异性引物P3/P4做PCR鉴定，阳性菌为可表达6CCK的基因工程菌，命名为E-6CCK。
然后，取E-6CCK在LA平板上于37℃划线培养16～20小时。挑取单个菌落在LA液体培养基中于37℃培养12～16小时，将菌液置于4℃冰箱保存。按1％比例接种LA液体培养基，37℃，200r/m振摇培养至OD600值达0.5左右时，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，分别在加入IPTG后0、1、2、3h取菌液，用SDS-PAGE进行分析。SDS-PAGE方法参照实施方法6。电泳结果(图5)表明，6CCK融合蛋白的分子量约为27kD。随着诱导时间的延长，表达产物的量逐步增加，3h后趋于稳定。用VL凝胶成像系统BioID++程序对电泳结果进行扫描分析，结果如下(表2)。
表2 CCK33肽6串联体(6CCK)在细菌总蛋白中的含量(％)
10 血清CCK抗体的ELISA检测以纯化的4CCK融合蛋白为抗原，建立检测血清CCK抗体的酶联免疫吸附试验(ELISA)方法。用方阵法，将纯化的4CCK融合蛋白以10 10、1020、10 40、10 80、10 160、10 320、10 640的比例用包被缓冲液稀释，每孔加入100μL 4℃包被过夜。弃去包被液，每孔用200μL清洗缓冲液洗酶标板3次，在纱布上拍干清洗缓冲液后，每孔加入封闭液(5％脱脂奶粉)100μL，37℃封闭2h。弃去封闭液，每孔用200μL清洗缓冲液洗酶标板3次，在纱布上拍干清洗缓冲液，每孔加入以10 10、10 102、10 103、10 104、10 105、10 106的比例用稀释缓冲液稀释的一抗(免抗CCK阳性血清或免疫前的兔阴性血清，其中CCK阳性血清购自华西医科大学)100μL，37℃反应1h。弃去一抗，每孔用200μL清洗缓冲液洗酶标板3次，在纱布上拍干清洗缓冲液后，每孔加入用稀释缓冲液1∶1000稀释的二抗(辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG抗体)100μL，37℃反应1h。弃去二抗，每孔用200μL清洗缓冲液洗酶标板3次，在纱布上拍干清洗缓冲液后，每孔加入显色缓冲液100μL，当达显色高峰时(约10～30min)加入1mol/L H2SO4 100μL终止反应，在酶标仪上读取OD450值。包被抗原4CCK融合蛋白在1∶80倍稀释(4CCK浓度相当于0.2mg/ml)，阳性血清在1∶102时P/N值达最大(表3)，将此时的抗原抗体的浓度确定为最适工作浓度。
表3 抗原(4CCK)与抗体(阳性血清)最佳工作浓度的确定
该方法具有良好的特异性，用该方法检测未免疫的鸡、鼠、兔血清，其P/N均小于2。
11 主动免疫CCK融合蛋白对肉鸡生产性能的影响将纯化的融合蛋白4CCK制成油乳剂疫苗进行肉鸡免疫实验，疫苗中4CCK融合蛋白的含量为1mg/mL。将360只胡须肉鸡饲养至20日龄后随机分成2组，每组三个重复，每个重复60只鸡，1组为对照组，2组为4CCK免疫组。20日龄免疫第一次，以后每隔20天免疫一次，共免疫3次。肉鸡饲养至90日龄结束。实验结束时，称重并统计耗料量，计算全期的平均增重、平均采食量和料肉比。结果表明4CCK免疫组的体增重明显高于对照组(P＜0.05)，采食量也明显高于对照组(P＜0.05)，料肉比也有所下降，但差异不显著(P＞0.05)。
表3 CCK免疫对鸡生产性能的影响体重、采食量和料肉比
12 用4CCK融合蛋白免疫肉鸡后血清CCK抗体的变化将纯化的融合蛋白4CCK制成油乳剂疫苗进行肉鸡免疫实验，疫苗中4CCK融合蛋白的含量为1mg/mL。将360只胡须肉鸡饲养至20日龄后随机分成2组，每组三个重复，每个重复60只鸡，1组为对照组，2组为4CCK免疫组。20日龄免疫第一次，以后每隔20天免疫一次，共免疫3次。肉鸡饲养至90日龄结束。分别在35、55和90天龄时采血，测定血清中CCK抗体。
在96孔酶标板上，每孔加上用0.2mg/ml4CCK融合蛋白100μL，4℃包被过夜。弃去包被液，每孔用200μL清洗缓冲液洗酶标板3次，在纱布上拍干清洗缓冲液后，每孔加入5％脱脂奶粉100μL封闭液，37℃封闭2h。弃去封闭液，每孔用200μL清洗缓冲液洗酶标板3次，在纱布上拍干清洗缓冲液，每孔加入最适稀释浓度的一抗100μL，37℃反应1h。弃去一抗，每孔用200μL清洗缓冲液洗酶标板3次，在纱布上拍干清洗缓冲液后，每孔加入用1∶1000稀释的二抗100μL，37℃反应1h。弃去二抗，每孔用200μL清洗缓冲液洗酶标板3次，在纱布上拍干清洗缓冲液后，每孔加入显色缓冲液100μL，当达显色高峰时(约10～30min)加入1mol/L H2SO4100μL终止反应，在酶标仪上读取OD450值。用P/N表示抗体水平。空白对照组3次检测的结果均为P/N＜2，且三次的结果变化幅度非常小。而免疫组3次检测P/N均超过2，且后两次结果高于第一次(表4)。
表4重组CCK免疫后鸡血中CCK抗体的ELISA检测结果(P/N)
SEQUENCE LISTING<110>华南农业大学<120>缩胆囊素活性片段的串联表达及其应用<130>15<160>2<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>99<212>DNA<213>缩胆囊素-33(Cholecystokinin-33，CCK-33)<220>
<221>cDNA seqence<222>(1)..(99)<220>
<221>CDS<222>(1)..(99)<400>1ggt tct act ggc cgc ttc tct gtc ctt ggc aac cgt gta cag agc att48Gly Ser Thr Gly Arg Phe Ser Val Leu Gly Asn Arg Val Gln Ser Ile1 5 10 15gat ccg acg cac cgt att aat gac cgt gac tac atg ggc tgg atg gat96Asp Pro Thr His Arg Ile Asn Asp Arg Asp Tyr Met Gly Trp Met Asp20 25 30ttt99Phe<210>2<211>33<212>PRT<213>缩胆囊素-33(Cholecystokinin-33，CCK-33)
<400>2Gly Ser Thr Gly Arg Phe Ser Val Leu Gly Asn Arg Val Gln Ser Ile1 5 10 15Asp Pro Thr His Arg Ile Asn Asp Arg Asp Tyr Met Gly Trp Met Asp20 25 30Phe
权利要求
1.一种编码缩胆囊素活性片段的核苷酸序列，其特征在于它由两个或以上的具有SEQ ID NO1的序列，或与其相比有一个或若干个核苷酸的差别，包括碱基的改变、缺失、添加或插入，但具有同样活性的序列头尾串联而成。
2.重组表达载体，含有权利要求1所述序列。
3.宿主细胞或转化体，含有权利要求2所述的重组表达载体。
4.一种缩胆囊素多肽，其特征在于它由两个或以上的具有SEQ ID NO2的序列，或与其相比有一个或若干个氨基酸残基的差别，包括氨基酸残基的改变、缺失、添加或插入，但具有同样活性的序列头尾串联而成。
5.获得权利要求4所述多肽的方法，包括a.构建权利要求2所述重组表达载体；b.将重组表达载体转化大肠杆菌表达；c.分离纯化表达产物。
6.基因工程疫苗，含有权利要求4所述多肽。
7.权利要求4所述多肽在制备缩胆囊素抗体中的应用。
8.权利要求4所述多肽在体外检测血清中缩胆囊素抗体水平中的应用。
9.一种促进动物采食，提高生产性能的方法，包括将权利要求4所述多肽直接免疫或将其与佐剂同时免疫该动物。
全文摘要
本发明提供了一个获得缩胆囊素活性片段多串联体的方法，包括表达缩胆囊素基因的重组质粒的构建、缩胆囊素基因在大肠杆菌中的表达和缩胆囊素基因工程产物的纯化。表达缩胆囊素基因的重组质粒具有鸡缩胆囊素33基因或其多串联体的核苷酸序列，缩胆囊素基因工程产物具有鸡缩胆囊素33肽或其多串联体的氨基酸残基序列。本发明进一步涉及重组重组缩胆囊素多肽对动物的主动免疫技术及其应用。
文档编号C12N15/12GK1687412SQ20051001158
公开日2005年10月26日 申请日期2005年4月15日 优先权日2005年4月15日
发明者曹永长, 覃健萍, 毕英佐, 舒鼎铭, 马静云, 谢青梅 申请人:华南农业大学