专利名称：白血病急变主效基因之一aml－1突变基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子遗传学、细胞生物学、白血病学领域。具体地说，本发明涉及慢性粒细胞性白血病急变主效基因之一AML-1突变基因及其应用背景技术慢性粒细胞性白血病(CML)是造血干细胞增殖紊乱性疾病，以染色体易位t(9；22)(q34；q11)产生费城染色体为主要特征。易位产生的BCR-ABL融合蛋白具有持续的酪氨酸激酶活性，可以使细胞发生转化，导致肿瘤发生。转基因小鼠实验已经证实BCR-ABL融合蛋白可以导致慢性粒细胞性白血病的发生，使细胞获得生存和增殖优势，但是，慢性粒细胞性白血病急变时细胞还会发生分化阻滞。所以，临床上CML患者从相对良性的慢性期转化到加速期和急变期需要“二次打击”，即除BCR-ABL融合蛋白以外再发生一次遗传学改变，使已经获得生存和增殖优势的白血病细胞发生分化阻滞，后者被认为是促进因素。然而，目前只有很少的患者由CML-CP转化到BC的相关遗传学事件被发现p53和p16/ARF突变发生在10-20％的急变患者中；少数患者有Rb和Ras突变；少数患者有染色体易位产生的融合蛋白NUP98-HOXA9和AML-1-EVI，但是p53、p16/ARF、Rb和Ras等主要还是使细胞获得生存和增殖优势，白血病细胞在急变时发生分化阻滞的原因仍未明。
AML-1(runt相关转录因子1或急性髓细胞性白血病因子1)是一种已知的基因(genebank登录号RNA gi49574545；DNA gi51475294)，位于21q22.3，在各系血细胞中广泛表达，AML-1和CBFβ结合成异二聚体调控许多造血分化相关基因的表达，现已证实AML1转录调控的靶基因有MPO、GM-CSFR、M-CSFR、中性粒细胞酯醇、IL3、IL5、中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)、明胶酶β、TCRs和B-细胞受体等。AML-1-/-小鼠胎肝造血障碍，造血干细胞不能向下阶段分化成熟，各系血细胞生成障碍，导致贫血及中枢神经系统出血使小鼠死于胚胎发育期。AML-1和CBFβ上调促进巨核细胞的分化，而下调促进红细胞的分化。AML-1和CBFβ是人类白血病染色体易位经常累及的基因，易位产生的融合蛋白主要以显性负形式抑制正常AML-1的功能而致白血病。AML-1也是人类白血病中最常发生突变的基因之一，在散发性白血病例如AML(M0，MI，M2，M3，M4，M5，M7主要是M0)、MDS转化的AML、继发性(治疗相关)MDS/AML、伴随21三体的髓性恶性疾病、DOWN氏综合症相关的血液疾病、伴随7q-的骨髓异常增殖性疾病等都发现了AML-1的点突变。迄今为止，只有两篇文章涉及在慢性粒细胞性白血病急变患者中筛查AML-1突变，总共筛查84例患者只发现一例R80C突变，作者认为AML-1突变在慢性粒细胞性白血病急变患者中罕见。
GATA-2(GATA转录因子2)是一种已知的基因(genebank登录号RNA GI31982886；DNA gi37550867)，位于3q21.3，主要表达于造血干细胞早期阶段并随着造血细胞的分化、发育成熟表达下调。GATA-2的缺失可导致造血的严重缺陷和胚胎死亡。GATA-2下调出现于造血干细胞向祖细胞的演变过程中，从而迈出了造血分化的关键一步。GATA-2的表达下调对于红系分化是必需的，且过度表达GATA-2还可使细胞向巨核细胞分化。GATA-2调节的靶基因可能参与了急性早幼粒细胞白血病的发病机制，并在诱导分化治疗中被激活转录。GATA-2与ROG，TZFP，PML-RARA，PLZF-RARA之间存在交互作用。MITF联合GATA-1或GATA-2使嗜碱前体细胞分化成熟。到目前为止国内外报道GATA-2基因突变的发生率并不高，国内国人李发现1例M1型和1例M2型病人出现点突变。目前对GATA-2的研究主要集中在其生物学特性和功能方面，而对其在白血病中的作用的报道不多，未见GATA-2突变与慢性粒细胞性白血病急变相关的报道。
发明内容
本发明的目的在于(1)公开慢性粒细胞性白血病急变的主效基因之一AML-1基因；(2)公开慢性粒细胞性白血病急变的主效基因之一AML-1突变基因的突变位点；(3)公开检测慢性粒细胞性白血病急变的主效基因之一AML-1突变基因的试剂盒；(4)公开AML-1突变基因在慢性粒细胞性白血病急变的早期检测和/或治疗方法中的应用；(5)公开试剂盒在慢性粒细胞性白血病急变的早期检测和/或治疗方法中的应用。
本发明的目的是通过以下技术方法来实现的发明人以造血相关转录因子为候选基因，在85例中国人群慢性粒细胞性白血病急变患者(其中急髓系变患者51例，急淋系变患者6例，加速期患者28例)中筛查可能的突变。经过大量的实验，用聚合酶链式反应(PCR)扩增-直接测序技术在两例加速期患者和九例急变期患者中发现有AML-1突变(突变频率为12.9％)，其中有两例患者具有相同的点突变。九例发生在runt同源盒结构域；一例发生在AML-1的辅助抑制因子Ear-2的结合位点；一例发生在转录激活结构域；一例发生在转录抑制结构域。在一例加速期患者和八例急变期患者中发现有GATA-2突变(突变频率为10.6％)，其中一例患者是缺失突变，发生在第一锌指结构域；八例患者具有相同的点突变，发生在第二锌指结构域。我们对上述患者的慢性期骨髓标本以及200例正常对照外周血标本采用同样的直接测序法，均未检测到上述突变。伴AML-1基因突变的其中1例患者在急变后还获得了一次完全缓解，完全缓解时没有检测到该突变。说明这些突变是与慢性粒细胞性白血病急变相关的，而且在加速期就已经能检测到。从而本发明找到了两个慢性粒细胞性白血病急变二次打击的遗传学事件。
本发明提供了检测慢性粒细胞性白血病急变相关基因GATA-2突变基因的方法，所述方法为直接测序法。
第一种方法A提取DNA，对GATA-2基因外显子设计引物，进行PCR扩增；BPCR反应产物经直接纯化后直接测序，将所得序列于genebank上的序列比对，确定突变位点。
进一步包括如下步骤C按正常读码框架进行翻译以确定GATA-2基因的突变位点。
第二种方法A提取总RNA，逆转录成cDNA，在突变位点附近设计PCR引物，进行PCR扩增；BPCR反应产物经直接纯化后直接测序，将所得序列于genebank上的序列比对，确定突变位点。
进一步包括如下步骤C按正常读码框架进行翻译以确定GATA-2基因的突变位点。
第三种方法A提取总RNA，逆转录成cDNA，在突变位点附近设计PCR引物，进行PCR扩增；BPCR反应产物可隆到p-GEMT-easy载体中，然后转化大肠杆菌菌株JM109，挑单克隆测序，将所得序列于genebank上的序列比对，确定突变位点。
进一步包括如下步骤C按正常读码框架进行翻译以确定GATA-2基因的突变位点。
本发明提供了一种检测慢性粒细胞性白血病急变相关基因AML-1突变基因的方法，所述方法为直接测序法。
第一种方法A提取DNA，对AML-1基因外显子设计引物，进行PCR扩增；BPCR反应产物经直接纯化后直接测序，将所得序列于genebank上的序列比对，确定突变位点。
进一步包括如下步骤C按正常读码框架进行翻译以确定AML-1基因的突变位点。
第二种方法
A提取总RNA，逆转录成cDNA，在突变位点附近设计PCR引物，进行PCR扩增；BPCR反应产物经直接纯化后直接测序，将所得序列于genebank上的序列比对，确定突变位点。
进一步包括如下步骤C按正常读码框架进行翻译以确定AML-1基因的突变位点。
第三种方法A提取总RNA，逆转录成cDNA，在突变位点附近设计PCR引物，进行PCR扩增；BPCR反应产物可隆到p-GEMT-easy载体中，然后转化大肠杆菌菌株JM109，挑单克隆测序，将所得序列于genebank上的序列比对，确定突变位点。
进一步包括如下步骤C按正常读码框架进行翻译以确定AML-1基因的突变位点。
本发明优选突变位点位于AML-1的RUNT结构域和GATA-2的第一、第二锌指结构域。更优选突变位点至少一个位于AML-1 1788delC(氨基酸突变L71fs-ter94)、C1812A(氨基酸突变H78Q)、G1815C(氨基酸突变W79C)、C1993G(氨基酸突变R139G)、A2090G(氨基酸突变D171G)、G2099A(氨基酸突变R174Q)、C2455T(氨基酸突变R293X)、2356-2357insCAAT(氨基酸突变Y260fs-ter573)、1849delG(氨基酸突变V91fs-ter94)、2718-2722delCGGCG(氨基酸突变G381fs-ter570)和GATA-2基因的T1075G(氨基酸突变L359V)、1021-1038del(氨基酸突变A341-G346del)。
本发明提供检测慢性粒细胞性白血病急变的两个主效基因AML-1和GATA-2突变基因的试剂盒试剂盒含有1)扩增引物引物名称上游引物序列 下游引物序列AML-1-C15’CCCCGCAGTAATAAAGG3’5’GCTCTGTGGTAGGTGGC3’AML-1-C25’ATGGCTGGCAATGATGAA3’ 5’AGGGTTAAAGGCAGTGGAGT3’AML-1-C35’ACAGCCATGAGGGTCAGC3’ 5’GCCGTAGTACAGGTGGTAGG3’AML-1-C45’CCAGCGGCATGACAACC3’5’CCTCAGTAGGGCCTCCACA3’AML-1-E25’AGGGTCCTAACTCAATCGGCTT3’ 5’CAACACAGCATCCCCCACATCC3’AML-1-E35’CCGAGTTTCTAGGGATTCCA3’ 5’CCGAGTTTCTAGGGATTCCA3’AML-1-E45’AAATTCCGGGAGTGTTGTCA3’ 5’GCAACTTTTTGGCTTTACGG3’AML-1-E55’TGATCTCTTCCCTCCCTCCT 5’CAGGTGGTGCTGTTGGTTC3’AML-1-E65’ATTTGAACAAGGGCCACTCA3’ 5’GGGCATGGGACTCAGAGTAG3’AML-1-E75’CTCACTTCCGCTCCGTT3’5’CTCCACCACGTCGCTCT3’GATA-2-C1 5’CTGCTCCCAGCTCTACTCCA3’ 5’GCCTTCTGAACAGGAACGAG3’GATA-2-C2 5’CACCTACCCCTCCTATGTGC3’ 5’ACGTCCATCTGTTCCCTAGC3’GATA-2-E1 5’ACACCTCGTGGTGGGACTT3’5’TTTTCAGCAGCTCGATTCCT3’GATA-2-E2 5’GTCCCTAGCTCTGCCTACCC3’ 5’CCTCTCCCAAGTCACAGCTC3’2)Taq DNA聚合酶(5U/μl)。Taq DNA聚合酶储存于20mM Tris-HCl，pH8.0；0.1mM EDTA；1mM DTT，0.5％ NP-40，0.5％ Tween20，50％glycerol，100mM KCl缓冲液中。-20℃保存一年以上。
3)10×反应缓冲液。10×反应缓冲液组成成分为KCl 500mM；Tris-HCl200mM(pH9.0)；Triton X-100 1％；MgCl220Mm。
4)dNTP(10mM/L)本发明提供了AML-1和GATA-2突变基因的检测方法在慢性粒细胞性白血病急变的早期检测和/或治疗方法中的应用以及突变的AML-1和GATA-2基因在慢性粒细胞性白血病急变的早期检测和/或治疗方法中的应用。例如，由于本发明证实AML-1和GATA-2基因是慢性粒细胞性白血病急变相关基因中的两个，尤其使突变集中在AML-1的RUNT结构域和GATA-2的第一、第二锌指结构域，从而将AML-1和GATA-2基因与慢性粒细胞性白血病急变患者的药物治疗联系起来，可以发明作用于这些靶点的药物来治疗慢性粒细胞性白血病急变患者，为慢性粒细胞性白血病急变患者的新药研发提供理论依据。
图1Kaplan-Meier生存曲线用SPSS统计软件，曲线示两组患者间由慢性期到急变期所需时间有显著差别有AML-1突变的患者疾病进程相对缓慢；有GATA-2突变的患者疾病进程相对凶险。
图211号患者测序图。箭头所示为AML-1突变位点C1812A(氨基酸突变H78Q)。患者在慢性期和完全缓解期均为野生型。
图318号患者测序图。箭头所示为AML-1突变位点2356_2357InsCAAT(氨基酸突变Y260fsTer573)。患者在慢性期为野生型，克隆后测序发现患者急变时插入CAAT，所以PCR产物直接测序时，该处序列为双峰。
图4GATA-2点突变A1075C(氨基酸突变L359V)测序图。箭头所示为点突变位点。患者在慢性期为野生型。
图5GATA-2缺失突变测序图。箭头所示为GATA-2缺失突变位点1021-1038del(氨基酸突变A341-G346del)后的第一个核苷酸A，与野生型相比其前缺失18bp即GCCGCCAGAAGAGCCGGC。患者在慢性期为野生型，所以PCR产物直接测序时，该处序列为双峰。
图6GATA-23号患者骨髓细胞形态观察，主要向粒单系方向急变。(a)慢性期骨髓涂片瑞氏染色，中性中幼粒、晚幼粒和杆状核粒细胞比例增加；(b)-(g)急变期骨髓涂片(b)瑞氏染色，原始粒细胞、原始单核细胞和早幼粒细胞占78％；(c)髓过氧化物酶(MPO)染色，是粒系标志性染色，图中强阳性，阴性和弱阳性共存，表明患者向粒-单方向急变。(d)过碘酸希夫氏碱(PAS)染色；(e)氯化醋酸AS-D萘苯酚酯酶(NAS-DCE)染色，是粒系特异性标记；(f)乙酸AS-D萘酚酯酶(NAS-DAE)染色，是单核系特异性标记；(g)NaF抑制NAS-DAE染色，是单核细胞特征性检验，能被NaF抑制说明患者向单核系急变。(h)GATA-26号患者急变期骨髓瑞氏染色涂片，原始粒细胞25％，嗜酸细胞占26.5％。
图7AML-1 16号患者骨髓细胞形态观察，主要向粒系方向急变。(a)慢性期骨髓涂片瑞氏染色，中性中幼粒、晚幼粒和杆状核粒细胞比例增加；(b)-(e)急变期骨髓涂片(b)瑞氏染色，原始粒细胞72％；(c)髓过氧化物酶(MPO)染色阳性，说明患者向粒系急变；(d)过碘酸希夫氏碱(PAS)染色；(e)乙酸AS-D萘酚酯酶(NAS-DAE)染色。
图8GATA-2野生型和两个突变型L359V，Δ341-346的转录活性比较。a转染实验，用含GATA-2-RE的荧光素酶报告系统，将野生型GATA-2，L359V和Δ341-346分别和报告质粒一起转染293-T细胞，用SV-40质粒作内参，pcDNA3.1空载作对照。结果显示与野生型GATA-2比较L359V突变体有明显的转录激活作用而Δ341-346转录抑制作用。b-d用实时定量逆转录聚合酶链式反应检测UPN2、UPN3、UPN6(即2号、3号和6号)三个患者GATA-2的三个靶基因在慢性期和急变期的表达水平，数据为平均值±标准误，是三次独立实验的结果，紧靠在一起的成对柱状图左边为慢性期测量值右边为急变期测量值。
图9体外蛋白吸附实验(GST pull-down拉下试验)，比较野生型GATA-2，L359V和Δ341-346与CBP或HDAC1之间的结合活性。与野生型相比L359V与CBP结合能力增强，Δ341-346无明显变化；三者与HDAC1的结合能力几乎相同，GST为阴性对照。提示突变型L359V转录激活能力增强可能和其与CBP结合能力增强有关。
图10DNA结合蛋白凝胶阻滞分析实验，比较野生型GATA-2，L359V和Δ341-346与DNA的结合活性；以及冷探针(未用同位素标记的探针)和抗GATA-2抗体作用后的结果。+加GATA-2抗体；-不加冷探针或抗GATA-2抗体。图中可看出突变型L359V蛋白较野生型GATA-2蛋白DNA结合能力明显增强(见1、5泳道)，5倍冷探针使突变型L359V和野生型GATA-2信号均明显减弱(见2、6泳道)，而20倍冷探针则使二者信号几乎消失(见3、7泳道)，这说明所用实验系统的特性。在Supershift实验中加入抗pcDNA3.1载体His-tag抗体亦显示突变型L359V蛋白较野生型GATA-2蛋白DNA结合能力明显增强(见4、8泳道)。与荧光素酶报告系统转染实验结果一致，Δ341-346突变型较野生型GATA-2蛋白DNA结合能力减弱(见9-12泳道)。
图11AML-1和GATA-2蛋白结构示意图，箭头所示为突变位点。RHDrunt同源盒结构域；ECAML-1的辅助抑制因子Ear-2的结合位点；TAD转录激活结构域；TRD转录抑制结构域；ZF锌指结构域。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述。
实施例1GATA-2基因各外显子的PCR扩增1、患者样品采集及处理在治疗开始前采集患者的骨髓5-10ml，肝素抗凝，于当天用密度梯度离心法分离出单个核细胞，加适量白细胞裂解液及蛋白酶K，待白细胞充分裂解后用酚-氯仿法抽提基因组DNA，置-20℃备用。总RNA抽提和cDNA合成总RNA抽提和逆转录反应按试剂盒(GIBCO BRL公司)标准操作步骤进行。
正常对照瑞金医院职工年度体检各项指标均正常者的外周血5ml，共200份。按前述方法制备DNA。
2、引物设计采用的软件Primer premier5，引物参数设定为片断长度为300-700bp，引物最佳长度为20bp，最佳退火温度为60℃，引物浓度为0.3μM。引物设计时应注意设计的引物也作为测序引物，因此上下游引物包括的序列尽可能地避免多聚体(重复数N应小于或等于4)；引物离外显子起始或终止端至少50bp。AML-1和GATA-2PCR扩增引物见表1，其中C表示以cDNA为模板，E表示以DNA为模板。AML-1用四对引物扩全长cDNA；GATA-2用二对引物扩全长cDNA。E后面的数字表示相应的外显子编号。
3、样本DNA的聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)寻找突变位点采用小样本(24例AML患者)PCR扩增目的基因，采用申友公司的Taq酶，反应体系(25μl)为10×Buffer2.5μl，引物(20μM)0.4μl×2，dNTPmix(10mM)0.5μl，MgCl2(25mM)1.5μl，Taq酶0.25μl，ddH2o18.65μl，DNA模板25ng.PCR反应程序94℃ 5min，94℃ 30sec，56℃40sec，72℃ 40sec，35cycles；72℃ 10min；4℃ forver.若有非特异条带，且提高退火温度也不能去除杂带，则采用Touch-down的PCR反应程序94℃5min；94℃ 30sec，65℃ 40se -1℃/cycle，72℃ 40sec，10cycles；94℃30sec，56℃ 40sec，72℃ 40sec，30cycles；72℃ 10min；4℃ forver。
表1 AML-1和GATA-2PCR扩增引物引物名称上游引物序列 下游引物序列AML-1-C15’CCCCGCAGTAATAAAGG3’5’GCTCTGTGGTAGGTGGC3’AML-1-C25’ATGGCTGGCAATGATGAA3’ 5’AGGGTTAAAGGCAGTGGAGT3’AML-1-C35’ACAGCCATGAGGGTCAGC3’ 5’GCCGTAGTACAGGTGGTAGG3’AML-1-C45’CCAGCGGCATGACAACC3’5’CCTCAGTAGGGCCTCCACA3’AML-1-E25’AGGGTCCTAACTCAATCGGCTT3’ 5’CAACACAGCATCCCCCACATCC3’AML-1-E35’CCGAGTTTCTAGGGATTCCA3’ 5’CCGAGTTTCTAGGGATTCCA3’AML-1-E45’AAATTCCGGGAGTGTTGTCA3’ 5’GCAACTTTTTGGCTTTACGG3’AML-1-E55’TGATCTCTTCCCTCCCTCCT 5’CAGGTGGTGCTGTTGGTTC3’AML-1-E65’ATTTGAACAAGGGCCACTCA3’ 5’GGGCATGGGACTCAGAGTAG3’AML-1-E75’CTCACTTCCGCTCCGTT3’ 5’CTCCACCACGTCGCTCT3’GATA-2-C1 5’CTGCTCCCAGCTCTACTCCA3’ 5’GCCTTCTGAACAGGAACGAG3’GATA-2-C2 5’CACCTACCCCTCCTATGTGC3’ 5’ACGTCCATCTGTTCCCTAGC3’GATA-2-E1 5’ACACCTCGTGGTGGGACTT3’ 5’TTTTCAGCAGCTCGATTCCT3’GATA-2-E2 5’GTCCCTAGCTCTGCCTACCC3’ 5’CCTCTCCCAAGTCACAGCTC3’实施例2PCR产物纯化测序1、PCR产物纯化采用虾碱酶(Shrimp Alkaline Phosphatase，SAP)和外切酶(Exonuclease I)纯化PCR产物，反应体系为SAP 0.16μl，Exonuclease I 0.25μl，PCR产物50ng，加水补至总体积7μl；纯化反应程序37℃ 60min，80℃ 15min，4℃ forver。
2、PCR纯化产物测序采用ABI 3700 Automatic Sequencer(PEBiosystems)。对PCR片段进行测序1)-20℃冰箱中取出PCR纯化产物、MIX、0.8uM引物2)取96孔反应板，标上模板名(即PCR纯化产物名)、日期，用连续加样器逐一加入引物2ul，然后用12孔排枪加入模板2ul，最后用连续加样器逐一加入mix2ul于离心机上甩一下，达1300转/分左右即停。
3)PCR扩增(9700 of PE biosystem) 4)扩增结束后，用连续加样器加入70％乙醇(加入量与反应体系之比为9∶1)即50ul左右于室温进行沉淀，时间15分钟以上，不得超过24小时。
5)4000转/分，4℃离心30分钟。
6)轻轻倒去上清液，将96孔板倒置离心，达800转/分即停。
7)每孔加入10ul的loading buffer，2000转/分1min离心。
8)90℃变性2分钟，立即置冰上，待上样。
9)在ABI3700 Automatic Sequencer上进行电泳，3小时后机器自动分析输出结果。
实施例3突变位点的搜寻采用Polyphred软件搜寻突变位点。Polyphred软件会用各种颜色标示出可疑突变位点，不同颜色代表不同的可信程度，最终的确认需打开图形用肉眼来评定。对于丰度高的突变位点，软件识别的可靠性非常高，但对于低丰度的突变位点，如只有一个样本显示杂合的图形，就需要用肉眼根据评判标准来确定，去除由于测序不好造成的干扰。判断一个位点是否为突变位点，至少应满足下列一些条件1)显示杂合碱基两侧序列是可辨别的单峰，背景比较低；2)正反方向测序需一致，均为杂合子；3)将杂合个体与纯合个体测序图进行比较，在杂合个体的图中，碱基峰有明显的下降趋势。将含突变的序列与genebank上的序列比对，进一步确定突变位点。对于有插入或缺失的片断，有很特征的测序图——在杂合个体里，测序峰形会从插入或缺失位置开始变得很乱。此时可将PCR产物可隆到p-GEMT-easy载体中，然后转化大肠杆菌菌株JM109，挑单克隆测序。将所得序列与genebank上的序列比对，就可以得到具体的插入或缺失的序列。
实施例4突变型GATA-2功能研究1、质粒构建Flag-GATA-2/pCMV真核表达载体，CD34×2/Luc报告基因载体均由Tariq Enver教授惠赠。以Xho I和EcoR I为两端酶切位点，Flag-GATA-2/pCMV为模板，采用定向克隆方法和定点突变技术构建野生型GATA-2/pcDNA3.1和GATA-2L359V/pcDNA3.1突变真核表达载体。
2、细胞培养及细胞转染COS-7、293细胞以DMEM(GIBCO BRL)培养基加10％胎牛血清培养，K562细胞以1640培养基加10％胎牛血清培养。用Superfect(Qiagen)按厂家推荐的方法转染细胞。转染前一天，将2×104/ml细胞接种到六孔板上，待细胞达到70-80％贴壁后进行转染。转染前293细胞用PBS洗1次。先以SV40内对照(50ng/孔)加入无血清DMEM培养液660μl中，再加入报告基因载体CD34×2/Luc(100ng/孔)，最后分别加入野生型和突变型GATA-2真核表达载体(2μg/孔)和Superfect(2.5μl/孔)，充分混匀离心后静置15min，使复合物充分形成后再分别加入各培养孔。加入500μl培养液，5％CO2，37℃孵育2-3小时后加含有10％FBS的DMEM培养基1ml继续培养24小时进行报告基因的检测。电转K562细胞参照BIO-RAD公司操作手册进行。
3、荧光素酶(Luciferase)检测采用双荧光素酶报告基因检测系统(Promega)，按照推荐的方法，在荧光检测仪(Lumat LB9507)上测量荧光素酶活性。
4、GST融合蛋白表达及纯化将相应的GST-CBP、GST-HDAC1等融合蛋白表达质粒转化大肠杆菌BL-21菌株，挑取单克隆菌落接种于5ml含有氨苄青霉素(50mg/ml)的LB培养液中，37℃ 300rpm培养过夜。1∶100稀释到含有氨苄青霉素(50mg/ml)的2×YT中，30℃ 300rpm培养至OD600达到0.6-0.8。加入0.1M异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)使终浓度达到0.4-0.8mM，30℃诱导GST融合蛋白表达3小时。5000rpm离心5min，去上清，收集菌体，加入预冷的PBS混悬菌体。加入1M二硫苏糖醇(DTT)至最终浓度为5mM，加入10mg/ml的苯甲磺酰氟(PMSF)至最终浓度为100μg/ml。冰浴中超声裂解细胞成匀浆。然后加20％ TritonX-100至终浓度1％，冰浴30min。最后4℃ 12000rpm离心10min，转移上清，4℃再13000rpm离心10min，取上清，-80℃保存备用。如需纯化，直接按每一毫升上清中加入20μl 50％谷胱甘肽琼脂糖凝胶颗粒，4℃慢摇孵育过夜，用预冷的PBS洗6次，加入洗脱液(10mM还原谷胱甘肽，50mMTris(pH8.0))，4℃慢摇孵育4小时，离心取上清，-80℃保存备用。
5、GST pull-down拉下试验蛋白体外翻译分别以野生型GATA-2/pcDNA3.1和GATA-2L359V/pcDNA3.1突变真核表达载体为模板，采用体外转录翻译试剂盒(TNTQuick Coupled Transcription and TranslationKit，Progema)进行体外翻译，并用[35S]-蛋氨酸(1175Ci/mmol)对翻译产物进行标记，-80℃保存备用。取保存备用的含有GST融合蛋白的上清，解冻后按每一毫升上清中加入20μl 50％谷胱甘肽琼脂糖凝胶颗粒，4℃慢摇孵育60min。然后用500μl预冷的PBS洗涤3次，即得到纯化的GST融合蛋白。将结合了GST融合蛋白的琼脂糖凝胶颗粒重悬于200μl结合液中(0.5％NP40，20mM Tris(pH8.0)，100mM NaCl，1mM EDTA)，再加入一定量体外翻译产物，4℃孵育2小时后用400μl结合液洗涤3次，加蛋白上样缓冲液后煮沸变性。10％SDS-PAGE电泳，抽干胶后放射自显影。
6、Gel shift蛋白体外翻译同上。翻译同时以S35标蛋氨酸为阳性对照。按Santa Cruz公司提供的序列合成了用于Gel shift实验的GATA探针。探针序列为sense 5’--CAC TTG ATA ACA GAA AGT GAT AAC TCT--3’antisense 5’--AGA GTT ATC ACT TTC TGT TAT CAA GTG--3’使用-P32ATP进行末端核苷酸标记，复性后用MicroSpinG-25(Armersham Pharmacia)纯化探针。未标记探针经复性直接得到。体外翻译蛋白和探针室温孵育30分钟，6％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，电溶液为0.5×TBE。在竞争反应中分别加入10倍和100倍未标记探针；Supershift试验加入pcDNA3.1载体His-tag抗体。
实施例5检测慢性粒细胞性白血病急变的主效基因之一GATA-2突变基因的试剂盒及其应用。
1、试剂盒含有1)扩增引物引物名称上游引物序列 下游引物序列AML-1-C15’CCCCGCAGTAATAAAGG3’5’GCTCTGTGGTAGGTGGC3’AML-1-C25’ATGGCTGGCAATGATGAA3’ 5’AGGGTTAAAGGCAGTGGAGT3’AML-1-C35’ACAGCCATGAGGGTCAGC3’ 5’GCCGTAGTACAGGTGGTAGG3’AML-1-C45’CCAGCGGCATGACAACC3’5’CCTCAGTAGGGCCTCCACA3’AML-1-E25’AGGGTCCTAACTCAATCGGCTT3’ 5’CAACACAGCATCCCCCACATCC3’AML-1-E35’CCGAGTTTCTAGGGATTCCA3’ 5’CCGAGTTTCTAGGGATTCCA3’AML-1-E45’AAATTCCGGGAGTGTTGTCA3’ 5’GCAACTTTTTGGCTTTACGG3’AML-1-E55’TGATCTCTTCCCTCCCTCCT 5’CAGGTGGTGCTGTTGGTTC3’AML-1-E65’ATTTGAACAAGGGCCACTCA3’ 5’GGGCATGGGACTCAGAGTAG3’AML-1-E75’CTCACTTCCGCTCCGTT3’ 5’CTCCACCACGTCGCTCT3’GATA-2-C1 5’CTGCTCCCAGCTCTACTCCA3’ 5’GCCTTCTGAACAGGAACGAG3’GATA-2-C2 5’CACCTACCCCTCCTATGTGC3’ 5’ACGTCCATCTGTTCCCTAGC3’GATA-2-E1 5’ACACCTCGTGGTGGGACTT3’ 5’TTTTCAGCAGCTCGATTCCT3’GATA-2-E2 5’GTCCCTAGCTCTGCCTACCC3’ 5’CCTCTCCCAAGTCACAGCTC3’2)Taq DNA聚合酶(5U/μl)。Taq DNA聚合酶储存于20mM Tris-HCl，pH8.0；0.1mM EDTA；1mM DTT，0.5％NP-40，0.5％Tween20，50％glycerol，100mM KCl缓冲液中。-20℃保存一年以上。
3)10×反应缓冲液。10×反应缓冲液组成成分为KCl500mM；Tris-HCl200mM(pH9.0)；Triton X-100 1％；MgCl2 20Mm。
4)dNTP(10mM/L)2、使用方法A提取总RNA，逆转录成cDNA，在突变位点附近设计PCR引物，进行PCR扩增；BPCR反应产物经直接纯化后直接测序，将所得序列于genebank上的序列比对，确定突变位点。
进一步包括如下步骤C按正常读码框架进行翻译以确定GATA-2基因的突变位点。
实施例6检测慢性粒细胞性白血病急变的主效基因之一AML-1突变基因的试剂盒及其应用。
1、试剂盒含有1)扩增引物引物名称上游引物序列 下游引物序列AML-1-C15’CCCCGCAGTAATAAAGG3’ 5’GCTCTGTGGTAGGTGGC3’AML-1-C25’ATGGCTGGCAATGATGAA3’ 5’AGGGTTAAAGGCAGTGGAGT3’AML-1-C35’ACAGCCATGAGGGTCAGC3’ 5’GCCGTAGTACAGGTGGTAGG3’AML-1-C45’CCAGCGGCATGACAACC3’ 5’CCTCAGTAGGGCCTCCACA3’AML-1-E25’AGGGTCCTAACTCAATCGGCTT3’ 5’CAACACAGCATCCCCCACATCC3’AML-1-E35’CCGAGTTTCTAGGGATTCCA3’ 5’CCGAGTTTCTAGGGATTCCA3’AML-1-E45’AAATTCCGGGAGTGTTGTCA3’ 5’GCAACTTTTTGGCTTTACGG3’AML-1-E55’TGATCTCTTCCCTCCCTCCT5’CAGGTGGTGCTGTTGGTTC3’AML-1-E65’ATTTGAACAAGGGCCACTCA3’ 5’GGGCATGGGACTCAGAGTAG3’AML-1-E75’CTCACTTCCGCTCCGTT3’ 5’CTCCACCACGTCGCTCT3’GATA-2-C1 5’CTGCTCCCAGCTCTACTCCA3’ 5’GCCTTCTGAACAGGAACGAG3’GATA-2-C2 5’CACCTACCCCTCCTATGTGC3’ 5’ACGTCCATCTGTTCCCTAGC3’GATA-2-E1 5’ACACCTCGTGGTGGGACTT3’ 5’TTTTCAGCAGCTCGATTCCT3’GATA-2-E2 5’GTCCCTAGCTCTGCCTACCC3’ 5’CCTCTCCCAAGTCACAGCTC3’2)Taq DNA聚合酶(5U/μl)。Taq DNA聚合酶储存于20mM Tris-HCl，pH8.0；0.1mM EDTA；1mM DTT，0.5％NP-40，0.5％Tween20，50％glycerol，100mM KCl缓冲液中。-20℃保存一年以上。
3)10×反应缓冲液。10×反应缓冲液组成成分为KCl500mM；Tris-HCl200mM(pH9.0)；Triton X-100 1％；MgCl2 20Mm。
4)dNTP(10mM/L)2、使用方法A提取总RNA，逆转录成cDNA，在突变位点附近设计PCR引物，进行PCR扩增；BPCR反应产物经直接纯化后直接测序，将所得序列于genebank上的序列比对，确定突变位点。
进一步包括如下步骤C按正常读码框架进行翻译以确定AML-1基因的突变位点。
实施例7检测慢性粒细胞性白血病急变的主效基因之一GATA-2突变位点L359V的试剂盒及其应用。
1、试剂盒含有1)GATA-2-C1上游引物序列5’CTGCTCCCAGCTCTACTCCA3’下游引物序列5’GCCTTCTGAACAGGAACGAG3’。
2)Taq DNA聚合酶(5U/μl)。Taq DNA聚合酶储存于20mM Tris-HCl，pH8.0；0.1mM EDTA；1mM DTT，0.5％NP-40，0.5％Tween20，50％glycerol，100mM KCl缓冲液中。-20℃保存一年以上。
3)10×反应缓冲液。10×反应缓冲液组成成分为KCl500mM；Tris-HCl200mM(pH9.0)；Triton X-100 1％；MgCl2 20Mm。
4)dNTP(10mM/L)2、使用方法
A提取总RNA，逆转录成cDNA，在突变位点附近设计PCR引物，进行PCR扩增；BPCR反应产物经直接纯化后直接测序，将所得序列于genebank上的序列比对，确定突变位点。
进一步包括如下步骤C按正常读码框架进行翻译以确定GATA-2基因的突变位点。
实施例8检测慢性粒细胞性白血病急变的主效基因之一GATA-2突变位点A341-G346 del的试剂盒及其应用。
1、试剂盒含有1)GATA-2-C2上游引物序列5’CACCTACCCCTCCTATGTGC3’下游引物序列5’ACGTCCATCTGTTCCCTAGC3’。
2)Taq DNA聚合酶(5U/μl)。Taq DNA聚合酶储存于20mM Tris-HCl，pH8.0；0.1mM EDTA；1mM DTT，0.5％ NP-40，0.5％ Tween20，50％glycerol，100mM KCl缓冲液中。-20℃保存一年以上。
3)10×反应缓冲液。10×反应缓冲液组成成分为KCl 500mM；Tris-HCl200mM(pH9.0)；Triton X-100 1％；MgCl2 20Mm。
4)dNTP(10mM/L)2、使用方法A提取总RNA，逆转录成cDNA，在突变位点附近设计PCR引物，进行PCR扩增；
BPCR反应产物可隆到p-GEMT-easy载体中，然后转化大肠杆菌菌株JM109，挑单克隆测序，将所得序列于genebank上的序列比对，确定突变位点。
进一步包括如下步骤C按正常读码框架进行翻译以确定GATA-2基因的突变位点。
实施例9检测慢性粒细胞性白血病急变的主效基因之一AML-1突变位点C1812A的试剂盒及其应用。
1、试剂盒含有1)AML-1-C1上游引物序列5’CCCCGCAGTAATAAAGG3’下游引物序列5’GCTCTGTGGTAGGTGGC3’2)Taq DNA聚合酶(5U/μl)。Taq DNA聚合酶储存于20mM Tris-HCl，pH8.0；0.1mM EDTA；1mM DTT，0.5％NP-40，0.5％Tween20，50％glycerol，100mM KCl缓冲液中。-20℃保存一年以上。
3)10×反应缓冲液。10×反应缓冲液组成成分为KCl500mM；Tris-HCl200mM(pH9.0)；Triton X-100 1％；MgCl2 20Mm。
4)dNTP(10mM/L)2、使用方法A提取总RNA，逆转录成cDNA，在突变位点附近设计PCR引物，进行PCR扩增；BPCR反应产物经直接纯化后直接测序，将所得序列于genebank上的序列比对，确定突变位点。
进一步包括如下步骤C按正常读码框架进行翻译以确定AML-1基因的突变位点。
实施例10检测慢性粒细胞性白血病急变的主效基因之一AML-1突变位点R293X的试剂盒及其应用。
1、试剂盒含有1)AML-1-C3上游引物序列5’ACAGCCATGAGGGTCAGC3’下游引物序列5’GCCGTAGTACAGGTGGTAGG3’2)Taq DNA聚合酶(5U/μl)。Taq DNA聚合酶储存于20mM Tris-HCl，pH8.0；0.1mM EDTA；1mM DTT，0.5％NP-40，0.5％Tween20，50％glycerol，100mM KCl缓冲液中。-20℃保存一年以上。
3)10×反应缓冲液。10×反应缓冲液组成成分为KCl500mM；Tris-HCl200mM(pH9.0)；Triton X-100 1％；MgCl2 20Mm。
4)dNTP(10mM/L)2、使用方法A提取总RNA，逆转录成cDNA，在突变位点附近设计PCR引物，进行PCR扩增；BPCR反应产物经直接纯化后直接测序，将所得序列于genebank上的序列比对，确定突变位点。
进一步包括如下步骤
C按正常读码框架进行翻译以确定AML-1基因的突变位点。
实施例11含GATA-2或AML-1突变的慢性粒细胞性白血病加速期或急变期患者的临床资料。见表2AP加速期；del缺失；ins插入；fs移码突变；ter终止.My原始粒细胞；Mo原始单核细胞；Promo幼单核细胞；Promy早幼粒细胞；E嗜酸细胞.所有患者都有BCR-ABL融合基因。有GATA-2突变的患者疾病进程相对凶险，主要向粒单系方向急变；含AML-1突变的患者疾病进程相对缓慢，主要向粒系方向急变。大部分患者急变前后没有染色体的改变。
表2
权利要求
1.一种慢性粒细胞性白血病急变的主效基因之一AML-1突变基因，其中所述AML-1突变基因至少一个突变位点位于1788delC、C1812A、G1815C、C1993G、A2090G、G2099A、C2455T、2356-2357insCAAT、1849delG、2718-2722delCGGCG。
2.根据权利要求1所述的AML-1突变基因，其编码氨基酸至少一个突变位点位于AML-1的runt同源盒结构域、辅助抑制因子Ear-2的结合位点、转录激活结构域、转录抑制结构域。
3.根据权利要求1所述的AML-1突变基因，其编码氨基酸至少一个突变位点位于L71fs-ter94、H78Q、W79C、R139G、D171G、R174Q、R293X、Y260fs-ter573、V91fs-ter94、G381fs-ter570。
4.一种检测慢性粒细胞性白血病急变的主效基因之一AML-1突变基因的试剂盒，其包括扩增引物，dNTP，用于PCR反应的DNA聚合酶及其缓冲液的一种或多种，所述扩增引物选自AML-1-C1、AML-1-C2、AML-1-C3、AML-1-C4、AML-1-E2、AML-1-E3、AML-1-E4、AML-1-E5、AML-1-E6、AML-1-E7。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于扩增引物AML-1-C1上游引物序列5’CCCCGCAGTAATAAAGG3’下游引物序列5’GCTCTGTGGTAGGTGGC3’。
6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于扩增引物AML-1-C2上游引物序列5’ATGGCTGGCAATGATGAA3’下游引物序列5’AGGGTTAAAGGCAGTGGAGT3’。
7.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于扩增引物AML-1-C3上游引物序列5’ACAGCCATGAGGGTCAGC3’下游引物序列5’GCCGTAGTACAGGTGGTAGG3’。
8.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于扩增引物AML-1-C4上游引物序列5’CCAGCGGCATGACAACC3’下游引物序列5’CCTCAGTAGGGCCTCCACA3’。
9.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于扩增引物AML-1-E2上游引物序列5’AGGGTCCTAACTCAATCGGCTT3’下游引物序列5’CAACACAGCATCCCCCACATCC3’。
10.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于扩增引物AML-1-E3上游引物序列5’CCGAGTTTCTAGGGATTCCA3’下游引物序列5’CCGAGTTTCTAGGGATTCCA3’。
11.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于扩增引物AML-1-E4上游引物序列5’AAATTCCGGGAGTGTTGTCA3’下游引物序列5’GCAACTTTTTGGCTTTACGG3’。
12.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于扩增引物AML-1-E5上游引物序列5’TGATCTCTTCCCTCCCTCCT下游引物序列5’CAGGTGGTGCTGTTGGTTC3’。
13.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于扩增引物AML-1-E6上游引物序列5’ATTTGAACAAGGGCCACTCA3’下游引物序列5’GGGCATGGGACTCAGAGTAG3’。
14.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于扩增引物AML-1-E7上游引物序列5’CTCACTTCCGCTCCGTT3’下游引物序列5’CTCCACCACGTCGCTCT3’。
15.根据权利要求1所述的AML-1突变基因在慢性粒细胞性白血病急变的早期检测和/或治疗方法中的应用。
16.根据权利要求4-14任一权利要求所述的试剂盒在慢性粒细胞性白血病急变的早期检测和/或治疗方法中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种慢性粒细胞性白血病急变主效基因之一AML－1突变基因及其应用；本发明同时涉及检测慢性粒细胞性白血病急变的主效基因之一AML－1突变基因的试剂盒及其应用。本发明将AML－1基因与慢性粒细胞性白血病急变患者的药物治疗联系起来，可以发明作用于这些靶点的药物来治疗慢性粒细胞性白血病急变患者，为慢性粒细胞性白血病急变患者的新药研发提供理论依据。
文档编号C12N15/11GK1683557SQ20051002384
公开日2005年10月19日 申请日期2005年2月4日 优先权日2005年2月4日
发明者陈赛娟, 陈竺, 李国 , 施静艺, 顾柏炜, 张苏江, 高晓东 申请人:上海第二医科大学附属瑞金医院