专利名称：无血清无动物来源蛋白的动物细胞培养用胎牛血清替代剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种动物细胞无血清培养用的胎牛血清替代剂，尤其涉及一种无血清无动物来源蛋白配方的动物细胞培养用胎牛血清替代剂。
背景技术：
动物细胞的体外培养多采用含血清的培养基进行培养，成本高，血清成分不明确，不易下游产物纯化，更重要的是，血清中含有潜在的病毒(如疯牛病毒等)、prion或mycoplasma污染等缺点。用血清替代物替代血清而配制成的培养基，完全采用了已知分子结构和构型组分的培养基，其成份明确，质量一致，有利于提高细胞产品生产的稳定性并使细胞产品易于纯化，且避免了因血清中含有潜在的毒性等问题。
目前，国外已有用于CHO细胞培养的商品无血清培养基，国内也有学者研制了一系列用于骨髓瘤、杂交瘤、CHO、BHK和Vero细胞的无血清培养基和无蛋白培养基。研究表明，细胞在无血清培养基中可长期稳定传代，动物细胞无血清培养基具有很好的应用前景。目前国内外研究单位所研究的无血清培养基，主要是通过添加牛胰岛素，牛血清白蛋白，转铁蛋白等物质促进细胞贴壁与生长繁殖。
胰岛素、转铁蛋白、白蛋白等在无血清培养基中起重要作用。胰岛素可促进RNA、蛋白和脂类合成，抑制细胞凋亡，是重要的细胞存活因子[ChangJD et al.Biotech&Bioeng.1997，57(2)164～171]。转铁蛋白在无血清培养基中也起重要的作用，大多数动物细胞上存在特定的转铁蛋白受体，受体与转铁蛋白Fe3+复合物的结合是细胞获得必须的微量元素铁的主要来源，此外，转铁蛋白还具有生长因子的性质并能与其他微量元素如钒等结合的作用。白蛋白是重要的脂肪酸载体(如提供油酸、亚油酸和花生四烯酸)和微量元素来源。大多数贴壁型细胞换用血清培养液后，贴壁能力减弱，造成大量脱落，刘文献[刘文献等.中国生物工程杂志.2002，22(4)93-96]试图加入胶原蛋白、多聚赖氨酸等促贴壁成分，但作用不明显。在无血清的条件下培育的哺乳动物类细胞会丧失细胞贴壁特性，如果培养基中没有添加例剂如粘连蛋白、胰岛素或转铁蛋白等促进细胞贴壁的成分，则它们变得容易地从载体中脱落下来而无法生长与存活。然而，这些促进细胞贴壁的添加剂也是来源于动物蛋白。
Kattinger H等(Advances Mol.Cell.Biology，1996，15A，193-207)研究了细胞可以在无蛋白培养基中长期生长，但这些细胞必需在载体上进行培养，且细胞不能连续培养。M雷特等[中国专利申请号00816020.1]研究发明了以一定比例的大豆水解产物为主要添加成份的无蛋白培养基，它基本可以实现无蛋白无血清培养动物细胞，但其操作较为繁杂，且仍含有大量不明植物组份。
但是，在许多的科研和生产领域，如基因组学、蛋白组学、靶分子药物筛选以及临床前批量生产、用于病毒载体或重组蛋白制备的特定细胞系的培养，以满足基因治疗过程中大规模制备的需要等方面，尽量降低动物来源蛋白对其产品的纯化，生产的稳定性等方面有很大的帮助。因此，去除血清替代品中的动物来源蛋白则又是无血清培养领域又一个研究的热点。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是提供了一种无血清无动物来源蛋白配方的动物细胞培养用胎牛血清替代剂，旨在解决上述问题。
为了解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的本发明由重组人胰岛素样生长因子-1∶0.1g～0.5g/L(浓度)，重组人血小板源性生长因子-B0.1g～0.6g/L，重组人碱性成纤维细胞生长因子0.05～0.4g/L，聚乙二醇(MW7000～20000)，0.04～0.15％(w/v)，现用现加的聚乙烯醇(密度1.27～1.31)0.001～0.05％(w/v)，巯基乙醇0.3～0.5mol/L组成。
与现有技术相比，本发明的有益效果是添加到RPMI1640或DMEM等培养基中，能使CHO细胞、BHK细胞、L929细胞等快速贴壁，旺盛地生长；6～12小时换液一次，基础培养基添加该配方成份所培养出的细胞密度可达到与有10％血清培养基相媲美的一致使用效果，完全可以替代血清添加到基础培养基中用于CHO细胞、BHK细胞、L929细胞等的培养。
具体实施例方式
下面结合具体实施方式
对本发明作进一步详细描述实施例1本发明由重组人胰岛素样生长因子-10.1g/L，重组人血小板源性生长因子-B0.6g/L，重组人碱性成纤维细胞生长因子0.4g/L，聚乙二醇(MW7000～20000)0.04％(w/v)，现用现加的聚乙烯醇(密度1.27～1.31)0.05％(w/v)，巯基乙醇0.3mol/L。
实施例2本发明由重组人胰岛素样生长因子-10.3g/L(浓度)，重组人血小板源性生长因子-B0.4g/L，重组人碱性成纤维细胞生长因子0.05g/L，聚乙二醇(MW7000～20000)，0.15％(w/v)，现用现加的聚乙烯醇(密度1.27～1.31)0.001％(w/v)，巯基乙醇0.5mol/L。
实施例3本发明由重组人胰岛素样生长因子-10.5g/L(浓度)，重组人血小板源性生长因子-B0.35g/L，重组人碱性成纤维细胞生长因子0.25g/L，聚乙二醇(MW7000～20000)，0.1％(w/v)，现用现加的聚乙烯醇(密度1.27～1.31)0.02％(w/v)，巯基乙醇0.4mol/L。
配制方法首先配制好与细胞培养用相一致的基础培养基，例如RPMI1640或DMEM或F12或DMEM/F12等，配制浓度为正常浓度的4倍，用0.2μm滤膜除菌过滤；将称量好的聚乙二醇溶解到20倍质量的超纯水中，用0.45μm滤膜过滤；在缓慢搅拌下混合，按比例加入巯基乙醇，然后在缓慢搅拌下依次加入计算好体积的重组人胰岛素样生长因子-1、重组人血小板源性生长因子-B和重组人碱性成纤维细胞生长因子，全部加入4倍浓度基础培养基并加超纯水到最终体积的95％后，调整pH到7.2～7.3，用超纯水定容到最终体积；用0.1μm滤膜过滤后，分装到已经灭菌的玻璃或塑料容器中；贴标签，放置-20度保藏。
由于聚乙烯醇的溶解度低，培养细胞前现用100倍质量的超纯水与补加的聚乙二醇一起溶解并经高温灭菌后现加到基础培养基中，或现经过0.45μm滤膜过滤后加到基础培养基中一起除菌过滤后备用。
权利要求
1.一种无血清无动物来源蛋白的动物细胞培养用胎牛血清替代剂，其特征在于由重组人胰岛素样生长因子-10.1g～0.5g/L(浓度)，重组人血小板源性生长因子-B0.1g～0.6g/L，重组人碱性成纤维细胞生长因子0.05～0.4g/L，聚乙二醇(MW7000～20000)，0.04～0.15％(w/v)，现用现加的聚乙烯醇(密度1.27～1.31)0.001～0.05％(w/v)，巯基乙醇0.3～0.5mol/L组成。
2.根据权利要求1所述的无血清无动物来源蛋白的动物细胞培养用胎牛血清替代剂，其特征在于由重组人胰岛素样生长因子-10.1g/L，重组人血小板源性生长因子-B0.6g/L，重组人碱性成纤维细胞生长因子0.4g/L，聚乙二醇(MW7000～20000)0.04％(w/v)，现用现加的聚乙烯醇(密度1.27～1.31)0.05％(w/v)，巯基乙醇0.3mol/L。
3.根据权利要求1所述的无血清无动物来源蛋白的动物细胞培养用胎牛血清替代剂，其特征在于由重组人胰岛素样生长因子-10.3g/L(浓度)，重组人血小板源性生长因子-B0.4g/L，重组人碱性成纤维细胞生长因子0.05g/L，聚乙二醇(MW7000～20000)，0.15％(w/v)，现用现加的聚乙烯醇(密度1.27～1.31)0.001％(w/v)，巯基乙醇0.5mol/L。
4.根据权利要求1所述的无血清无动物来源蛋白的动物细胞培养用胎牛血清替代剂，其特征在于由重组人胰岛素样生长因子-10.5g/L(浓度)，重组人血小板源性生长因子-B0.35g/L，重组人碱性成纤维细胞生长因子0.25g/L，聚乙二醇(MW7000～20000)，0.1％(w/v)，现用现加的聚乙烯醇(密度1.27～1.31)0.02％(w/v)，巯基乙醇0.4mol/L。
全文摘要
本发明涉及一种无血清无动物来源蛋白的动物细胞培养用胎牛血清替代剂，由重组人胰岛素样生长因子一10.1g～0.5g/L(浓度)，重组人血小板源性生长因子一B0.1g～0.6g/L，重组人碱性成纤维细胞生长因子0.05～0.4g/L，聚乙二醇(MW7000～20000)，0.04～0.15％(w/v)，现用现加的聚乙烯醇(密度1.27～1.31)∶0.001～0.05％(w/v)，巯基乙醇0.3～0.5mol/L组成；添加到RPMI1640或DMEM等培养基中，能使CHO细胞、BHK细胞、L929细胞等快速贴壁，旺盛地生长；6～12小时换液一次，基础培养基添加该配方成分所培养出的细胞密度可达到与有10％血清培养基相媲美的一致使用效果，完全可以替代血清添加到基础培养基中用于CHO细胞、BHK细胞、L929细胞等的培养。
文档编号C12N5/06GK1800367SQ20051002311
公开日2006年7月12日 申请日期2005年1月5日 优先权日2005年1月5日
发明者朱文洲 申请人:上海席诺生物技术有限公司