专利名称：一种编码植物多功能活性和广谱抗性细胞信号因子的hrpN基因及其表达产物与应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物基因工程领域，涉及一种编码植物多功能活性和广谱抗性细胞信号因子的hrpN基因及其表达产物，以及该基因与其表达产物在改良植物品质等方面的应用。
背景技术：
微生物蛋白农药是对多种农作物具有很强生物活性的一类蛋白质药物。按作用机理不同又可分为传统微生物蛋白农药和新型微生物蛋白农药。传统微生物蛋白农药主要是来自苏云金芽孢杆菌(Bt)的杀虫晶体蛋白(ICP)，新型微生物蛋白农药主要是蛋白激发子类物质，它与传统微生物蛋白农药最大的区别在于其不直接杀灭害虫和病原物，而是激发植物自身的抗病防虫基因的表达，并促进植物生长发育。目前研究报道的具有代表性的新型微生物蛋白农药主要有过敏蛋白(Harpin)、隐地蛋白(Cryptogein)和激活蛋白(Activator)等，其中最受关注、最有应用前景的是Harpin类蛋白激发子。
Harpin蛋白主要是由欧文氏杆菌属(Erwinia)细菌产生的一类能激发植物过敏反应的蛋白质(30-40kda)，可诱导植物体内一系列基因的表达，激活植物自身的生长系统和防卫系统，从而使植物能抵御多种病害的侵染和逆境的胁迫，并获得促进生长发育和提高增产的效果。1992年，美国康乃尔大学的韦忠民等首先从梨火疫欧文氏杆菌(E.amylovora)中克隆出这类过敏蛋白基因，并首次提出Harpin蛋白诱导植物的过敏反应可能与其抗病性作用有关，由此推动了新型微生物蛋白农药研究的兴起。经过约10年的努力，以此为背景的美国Eden生物科技公司成功开发和研制出具有广谱抗病防虫功能的新型微生物蛋白农药Messenger，该产品以其对大田作物和经济作物抗病增产方面良好的效果以及对绿色无公害农业卓越的贡献，曾两度获美国环境保护委员会颁发的总统绿色化学挑战奖。
现代分子植物病理学揭示，植物病原细菌既有其致病性，也有诱导植物产生抗病性和促进生长的能力，而决定这种能力的基因是植物病原细菌的hrp(hypersensitive response and pathogenicity)基因簇。hrp基因决定着植物病原细菌在非寄主植物上激发过敏反应(hypersensitive response on non-host plants，HR)的能力和在寄主植物上的基本寄生性或致病性(parasitism or pathogenicity onhost plants)。HR是植物一种局部的、快速的细胞编程死亡形式，是植物主动抗性的结果，其抗性作用不仅表现在对病原细菌侵染扩展的限制，而且能进一步诱导植物体内产生类似免疫机制的系统获得性抗性反应。
继韦忠民等(Wei ZM，et al.Science，1992，257(5066)85-88)成功克隆和表达hrpNEa基因之后，近10多年来人们又相继从E.carotovora subsp carotovora、E.chrysanthemi、P.s.syringae、P.s.pv.glycinea、P.s.tomato、R.solanacearum中克隆到编码Harpin类蛋白的基因，并成功表达了这些蛋白，如HarpinEcc，36kda(Mukherjee A.，Mol.Plant-Microbe Interact.1997，10462-471.)；HarpinEch，36kda(Bauer D.W.，Mol.Plant Microbe Interact，1995，8484-491)；HarpinPss，34.7kda；HarpinPsg，35.3kda；HarpinPst，36.5kda(Preston G，Mol Plant-Microbe Interact.，1995，8717)；HarpinXoo，15.3kda，HarpinXooc，15.6kda(闻伟刚，植物病理学，2001，31(4)295-300)等。
迄今为止，所有这些Harpin类蛋白差不多都具有以下分子特征(1)亲水性；(2)对热稳定，100℃处理10分钟不会失活；(3)对蛋白酶K和紫外线敏感；(4)富含甘氨酸而缺少半胱氨酸；(5)水溶性酸性蛋白；(6)无四级结构。
最近的研究表明，Harpin类蛋白可能在植物的信号通路中起着重要作用。研究人员用Harpin处理拟南芥，发现拟南芥中Cl、Ca、K、H、Cu、Zn离子通道以及各种氧化酶被激活，这些氧化酶包括ACC合成酶、抗坏血酸氧化酶、Cu/Zn超氧化物歧化酶、Cu分子伴侣前体等等。现在通常认为，植物细胞壁中广泛存在Harpin蛋白的受体，即Harpin结合蛋白(Harpin-binding proteins，HrBP)，Harpin可以通过与这些受体蛋白HrBP结合激活植物中的多条信号通路。这些信号通路大致可以分为以下三类(1)与植物抗病和驱虫相关的信号通路的激活，包括过敏反应与细胞死亡、离子交换通道、水杨酸途径、茉莉酸途径、苯丙氨酸解氨酶介导的途径以及其它一些抗性基因介导的途径；(2)与促进植物生长相关的信号通路的激活，包括一般的生长调节因子、胚轴延伸转录因子、生长转录因子、乙烯反应元件结合蛋白系以及蔗糖合成酶和其他胚胎形成酶等；(3)与植物抗逆相关的信号通路的激活，包括热休克蛋白、COR基因和耐盐锌蛋白等。另外可能还存在一条比较特殊的不依赖于NPR1介导的植物对细菌抗性的信号通路。
Harpin蛋白虽然来源于病原菌，但作为一类非特异性的激发蛋白因子，却能引起非寄主植物发生过敏反应，并诱导其抗病性、驱虫性和抗逆性的增加，以及促进生长发育、提高产量等。更有趣的是，在转hrpNEa基因的梨上，HarpinEa对产生梨火疫病的宿主寄生菌E.amylovora也表现出非常强的抗性。
发明内容
本发明的目的是提供一种编码植物多功能活性和广谱抗性细胞信号因子的hrpN基因及其表达产物，以及hrpN基因和其表达产物的应用。
本发明所提供的一种编码植物多功能活性和广谱抗性细胞信号因子的hrpN基因，名称为hrpNCSSY002，其基因编码区共计有1071个核苷酸，其核苷酸序列如SEQ ID No.1，该基因来自胡萝卜软腐欧氏杆菌(Erwinia carotovora subsp.carotovora)CSSY002菌株，胡萝卜、白菜、芹菜等是该杆菌的寄主植物，该基因以hrpN基因簇形式存在于CSSY002菌株的染色体DNA上。该基因可用于促进植物生长发育；增强植物的广谱抗病性，包括对多种细菌、真菌和病毒的抗性；增强植物的驱虫性；增强植物的抗逆性(植物对干旱、严寒、盐碱等不良环境的耐受性)；延长作物产品的储存时间；对盆花、苗木的塑型作用。另外该基因还可以作为基因资源，在调节植物生长发育和防治病虫害有关的农业生物技术育种、转基因植物以及与其它有益基因重组构建具有商业价值的遗传重组体等方面有广泛应用前景。含有该基因的遗传重组体，亦可应用于调节植物生长发育和防治病虫害有关的农业生物技术育种、转基因植物等方面。
一种编码植物多功能活性和广谱抗性细胞信号因子的基因hrpNCSSY002所编码的蛋白HarpinCSSY002，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2，共有356个氨基酸残基，36.64kda，等电点pI5.9，富含甘氨酸(Gly)而缺乏半胱氨酸(Cys)，是水溶性酸性蛋白，无四级结构，并且具有Harpin类蛋白的基本分子属性和生物学活性。
HarpinCSSY002蛋白质在促进植物生长发育、增强植物的广谱抗病性(包括对多种细菌、真菌和病毒的抗性)、增强植物的驱虫性、增强植物的抗逆性(植物对干旱、严寒、盐碱等不良环境的耐受性)、延长作物产品的储存时间、对盆花和苗木的塑型作用方面有广泛应用前景。因此，该蛋白质可以配制成生物制品，应用到以上方面。
本发明关于一种编码植物多功能活性和广谱抗性细胞信号因子的基因hrpNCSSY002及其表达产物HarpinCSSY002蛋白质，将按以下内容进行具体表述1、hrpNCSSY002基因的来源 hrpNCSSY002基因来自基因来自胡萝卜软腐欧氏杆菌(Erwinia carotovora subsp.carotovora)CSSY002菌株，胡萝卜、白菜、芹菜是其寄主植物。该基因以hrpN基因簇形式存在于CSSY002菌株的染色体DNA上。
2、hrpNCSSY002基因的克隆和测序 (1)菌株首先在LB平板上筛选，并进行胞外蛋白酶活性和HR检测。(2)将选取的单克隆菌落，于28℃下在LB液体培养基中振荡培养12小时，离心收集菌体，用基因组DNA分离试剂盒分离、纯化细菌染色体DNA。(3)细菌染色体DNA经Sau3A部分消化，用质粒载体pLARF5构建胡萝卜软腐欧氏杆菌(Erwinia carotovora subsp.carotovora)CSSY002菌株的基因组文库。用胡萝卜软腐欧氏杆菌(Erwinia carotovora subsp.carotovora)ECC71菌株的hrpNEcc基因(Wei ZM，et al.Science，1992，257(5066)85-88)作分子探针，通过克隆杂交从CSSY002基因组文库中筛选鉴别hrpN+质粒，获得包括hrpN基因整个编码区在内的1.9kb DNAs片段，并进一步将此片段亚克隆进pBluescript载体中。(5)用通用引物T7进行核苷酸序列测定，其中有一个1071bp的阅读框(reading frame)即为hrpNCSSY002基因的编码区，序列如SEQ ID No.1。
3、hrpNCSSY002基因的PCR扩增与纯化 根据hrpNCSSY002基因的核苷酸序列，设计一对PCR扩增引物，即P15’-TGTGGATCCATGCTTAATTCTCTTGGTGGCGGAG-3’和P25’-TGTAAGCTTTAGCTGGAGAGCTTCTTCAACCC-3’。其中G/GATCC为引入的限制酶BamH I的酶切位点，A/AGCTT为引入的限制酶HindIII的酶切位点。用纯化的CSSY002菌株的染色体DNA作模板，按如下扩增参数进行PCR反应先95℃预变性5min，然后94℃/2min 1个循环；94℃/15sec+55℃/30sec+72℃/15sec 24个循环；94℃/1min+55℃/2min+72℃/3min1个循环。扩增产物用PCR产物纯化试剂盒进行纯化。
4、hrpNCSSY002基因工程菌株的构建 hrpNCSSY002基因的PCR扩增产物经限制酶BamH I和HindIII消化后，克隆进高表达载体pET28a(+)的BamH I-HindIII位点。用pET28a(+)-hrpNCSSY002质粒转化受体菌E.coli JM109(DE3)，通过选择压筛选出含有pET28a(+)-hrpNCSSY002质粒的阳性表达工程菌株。
5、hrpNCSSY002基因的表达产物及其检测 hrpNCSSY002基因的表达产物为HarpinCSSY002蛋白质。将含有hrpNCSSY002基因超表达质粒pET28a(+)-hrpNCSSY002的大肠杆菌工程菌株E.coli JM109(DE3)在加有50ml/L Km的LB液体培养基中37℃培养生长，待OD600达到0.7(即细菌进入对数生长期)后，再加入诱导剂IPTG至终浓度1mM，继续培养6个小时后，离心收集细菌细胞。细菌细胞经超声波破碎、离心、12％SDS-PAGE凝胶电泳，在电泳胶板的细菌样品泳道上，会呈现一条显著宽而浓的35.55kda条带，它就是hrpNCSSY002基因的表达产物HarpinCSSY002蛋白质，约占细菌蛋白总量的50％左右。将HarpinCSSY002蛋白质进一步分离纯化，并对HarpinCSSY002蛋白质进行Western blot分析和HR检测。
根据hrpNCSSY002基因的核苷酸序列推测，HarpinCSSY002蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID.No2。该蛋白质具有以下属性(1)由356个氨基酸残基组成；(2)分子量36.64kda；(3)等电点pI5.9；(4)富含甘氨酸Gly，缺乏半胱氨酸Cys；(5)对温度特稳定，在100℃沸水中耐受10-15分钟仍有活性；(6)没有四级结构。
6、HarpinCSSY002蛋白质的生物学活性及其应用 目前公认的Harpin类蛋白的生物活性检测方法主要有(1)过敏反应(hypersensitive response，HR)，通常以烟草作被试植物，这也是Harpin类蛋白生物活性检测最快速、简便的方法；(2)血清学反应，即用标准的Harpin蛋白纯品制成血清抗体，然后用这种抗血清对未知样品进行Western blot分析，通过抗体-抗原识别反应，可以准确检测出未知样品中的Harpin类蛋白。
HarpinCSSY002蛋白质具有以下主要生物学功能(1)促进植物生长发育、提高产量；(2)增强植物的广谱抗病性，包括对多种细菌、真菌和病毒的抗性；(3)使植物获得对某些有害昆虫的驱虫性；(4)增强植物的抗逆性；(5)延长植物产品的储存时间；(6)对盆花、苗木有良好的塑型作用。
HarpinCSSY002蛋白质在增强植物抗病、驱虫、抗逆以及促进生长和提高产量方面的良好效果。HarpinCSSY002蛋白质不会引起病原物的抗药性，也不会诱发植物遗传结构(基因组DNA)的改变，且该蛋白质属天然有机蛋白质，在自然界能很快被光分解或被微生物降解、没有残留公害，对人畜鸟鱼无毒性，在使用过程中无须特殊防护措施，是未来替代高毒、高残留化学农药和化学调节剂的理想的环保型生物产品。
目前正在就其对各种作物、蔬菜、水果、花卉以及各种经济植物包括烟草、茶叶等数十种植物的抗病驱虫和促长增产效果进行广泛的试验和品比。已有试验结果显示，HarpinCSSY002蛋白对黄瓜、西红柿、土豆、辣椒、烟草、玉米、草莓等的抗病驱虫和促长增产效果明显，同时对提高某些植物如烟草、茶叶的品质亦有很好的效果，而且在同类Harpin产品中对比效果也很显著。HarpinCSSY002蛋白可直接应用于植物的生长发育调节和病虫害防治，包括粮食作物、经济植物、蔬菜、水果、花卉以及园林和草场的养护等；使用方法有浸种、拌种、蘸根、种子包衣、植株注射、叶面喷施、花果喷涂等；使用剂量因使用方法和品种而异，一般5μg/ml-80μg/ml均为有效浓度；施用后2-12小时内即发生作用，药效可持续20天左右，一个生长季节可用药2-3次。
本发明中所使用的工程菌E.coli JM109(DE3)菌株及hrpNCSSY002基因的高效表达载体pET28a(+)质粒在国内外分子生物学研究及医药工业中已广泛应用，对环境安全可靠。
本发明中使用的缩略语LB(细菌培养基，酵母粉5g/L+蛋白胨10g/L+NaCl10g/L，pH7.0)；Km(卡那霉素)；IPTG(异丙基硫代-β-半乳糖苷)；PMSF(苯甲基磺酰氟)；Tris(三羟甲基氨基甲烷)。
具体实施例方式
实施例一 hrpNCSSY002基因的克隆和测序(1)hrpNCSSY002基因来自胡萝卜软腐欧氏杆菌(Erwinia carotovora subsp.carotovora)CSSY002菌株，该基因以hrpN基因簇形式存在于CSSY002菌株的染色体DNA上。把胡萝卜软腐欧氏杆菌(Erwinia carotovora subsp.carotovora)CSSY002菌株首先在LB平板上筛选，并进行胞外蛋白酶活性和HR检测。(2)将选取的单克隆菌落，于28℃下在LB液体培养基中振荡培养12小时，离心收集菌体，用基因组DNA分离试剂盒分离、纯化细菌染色体DNA。(3)细菌染色体DNA经Sau3A部分消化，用质粒载体pLARF5构建胡萝卜软腐欧氏杆菌(Erwinia carotovora subsp.carotovora)CSSY002菌株的基因组文库。(4)用胡萝卜软腐欧氏杆菌(Erwinia carotovora subsp.carotovora)ECC71菌株的hrpNEcc基因(Wei ZM，et al.Science，1992，257(5066)85-88)作分子探针，通过克隆杂交从CSSY002基因组文库中筛选鉴别hrpN+质粒，获得包括hrpN基因整个编码区在内的1.9kb DNAs片段，并进一步将此片段亚克隆进pBluescript载体中。(5)用通用引物T7进行核苷酸序列测定，其中有一个1071bp的阅读框(readingframe)即为hrpNCSSY002基因的编码区，序列如SEQ ID No.1。
实施例二hrpNCSSY002基因的相关应用(1)用基因重组技术将hrpNCSSY002基因克隆进抗卡那霉素的Ti质粒载体中，形成hrpNCSSY002-Ti质粒；(2)用hrpNEccs1-Ti质粒转化农杆菌细胞，筛选含hrpNCSSY002-Ti质粒的阳性表达农杆菌；(3)将处于再生壁时期的胡萝卜原生质体与含hrpNCSSY002-Ti质粒的农杆菌一起共培养36-48小时，离心洗涤去菌后在含卡那霉素的选择培养基上筛选转化的胡萝卜细胞克隆；(4)将转化的胡萝卜细胞克隆在分化培养基上培养成再生植株，即获得胡萝卜hrpNCSSY002基因转基因植株，该转基因植株与未转hrpNCSSY002基因的胡萝卜再生植株相比，具有明显的生长优势和抗软腐病特性。
实施例三hrpNCSSY002基因相关遗传重组体的应用(1)用基因重组技术将hrpNCSSY002基因与hrpNEa基因融合，形成hrpNCSSY002-hrp NEa融合基因；(2)将hrpNCSSY002-hrpNEa融合基因克隆进抗卡那霉素的高效表达质粒载体pETa(+)中，形成hrpNCSSY002-hrpNEa-pETa(+)质粒；(3)用hrpNCSSY002-hrpNEa-pETa(+)质粒转化工程菌JM 109(DE3)，在加卡那霉素选择压下筛选含hrpNCSSY002-hrpNEa-pETa(+)质粒的阳性表达菌株；(4)用发酵法生产该融合基因表达的融合蛋白HarpinCSSY002-HarpinEa，并通过SDS PAGE检测融合蛋白的表达情况，从而获得生物学活性更强和作用范围更广的Harpin类融合蛋白激发子。
实施例四HarpinCSSY002蛋白质的制备和纯化1菌种制备及大规模发酵(1)制备原种将带有hrpNCSSY002基因高效表达质粒pET28a(+)的工程菌E.coli JM109(DE3)菌株于甘油-LB+Km20μg/ml的斜面上划线，37℃培养过夜。
(2)制备母种将原种斜面上生长良好的单克隆菌落接种于加有100ml甘油-LB+Km20μg/ml的250ml摇瓶中，于37℃110rpm振荡培养12h。(3)制备生产种将母种菌液按1％体积比接种于加有3L甘油-LB+Km25μg/ml的5L发酵罐中，37℃110rpm和0.5L/min通气量条件下培养12h。(4)大规模发酵将50L以上的发酵罐加入70％体积的甘油-LB及终浓度40μg/ml的Km后，原位灭菌30min(120℃，1.1MPa)；然后按1％体积比接入生产种子菌，37℃200rpm和1L/min通气量条件下发酵培养；待细菌进入对数生长期(OD600＝0.7)后，调节转速和通气量，以保证发酵环境有充足的供氧(DO＞30％)，并按特定程序进行对数分期补料；在细菌对数生长期结束前1-2小时，通过微孔滤膜加入诱导剂IPTG至终浓度1mM；继续诱导发酵4-6小时，即可下罐。此法可实现工程菌的高密度或高效培养。
2HarpinCSSY002蛋白质的分离和纯化HarpinCSSY002蛋白质在大肠杆菌细胞中主要以包涵体(inclusion body)形式存在。工业上大规模生产HarpinCSSY002蛋白时，采用8M尿素破碎制备。实验室中为了得到更进一步的HarpinCSSY002蛋白质质纯品，可按下列程序操作离心(5,000rpm，10min)收集经IPTG诱导4-6小时的大肠杆菌细胞，以20mMTris缓冲液(pH9.0)充分悬浮后，加10μl/25ml的溶菌酶(100mg/ml)，冰浴10min，加0.5ml/25mlPMSF(20mg/ml)，超声波(20KHz)破碎10min，再加0.5ml/25ml的PMSF，混匀后再超声波破碎10min，10,000rpm离心10min，取上清液于100℃水浴10min，冷却后12,000rpm离心10min，收集上清液。此上清液中即含有较高纯度的HarpinCSSY002蛋白质，浓度达3600μg/ml。
实施例五HarpinCSSY002蛋白质的使用方法HarpinCSSY002蛋白质在使用上方法多样，可因处理材料、处理部位、处理时间以及处理目的不同而有所差异。具体可按以下介绍的方法使用(1)浸种首先用水将HarpinCSSY002蛋白质配成30-60μg/ml的浓度，然后将种子浸于其中8-12小时。此法适宜作催芽的作物或蔬菜种子。浸种结束后，将种子从HarpinCSSY002蛋白质浸种液中取出，即可催芽或播种。出苗一周后，苗高比对照增长10％以上，生长量也提高10％以上，而且苗期抗猝倒病的能力也明显增强。
(2)拌种将种子稍加湿润，加入种子量0.1％的HarpinCSSY002蛋白质制剂，充分拌匀后播种。出苗后苗齐苗壮，增强苗期抗猝倒病的能力。
(3)蘸根适于移栽定殖的作物，如瓜果、蔬菜、棉花、玉米等。首先将HarpinCSSY002蛋白质制剂配成30μg/ml的水溶液，然后将被移栽作物幼苗的根浸在该溶液中1-2小时。移栽后，植株恢复生长快，缓苗时间缩短，植株长势强劲。
(4)叶面喷雾作物的整个生长季节均可进行喷施。将HarpinCSSY002蛋白质制剂配成15-20μg/ml的水溶液，在作物的苗期、分蘖期、初花期、初果期或灌浆期进行喷雾使用。作物生长季节一般可喷雾2-3次。喷雾后，可提高作物营养体生长量15-30％，提高产量10-20％，而且整个生长季节可省掉80％以上的化学农药。某些作物如黄瓜可抗住60％的灰霉病、烟草可抗住60-80％的花叶病毒病。另外还有一定的抗逆(抗旱、抗寒、耐盐碱等)和驱虫效果。
实施例六HarpinCSSY002蛋白质的应用举例目前已对数十种作物、蔬菜、水果、花卉作了HarpinCSSY002蛋白质的施用效果试验，虽然在不同作物品种上表现程度有所不同，但HarpinCSSY002蛋白质的促长增产、抗病驱虫、提高抗逆性以及盆花、苗木塑型等方面的作用是显著的。下面举几例加以说明(1)玉米选取两块5分地大小的4叶期玉米苗田，分别用作对照和处理样块。处理块分别在4叶期和6叶期用15-20μg/ml的HarpinCSSY002蛋白质溶液作了叶面喷雾，此外不使用任何农药，其它方面的管理与对照块一样。在试验过程中发现，用药后一周，处理块平均株高比对照块高出10-15cm，玉米大小斑病发病率也比对照块低20-30％；同时处理块开花比对照块提前5-10天，灌浆期双苞率明显高于对照。收获后比较产量，处理块比对照块增产12％以上。
(2)黄瓜选取二块5分地大小的3叶期黄瓜苗田，分别用作对照、HarpinCSSY002蛋白质处理的样块。蛋白处理液的浓度为20μg/ml。处理块分别在3叶期、5叶期和7叶期进行过叶面喷雾，其它管理同对照。试验结果表明HarpinCSSY002蛋白质处理，开花比对照提前8天；花叶病比对照减少65％；灰霉柄比对照减少30％；产量比对照增加23％以上。
(3)草莓选取约2分地大小的两厢3叶期草莓苗棚，分别作对照和HarpinCSSY002蛋白质处理。处理苗棚的HarpinCSSY002蛋白质使用浓度为20μg/ml。3叶期开始叶面喷雾，以后每间隔15天喷施一次，共计5次。结果显示，处理棚比对照棚提早10左右开花；单株花、果率平均比对照增加2-3个；灰霉病发生率明显少于对照；鲜果呈色好、果型优、畸形果率低，产量比对照增产25％以上。另外，通过对等量鲜果进行烘干称重，发现处理棚的干物质积累也比对照增加1-2％。
(4)仙客来仙客来是深受大众喜欢的盆花品种，但是由细菌性软腐病引起的死亡率很高，高温时休眠，而且因病毒病造成的畸形叶、花严重影响了其观赏价值和商业价值。我们选取了400盆3-4月龄仙客来作供试材料，随机分成两组，分别作对照和HarpinCSSY002蛋白质处理。HarpinCSSY002蛋白质的使用浓度为20μg/ml。处理方法为叶面喷雾，每间隔10-15天喷施一次。结果表明，用药一周以后，处理组的叶色变深、有光泽，株型也明显变得挺拔、紧凑、活脱，并能打破高温休眠；用药一个月以后，以前因病毒病而畸形卷曲的幼叶开始逐渐伸展成正常形态，而对照组的幼叶则变得越来越畸形，连开出的花瓣也呈畸形扭曲。另外，HarpinCSSY002蛋白质对仙客来叶片上的白粉虱也有一定的驱赶作用。
(5)烟草烟草为蚜虫易感植物。用25μg/ml浓度的HarpinCSSY002蛋白制剂在25℃条件下对烟草种子浸种24-48小时，并以pH6.5的5mM磷酸钾缓冲液作对照浸种处理，然后分别播于三个培养盘中萌发，待出苗以后分组移栽于同一块大田中，随后每天观察记录感染蚜虫的数目。结果发现，对照处理组第1、2、3、6、7、8、9、10天单株感染蚜虫的平均数分别为0、3、3、6、7、9、13、17；HarpinCSSY002蛋白处理组第1、2、3、6、7、8、9、10天单株感染蚜虫的平均数分别为0、0、0、1、0、0、2、2。
(6)非洲凤仙花非洲凤仙花是一种常见观赏草花。取10盆生长势基本一致的非洲凤仙花，分作处理和对照2组，每组5盆，处理组和对照组分别用25μg/ml浓度的HarpinCSSY002蛋白制剂和水进行叶面喷雾，共喷2次，每次间隔7天，其它管理条件一致。待15天以后，将2组材料停止水肥管理(即停止浇水和施肥)，结果发现，15天以后，对照组植株开始出现枯黄凋零，花叶病毒病爆发，而处理组植株长势健康，未发生花叶病毒病。
(7)草莓果实保鲜取刚采集的新鲜草莓100粒，按50粒1组分成处理和对照2组，处理组用30μg/ml HarpinCSSY002蛋白溶液浸10分钟，对照组用纯净水浸10分钟，然后分别装在2个透气小篮中，上面覆以纱布，室温下放置1周，结果表明，对照组草莓90％以上已软化，颜色暗褐，其中10％已严重霉烂，而处理组草莓90％以上颜色鲜亮，果粒脆嫩，只有少数几粒颜色变深，果粒变软。
序列表<110>成都派润生物科技有限公司<120>一种编码植物多功能活性和广谱抗性细胞信号因子的hrpN基因及其表达产物与应用<160>2<170>PatentIn Version 2.1<210>1<211>1071<212>DNA<213>胡萝卜软腐欧文氏杆菌(Erwinia carotovora subsp.carotovora)<221>1-1071<400>11atgcttaatt ctcttggtgg cggagcttct ctgcaaatca cgatcaaagc gggtggtaac61 ggcggtttat ttccatctca gtcttcacaa aatggcggat cgccatcgca gtcggcgttt121 ggtggccagc gtagcaacat cgcagaacag ctgtccgata tcatgacgac tatgatgttt181 atgggcagca tgatgggcgg cggcatgggc ggtgggctcg gtggtttagg cagtagcctg241 ggcggactcg gtggtggttt gctgggtggt ggcttgggtg gcggtctcgg cagtagcctt301 ggtagtggac tgggcagtgc gctcggcggc ggattaggcg gggtgctggg tgctggcatg361 aatgccatga atccatcggc catgatgggt agcctgctgt ttagcgcgct ggaagatctg421 ctgggcggtg gcatgtcgca gcagcagggt gggcttttcg gcaacaaaca gccgtcgtcg481 ccggaaattt ctgcctatac ccaaggcgtt aacgatgcgc tgtccgcaat tctgggcaac541 ggcctgagcc agacgaaagg gcaaacgtca ccgttgcaac tgggtaataa cggtctgcaa601 ggcttgagcg gtgcgggtgc gtttaatcaa ctgggtagca cgctggggat gagcgttggg661 caaaaagccg gtttgcagga gttgaacaac atcagcacgc acaatgatag cccgacgcgt721 tacttcgtgg ataaagaaga tcgggcgatg gcgaaagaaa ttggtcagtt tatggatcaa781 tatcctgaag tcttcggcaa ggcagaatac cagaaagata actggcagac ggcgaaacag841 gaggataaat cctgggctaa agcgctgagc aagccggatg acgacggcat gactaagggc901 agcatggata aattcatgaa ggcggtcggc atgatcaaga gtgcgatagc gggtgatact961 ggcaacacta acctgagcgc tcgtggcaac ggcggcgcat ctctgggcat tgatgcagcg1021 atgatcggcg accgtatcgt caatatgggg ttgaagaagc tctccagcta a
<210>2<211>356<212>PRT<213>胡萝卜软腐欧文氏杆菌(Erwinia carotovora subsp.carotovora)<400>2Met Leu Asn Ser Leu Gly Gly Gly Ala Ser Leu Gln Ile Thr Ile Lys15 10 15Ala Gly Gly Asn Gly Gly Leu Phe Pro Ser Gln Ser Ser Gln Asn Gly20 25 30Gly Ser Pro Ser Gln Ser Ala Phe Gly Gly Gln Arg Ser Asn Ile Ala35 40 45Glu Gln Leu Ser Asp Ile Met Thr Thr Met Met Phe Met Gly Ser Met50 55 60Met Gly Gly Gly Met Gly Gly Gly Leu Gly Gly Leu Gly Ser Ser Leu65 70 75 80Gly Gly Leu Gly Gly Gly Leu Leu Gly Gly Gly Leu Gly Gly Gly Leu85 90 95Gly Ser Ser Leu Gly Ser Gly Leu Gly Ser Ala Leu Gly Gly Gly Leu100 105 110Gly Gly Val Leu Gly Ala Gly Met Asn Ala Met Asn Pro Ser Ala Met115 120 125Met Gly Ser Leu Leu Phe Ser Ala Leu Glu Asp Leu Leu Gly Gly Gly130 135 140Met Ser Gln Gln Gln Gly Gly Leu Phe Gly Asn Lys Gln Pro Ser Ser145 150 155 160Pro Glu Ile Ser Ala Tyr Thr Gln Gly Val Asn Asp Ala Leu Ser Ala165 170 175Ile Leu Gly Asn Gly Leu Ser Gln Thr Lys Gly Gln Thr Ser Pro Leu180 185 190Gln Leu Gly Asn Asn Gly Leu Gln Gly Leu Ser Gly Ala Gly Ala Phe195 200 205Asn Gln Leu Gly Ser Thr Leu Gly Met Ser Val Gly Gln Lys Ala Gly210 215 220Leu Gln Glu Leu ASn Asn Ile Ser Thr His Asn Asp Ser Pro Thr Arg225 230 235 240Tyr Phe Val Asp Lys Glu Asp Arg Ala Met Ala Lys Glu Ile Gly Gln245 250 255
Phe Met Asp Gln Tyr Pro Glu Val Phe Gly Lys Ala Glu Tyr Gln Lys260 265 270Asp Asn Trp Gln Thr Ala Lys Gln Glu Asp Lys Ser Trp Ala Lys Ala275 280 285Leu Ser Lys Pro Asp Asp Asp Gly Met Thr Lys Gly Ser Met Asp Lys290 295 300Phe Met Lys Ala Val Gly Met Ile Lys Ser Ala Ile Ala Gly Asp Thr305 310 315 320Gly Asn Thr Asn Leu Ser Ala Arg Gly Asn Gly Gly Ala Ser Leu Gly325 330 335Ile Asp Ala Ala Met Ile Gly Asp Arg Ile Val Asn Met Gly Leu Lys340 345 350Lys Leu Ser Ser *35权利要求
1.一种编码植物多功能活性和广谱抗性细胞信号因子的hrpN基因，其特征在于该基因的核苷酸序列是序列表中的SEQ ID No.1。
2.根据权利要求1所述的hrpN基因，其特征在于该基因自胡萝卜软腐欧文氏杆菌(Erwinia carotovora subsp.carotovora)菌株中获得。
3.权利要求1或2所述的hrpN基因在调节植物生长发育和防治病虫害有关的农业生物技术育种、转基因植物方面的应用。
4.根据权利要求1或2所述的hrpN基因，在以下任一方面的应用(1)促进植物生长发育；(2)植物的广谱抗病性，包括对多种细菌、真菌和病毒的抗性；(3)植物的驱虫性；(4)植物的抗逆性(植物对干旱、严寒、盐碱等不良环境的耐受性)；(5)延长作物产品的储存时间；(6)对盆花、苗木的塑型作用。
5.含有权利要求1或2所述的hrpN基因的遗传重组体。
6.根据权利要求5所述的遗传重组体在调节植物生长发育和防治病虫害有关的农业生物技术育种、转基因植物方面的应用。
7.一种编码植物多功能活性和广谱抗性细胞信号因子的hrpN基因编码的Harpin蛋白质，其特征在于该蛋白质具有序列表中SEQ ID No.2的氨基酸序列，具有以下属性(1)共有356个氨基酸残基；(2)分子量36.64kda；(3)等电点pI5.9；(4)富含甘氨酸(Gly)，缺乏半胱氨酸(Cys)；(5)对温度稳定，在100℃沸水中耐受10-15分钟仍有活性；(6)没有四级结构。
8.含有权利要求7所述的Harpin蛋白质的生物制品。
9.根据权利要求7所述的Harpin蛋白质，在以下任一方面的应用(1)促进植物生长发育；(2)植物的广谱抗病性，包括对多种细菌、真菌和病毒的抗性；(3)植物的驱虫性；(4)植物的抗逆性(植物对干旱、严寒、盐碱等不良环境的耐受性)；(5)延长作物产品的储存时间；(6)对盆花、苗木的塑型作用。
10.根据权利要求8所述的Harpin蛋白质的生物制品，在以下任一方面的应用(1)促进植物生长发育；(2)植物的广谱抗病性，包括对多种细菌、真菌和病毒的抗性；(3)植物的驱虫性；(4)植物的抗逆性(植物对干旱、严寒、盐碱等不良环境的耐受性)；(5)延长作物产品的储存时间；(6)对盆花、苗木的塑型作用。
全文摘要
本发明公开了一种编码植物多功能活性和广谱抗性细胞信号因子的hrpN基因及其表达产物与应用。本发明所提供的基因源自胡萝卜软腐欧氏杆菌(Erwiniacarotovora subsp.carotovora)菌株，其核苷酸序列如SEQ ID No.1，该基因在调节植物生长发育和防治病虫害有关的农业生物技术育种、转基因植物方面有广泛应用前景。该基因的编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.2，该蛋白质具有多种功能活性，能广泛诱导植物产生广谱抗病性、驱虫性和抗逆性，并促进植物生长发育和提高产量，因而其相关制品可作为生物农药直接用于植物的生长发育调节和病虫害防治。
文档编号C12N15/82GK1858206SQ20051002081
公开日2006年11月8日 申请日期2005年4月29日 优先权日2005年4月29日
发明者吴伯骥, 汤承, 曹茂林, 张珏, 崔亚亚 申请人:成都派润生物科技有限公司