专利名称：一种环亚胺水解酶基因及其表达蛋白的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体属于来源于假单胞杆菌的一种环亚胺水解酶的编码基因，以及重组酶的表达和应用。
背景技术：
环亚胺水解酶(cyclic imide hydrolase，EC.3.5.2.16)是环酰胺酶类(EC.3.5.2)(包括海因酶、二氢嘧啶酶，二氢乳清酸酶、尿囊素酶等)中的一种，由于其在生物体内的代谢功能不明确，研究较少，但广泛存在各类生物体。过去一般将环亚胺水解酶和海因酶，二氢脲嘧啶酶混为一谈。随着研究的深入，现在已经明确环亚胺水解酶和上述酶有着较明显的不同(1)作用底物不同海因酶等作用底物为海因等环酰胺类，少量的海因酶也可作用于复杂的环亚胺，而环亚胺水解酶尽管也可以海因和二氢尿嘧啶作为底物，但它水解简单的环亚胺底物诸如琥珀酰亚胺、马来酰亚胺以及含巯基的环亚胺，却是前者不具有的(见附图1)。(2)分子量不同环亚胺水解酶和海因酶等环酰胺酶均属金属依赖性酶，但环亚胺水解酶分子量在30kD左右，天然蛋白为三聚体，而后者分子量均在50kD～60kD，一般为二聚体或四聚体。(3)保守活性位点不同海因酶一级结构序列同源性比较，酶活性的保守残基均是和金属结合的四个组氨酸，一个天冬氨酸；但环亚胺水解酶在一级结构序列和上述任一类环酰胺水解酶无任何同源性。(4)保守结构域不同海因酶等在保守结构域均属酰胺酶(Amidase)，但已知蛋白质序列的环亚胺水解酶保守结构域却不属该结构域。(5)空间结构不同海因酶等的空间结构类似Triosephosphate isomerase的TIM桶，而后者预测空间结构在数据库比对未发现类似结构。
Ogawa J等在1997年研究Blasterbacter sp.A17-4中首先发现和分离纯化了环亚胺水解酶并对该酶的理化性质进行了研究。Soong等对232种细菌，250种酵母和118种霉菌的调查揭示在细菌中水解环酰胺和水解环亚胺的两种活性不一定在同一个菌体存在；在细菌中假单胞杆菌对水解环亚胺和环酰脲均有较高活性，但在节杆菌属、农杆菌属、短杆菌属有较高的水解环亚胺活性，而环酰脲的活性很低；酵母和霉菌中环亚胺水解酶的活性都很低。在微生物中，环亚胺水解酶和半酰胺酶(half-amidase)共同参与简单环亚胺的代谢，其中环亚胺水解酶为第一个催化环亚胺水解形成半酰胺，后者再在半酰胺酶的作用下形成二羧酸，参与类似TCA的循环反应。由于大多的农药和药物中间体均是亚胺类化合物，环亚胺水解酶可能在药物中间体的制备，异生物质的体内降解中发挥作用。
国内外有关海因酶的研究报道较多，但环亚胺水解酶研究很少，除Ogawa J等报道外，第二例来自王宇等2002年从真氧产碱杆菌112R4中克隆到一种环亚胺水解酶基因(王宇等，微生物学报，2002，42.153～162)。但该酶在氨基酸序列同源性，作用底物范围，催化效率上均与本发明的环亚胺水解酶有明显差异，后续重组酶的研究未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种环亚胺水解酶及其编码基因，获得作用底物广泛、活力较高的重组酶，并且这种重组环亚胺水解酶可在制备单一构型N-氨甲酰-氨基酸或酰胺酸中应用。
本发明提供的环亚胺水解酶，来源于假单胞杆菌，是序列表中SEQ ID NO1的氨基酸残基序列或将SEQ ID NO1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的替代或添加且具有与SEQ ID NO1相同活性的由SEQ ID NO1衍生的蛋白质。
序列表中SEQ ID NO1的氨基酸残基序列是由293个氨基酸残基组成的蛋白质。
本发明所提供的环亚胺水解酶的编码基因，是下列核苷酸序列之一(1)序列表中SEQ ID NO2的DNA序列，由879个碱基组成；(2)编码序列表中SEQ ID NO1蛋白质序列的多核苷酸序列。
含本发明基因的表达载体及细胞体系均属于本发明的保护范围。
本发明重组环亚胺水解酶蛋白可以通过以下方法获得培养含有环亚胺水解酶表达载体的宿主菌pEI/E.coli BL21，在所规定的蛋白质表达条件下，获得表达产物环亚胺水解酶，然后从宿主细胞中提取并纯化该酶。
本发明的环亚胺水解酶及其编码基因可在制备单一构型N-氨甲酰-氨基酸以及制备酰胺酸中应用。
所述的单一构型N-氨甲酰-氨基酸，可以是海因酸；所述的酰胺酸可以是琥珀酰胺酸或马来酰胺酸。
本发明从一株假单胞杆菌中成功地克隆到一新的环亚胺水解酶基因并进行了表达，重组酶的制备和底物转化等研究，本发明涉及的环亚胺水解酶氨基酸序列和海因酶等环酰胺酶的同源性低于10％。从文献报道和网上资源搜索，环亚胺水解酶的蛋白和基因研究共报道2例，完整序列只有来自真氧产碱杆菌一例，本发明的酰亚胺水解酶和真氧产碱杆菌112R4来源的序列比对同源性为78％(见附图2)，作用底物较前者更广泛，而且活力较高。
图1二氢嘧啶(A)、海因类化合物(B)和环亚胺(C)三类底物的酶法水解反应。其中1.二氢脲嘧啶酶；2.β-脲基丙酸酶；3.海因酶；4.N-氨甲酰氨基酸水解酶；5.环亚胺酶；6.半酰胺酶。
图2环亚胺水解酶与数据库中已知序列环亚胺水解酶(AF373287)的比对。
图3环亚胺水解酶纯化结果图。其中泳道1为含空质粒的E.coliBL21全菌体蛋白；泳道2为含重组子pEI/E.coliBL21全菌体蛋白；泳道3超声后的上清；泳道4经镍亲和柱洗脱的目的蛋白；泳道5经Sephacryl S-200柱洗脱的目的蛋白。
图4所得产物在不同反应条件下HPLC分析。反应条件12μg酶，底物琥珀酰亚胺浓度为20mmol/L，反应体系为200uL，37℃反应。
具体实施例方式
实施例1环亚胺水解酶的克隆及一级结构特征本发明人从假单胞杆菌YZ-26(石亚伟等，Chemical Research of Chinese University，2005)中用CTAB法提取基因组DNA，然后用EcoRI酶切基因组DNA，用胶回收试剂盒从0.8％的agarose胶上分部回收2-9kb的EcoRI酶切片段，将回收的酶切片段连接在经相同酶切处理的pUC18载体上(大连宝生物公司)，转入E.coilJM109中，在涂有X-gal和IPTG的平板上进行蓝白初筛。
将含有插入片段的重组白色单菌落，分别挑入每孔含50μl YCG培养基(0.5％酵母粉，0.5％蛋白胨，0.5％甘油，0.2％磷酸氢二钾和0.1％海因pH7.0)，37℃过夜培养后，加入50μl的50mmol/L二氢脲嘧啶作为底物，37℃振荡30min，分别加入50μl 5％的对二甲氨基苯甲醛，进行显色反应。
通过微孔板复筛较高活性的重组子，并抽提质粒，然后进行DNA序列测定，结果显示阳性重组子pUS804中含有插入片段为2787bp，在其中只有位于1301～2118bp间有一个完整的读框，为879bp(SEQ ID NO2).G+C含量为60.66％，编码293aa，其计算分子量为33.711kD.将该DNA序列在BlastX程序进行对比和保守结构域搜索，和已知水解海因的酶诸如海因酶，尿囊素酶，二氢嘧啶酶等(含有环酰胺酶结构域)是完全不同的，目前只和真氧产碱杆菌(Alcaligenes eutrophus 112R4)酰亚氨酶有78％的同源性(王宇等，微生物学报，2002，42.153～162)，与芽生杆菌(Blastobacter sp.)A17-P-4酰亚氨酶(只报道N末端的20氨基酸)氨基端20个氨基酸有80％的同源性(Ogawa J et al Eur JBiochem 1997，243(1-2)322～327)，因此，本发明的环亚胺水解酶基因序列不同于现有文献报道的类似酶的序列，它是一个新基因。
实施2.环亚胺水解酶基因重组子构建根据测序结果，按该蛋白质编码基因的两末端序列设计正向引物，CGGAA TTCATGGCCAAGGAAATC和反向引物CCG AAG CCT TCA CTT CTT GCG CGG，以pUS804重组子为DNA模板，按如下PCR程序进行扩增.94℃变性1min，50℃复性1min，72℃延伸1min，扩增反应进行25个循环。PCR扩增产物经EcoRI/HindIII双酶切连接到经相同酶切后的载体pET32a(Novagen公司)构建含硫氧还蛋白表达载体pETI。然后利用载体上的硫氧还蛋白编码区两侧的NdeI酶的位点，将硫氧还蛋白读框从融合蛋白中切除，构建成pEI重组子。每一步获得的重组子经PCR检测，质粒抽提和酶切分析，最终再经DNA序列分析确定。
实施例3重组环亚胺水解酶的表达与制备将实施例2中获得重组子pEI(环亚胺水解酶的基因的N末端融合了一段六个组氨酸的亲合臂利于蛋白质的纯化)，转化经Cacl2法致敏的Ecoli.BL21(DE3)的感受态细胞获得pEI/Ecoli.BL21(DE3)工程菌。
从LB平板上挑取单菌落接于5ml(含100μg/ml Amp)液体培养基中，37℃培养10～12hr，取上述预培养菌以1％接种量转接于新鲜的Amp(100μg/ml)的LB培养基，37℃培养至OD达到0.600左右，加终浓度0.3mmol/L IPTG，37℃再诱导培养4hr后，4℃，5000rpm离心，收集菌体。菌体用50mmol/L Tris-HCl，500mmol/L NaCl，pH8.0缓冲液悬浮，在冰浴中用超声波破碎细胞，然后15000rpm，4℃离心30min去除细胞碎片等不溶物质。将离心上清上样于Ni2+-NTA亲和柱，经含50mmol/L咪唑的相同缓冲液洗去大部分杂蛋白，最后用20ml含100mmol/L EDTA洗脱目的蛋白。将洗脱的目的蛋白用Amico超滤器PM30膜浓缩至5ml。上样于Sephacryl S-200凝胶层析柱(LKB层析系统)。经洗脱的活性峰合并，获得SDS-PAGE电泳纯的环亚胺水解酶(见附图3)，比活力为35.8U/mg(海因作底物)。
实施例4重组环亚胺水解酶的应用1.N-氨甲酰氨基酸的制备N-氨甲酰氨基酸是单一构型氨基酸，特别在D-型或L型氨基酸生产中的关键中间产物，它的生产一般通过化学法或酶法，目前多采用酶法生产，常用的酶主要是海因酶，本发明提到的环亚胺酶也可水解海因等底物，活力可达35.8U/mg(海因作底物)。整个反应通过水解海因等底物的酰胺键，开环生成N-氨甲酰氨基酸。
酶反应体系组成底物2％海因或二氢尿嘧啶反应温度37℃缓冲液50mmol/L Tris.HCl pH8.0缓冲液酶液或菌体适量反应液总体积为1.5ml，经30min保温后，加入0.25ml的三氯乙酸终止反应，0.25ml，10％对二甲氨基苯甲醛(DMBA)溶液显色，然后加入1.0ml H2O补足3.0ml体积，在430nm下进行比色。用已知浓度的N-氨甲酰丙氨酸为标准产物，在相同体系情况下，绘制标准曲线，求出K值，根据公式，计算酶活性。
酶的转化率1％海因(20μmole)，酶量为300ug，37℃反应1hr，在上述条件下，底物转化率约85％。
2.酰胺酸的制备酰亚胺是生物体代谢中重要的中间物，特别是嘧啶类的代谢，环亚胺水解酶可以催化水解环亚胺生成酰胺酸(单亚胺二羧酸)，在有机酸和药物中间体的生产中有很好的前景。
酶反应体系组成底物20mmol/L琥珀酰亚胺或马来酰亚胺反应温度37℃缓冲液50mmol/L Tris.HCl pH8.0缓冲液酶液适量将反应混合液在沸水中加热5min，13000rpm离心5min后，上清液进行HPLC测定，层析柱SymmetryC18(4.6mm×150mm，5μm)；流动相为磷酸缓冲液(20mmol/L pH6.5)甲醇(95∶5)，马来酰胺酸在255nm下检测；琥珀酰胺酸在210nm下检测。
酶的转化率在上述酶反应的条件下，酶量为12μg(5U/mg)，底物琥珀酰亚胺浓度为20mmol/L，反应体系为200uL，37℃反应30min后，转化率98％(见附图4)。底物为马来酰亚胺时，在上述条件下，转化率95％。
序列表<110>山西大学<120>一种环亚胺水解酶基因及其表达蛋白的应用<140>申请号为<141>2005-4-18<160>2<210>1<211>293<212>PRT<213>恶臭假单胞杆菌YZ-26(Pseudomonas putida YZ-26)<220>
<222>(1)..(293)<400>1Met Ala Lys Glu Ile Leu Cys Ser Phe Gly Ile Asp Val Asp Ala1 5 10 15Val Ala Gly Trp Leu Gly Ser Tyr Gly Gly Glu Asp Ser Pro Asp20 25 30Asp Ile Ser Arg Gly Leu Phe Ala Gly Glu Val Gly Ser Pro Arg35 40 45Leu Leu Lys Leu Phe Glu Arg Phe Gly Ile Lys Thr Thr Trp Phe50 55 60Ile Pro Gly His Ser Ile Glu Thr Phe Pro Glu Gln Met Gln Ala65 70 75Val Ala Asp Ala Gly His Glu Ile Gly Ile His Gly Tyr Thr His80 85 90Glu Asn Pro Ile Ala Met Thr Arg Glu Gln Glu Thr Ala Val Leu95 100 105Asp Lys Cys Ile Asp Leu Val Thr Lys Leu Ser Gly Lys Arg Pro110 115 120Thr Gly Tyr Val Ala Pro Trp Trp Glu Phe Ser Asn Val Thr Asn125 130 135Glu Leu Leu Leu Glu Arg Gly Ile Lys Tyr Asp His Ser Leu Met140 145 150His Asn Asp Phe Thr Pro Tyr Tyr Val Arg Val Gly Asp Lys Trp155 160 165
Thr Lys Ile Asp Tyr Ser Lys Lys Pro Ser Asp Trp Met Val Pro170 175 180Leu Thr Arg Gly Lys Glu Thr Asp Leu Ile Glu Ile Pro Ala Ser185 190 195Trp Tyr Leu Asp Asp Leu Pro Pro Met Met phe Ile Lys Lys Ser200 205 210Pro Asn Ser His Gly Phe Val Asn Pro His Asp Ile Glu Gln Ile215 220 225Trp Arg Asp Gln Phe Asp Trp Val Tyr Arg Glu Met Asp Tyr Ala230 235 240Val Phe Pro Ile Thr Ile His Pro Asp Val Ala Gly Arg Pro Gln245 250 255Val Leu Met Met Leu Glu Arg Leu Tyr Ala His Met Ile Lys His260 265 270Pro Gly Val Lys Phe Val Thr Met Asn Glu Ile Ala Asp Asp Phe275 280 285Ala Lys Arg Phe Pro Arg Lys Lys290<210>2<211>882<212>DNA<213>恶臭假单胞杆菌YZ-26(Pseudomonas putida YZ-26)<220>
<222>(1)..(882)<400>2atggccaagg aaatcctctg cagcttcggc atcgacgtcg atgcggtcgc cggctggctc 60ggatcctatg ggggcgagga ttcgcctgac gatatctcgc gcggcctttt cgccggcgag 120gtcggcagcc cgcgcctcct gaagctgttc gaacgcttcg gaatcaagac cacctggttc 180attcccggcc actcgatcga gaccttcccg gaacagatgc aggcggttgc cgatgccggc 240cacgagatcg gcattcacgg ctacacccat gaaaacccga tcgccatgac gcgcgagcag 300gagaccgcgg tcctcgacaa gtgcatcgac ctcgtcacca agctctcggg caagcgcccg 360accggctatg tcgcgccgtg gtgggagttt tccaacgtca ccaacgagct gctgctggaa 420cgcggcatca agtacgacca ctccctgatg cacaacgact tcacgcccta ttatgtgcgc 480gtcggcgaca agtggaccaa gatcgactac tccaagaagc cgtccgactg gatggtgccg 540ctcacgcgcg gcaaggaaac cgatctcatc gaaatcccgg cctcctggta cctcgacgac 600ctgccgccga tgatgttcat caagaagtcg ccaaacagcc acggcttcgt caatccgcat 660gacatcgagc agatctggcg cgaccagttc gattgggtct accgcgagat ggactatgcg 720gtgtttccga ttaccatcca tcccgatgtt gccgggcgcc cgcaggtgct gatgatgctg 780gagcggctct atgcccacat gatcaagcat cccggcgtga agttcgtgac gatgaacgag 840atcgccgacg actttgccaa gcgcttcccg cgcaagaagt ga
权利要求
1.一种环亚胺水解酶，特征在于，它具有序列表中SEQ ID NO 1氨基酸残基序列。
2.一种环亚胺水解酶的编码基因，它是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID NO 2；2)编码序列表中的SEQ ID NO 1蛋白质序列的多核苷酸序列。
3.据权利要求2所述基因，其特征在于，所述环亚胺水解酶的编码基因是序列表的SEQID NO 2。
4.含有权利要求3所述基因的表达载体。
5.含有权利要求3所述基因的细胞体系。
6.权利要求5所述的细胞体系为原核细胞系统。
7.权利要求1所述的重组环亚胺水解酶在制备单一构型N-氨甲酰-氨基酸或酰胺酸中的应用。
8.权利要求7所述的单一构型N-氨甲酰-氨基酸是海因酸。
9.权利要求7所述的酰胺酸是马来酰胺酸或琥珀酰胺酸。
全文摘要
本发明公开了一种环亚胺水解酶基因序列及其表达蛋白的制备与应用。本发明所提供的来源于假单胞杆菌的环亚胺水解酶是序列表中SEQ ID NO1的氨基酸残基序列或将SEQ ID NO1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的替代，缺失或添加具有与SEQ ID NO1相同活性的由SEQ ID NO1衍生的蛋白质。本发明将来源于假单胞杆菌环亚胺水解酶基因克隆并表达制备重组酶，可用于生物法生产N－氨甲酰－氨基酸以及酰胺酸等。
文档编号C12P13/00GK1715404SQ20051001255
公开日2006年1月4日 申请日期2005年5月25日 优先权日2005年5月25日
发明者石亚伟, 袁静明, 崔丽芳, 钮利喜 申请人:山西大学