专利名称：植物细胞简易硅橡胶膜生物反应瓶培养系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及的是一种生物技术领域的设备，具体是一种植物细胞简易硅橡胶膜生物反应瓶培养系统。
背景技术：
植物细胞能合成许多具有重要价值的次级代谢产物，包括药用活性物质、食品添加剂、杀虫剂、饲料、精细化工产品等。利用生物反应器大规模悬浮培养植物细胞生产植物有用代谢产物在近年来取得了很大发展，反应器的设计和研制一般借鉴微生物培养罐，在该研究领域的早期，甚至直接使用类似发酵罐的装置器培养植物细胞。但是，植物细胞比微生物细胞大，单个细胞的直径大约处于20～100μm之间。它们被一层刚性的纤维底物所包围，而且通常具有一个很大的液泡，它可占细胞体积的95％以上。这些性质表明植物细胞对剪切力非常敏感，在外界一定程度的剪切力作用下容易受到影响，具体表现为细胞形态改变、胞内化合物释放、代谢和产率的改变以及细胞活性的丧失等。所以，在反应器研制方面，尽量设计剪切力小的培养装置，近年来，气升式生物反应器在植物细胞培养的应用中日益广泛，但通气产生的流体剪切力对植物细胞依旧有一定损伤，而且，无论是自氧还是异氧培养方式，通气都是必须的，通气在一定程度上可以提高细胞生长和代谢的速率。在动物细胞培养中，往往采用无泡膜的培养方式，即采用一种由聚硅氧烷材料制成的硅橡胶管状膜，这种均相致密无孔膜对气体分子有很好的通透性，可以减少气泡对细胞的剪切损伤。
经对现有技术文献的检索发现，Chao-Chien Chang等人在《BioresourceTechnology》2003，90(3)323-328上发表的“Reductive dechlorination of2-chlorophenol in a hydrogenotrophic，gas-permeable，silicone membranebioreactor”(氢气通透的硅橡胶膜生物反应器中2-氯酚的还原性去氯化反应，《生物资源技术》)一文中，提出了一种膜生物反应器，该系统由氢气罐、气体流量计、循环水浴锅、反应罐、硅橡胶管状膜(其上覆盖有生物膜)、磁力搅拌装置、人造废液缸和蠕动泵组成。其中氢气罐中的氢气通过气体流量计直接进入管状膜腔内，由于该硅橡胶管对气体有高通透性，而且表面积很大，使氢气大量扩散至紧贴在管状膜外表面的生物膜上，该生物膜上含有一种能促进氢气和废液中的氯酚反应从而降低废液毒性的微生物。硅橡胶管状膜的使用，很好地解决了氢气在液体内低溶解性的问题。但是反应罐和用于固定硅橡胶管的装置在设计和制作上都比较复杂，制作成本也相对较高，不利于无泡膜供气培养方式，限制了这种有效降低气泡剪切损伤的培养方式在细胞培养方面的应用和推广。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种植物细胞简易硅橡胶膜生物反应瓶培养系统，使其在扩大现有技术用途的同时，大大降低现有技术中硅橡胶膜生物反应器培养系统的构建成本，从而使低剪切力的植物细胞培养用生物反应器更平民化和常规化，同时为大型硅橡胶膜生物反应器培养系统的设计提供借鉴和参考。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明包括气泵、气体滤器、温控培养箱、气体流量计、气体增湿装置、硅橡胶膜生物反应瓶、硅胶输气管、磁力搅拌子、磁力搅拌器。所述的气体增湿装置主体是圆柱型半球顶玻璃容器，其顶部整合有第一进气接口和第一出气接口，第一进气接口伸入容器内近底部处；除了气泵和气体滤器外，其它部件均位于温控培养箱内部，磁力搅拌子置于硅橡胶膜生物反应瓶内底部，磁力搅拌器位于硅橡胶膜生物反应瓶外底部，气泵、气体滤器、气体流量计、第一进气接口、第一出气接口间通过硅胶输气管依次相连。
所述的硅橡胶膜生物反应瓶，包括锥形瓶、橡胶塞、第二进气接口、第二出气接口、管状膜缠绕架、硅橡胶管状膜，其连接方式为第二进气接口、第二出气接口、管状膜缠绕架均插于橡胶塞上，硅橡胶管状膜一端和第二进气接口相连，管身缠绕在管状膜缠绕架上，直至硅橡胶管状膜另一端和第二出气接口相连；该已插有第二进气接口、第二出气接口和管状膜缠绕架及其上硅橡胶膜的橡胶塞再将锥形瓶瓶口密闭，从而构成了整套硅橡胶膜生物反应瓶。
所述的第二进气接口和第二出气接口，为一次性无菌注射器的不含针尖和内筒的外筒部分，第二进气接口和第二出气接口顺着针筒方向由橡胶塞横截面大的方向插入该已打两个孔的橡胶塞中。
所述的管状膜缠绕架，由含长方形状凹槽的“土”字形和“工”字形两块有机玻璃片交错插合而成，两块有机玻璃片厚度均为5mm，“土”字形有机玻璃片由上下两部分构成，上下部分等长，“工”字形有机玻璃片的形状结构与“土”字形有机玻璃片下半部分完全一致。“土”字形有机玻璃片，其上半部分又均分为两部分，两部分也等长，从正面看由上至下依次为等腰三角形和第一长方形，该等腰三角形的底边和高分别为4mm和50mm，第一长方形的长和宽分别为50mm和10mm。“土”字形有机玻璃片，其下半部分，从正面看是中下部含凹槽，四边含突角的不规则长方形，该第二长方形的长和宽分别为100mm和24mm，凹槽位于第二长方形正中下部，该凹槽的长和宽分别为50mm和5mm，第二长方形的四个突角均为边长为3mm的正方形。由于“土”字形有机玻璃片其下半部分形状结构与“工”字形有机玻璃片完全一致，将两者的凹槽部分对准相插，即得俯视为“十”字形、上部含尖角、下部为“十”字立体结构且含有八个突角的管状膜缠绕架，该管状膜缠绕架顶部，即“土”字形有机玻璃片的顶部等腰三角形部分，从橡胶塞横截面小的部分插入橡胶塞中。
所述的硅橡胶管状膜，为内外径和长度分别为3mm、4mm和2.5m的硅橡胶管，其一端和已固定在橡胶塞上的第二进气接口相连，管身一圈一圈紧密缠绕在管状膜缠绕架下部“十”字立体结构上，八个突角可固定硅橡胶管状膜，当硅橡胶管状膜缠绕至管状膜缠绕架最底端时，将硅橡胶管状膜从管状膜缠绕架下部立体结构的空隙出穿至管状膜缠绕架上部，并和已固定在橡胶塞上的第二出气接口相连。
本发明工作前，先将硅胶输气管、气体滤器、气体增湿装置和锥形瓶进行高温灭菌、再在超净工作台上将磁力搅拌子、气体流量计，和整合有第二进气接口、第二出气接口、管状膜缠绕架及其上硅橡胶管状膜的橡胶塞用75％酒精浸泡后吹干，并进行紫外杀菌，然后继续在超净工作台上将待培养的植物细胞及培养液接种入锥形瓶中，放入磁力搅拌子，瓶口紧密插入上述已进行紫外杀菌的橡胶塞，然后再将各装置依次搭建好，打开空气泵，调节气体流量计和磁力搅拌器，获得适合相应的植物细胞培养的气流量和搅拌速率。定期至超净工作台上取样，测定培养液内氮磷浓度、pH值、细胞的生物量浓度，同时用TrypanBlue染色法计算细胞的存活率，以获得培养植物细胞的生长情况和消耗营养的情况。
用本发明研究培养大型褐藻海带配子体细胞，发现当起始接种密度为50mgDCWL-1，培养液为改良的APSW人工海水搅拌速率选择100rpm，通气速率为100mL min-1，培养温度为13℃时，该套无泡供气的简易硅橡胶膜生物反应器培养系统在经过45天培养周期后，令藻体细胞比生长速率达0.0772d-1，最大生物量为576.1mg DCW L-1，生物量扩增倍数达14.4倍，而且，用Trypan Blue显色法验证了该培养方法下细胞存活率高达98.2％，而传统的鼓泡培养法，细胞存活率仅70％左右。可见，本发明植物细胞简易硅橡胶膜生物反应瓶培养系统对于受剪切力敏感的植物细胞的扩增非常有效，最重要的是本发明简单设计可以大大提高无泡膜培养方式在植物细胞培养中的应用面和应用度，而且还可为工业规模的膜生物反应器的设计提供借鉴。
图1为本发明结构示意2为本发明硅橡胶膜生物反应瓶结构示意3为本发明管状膜缠绕架“土”字形有机玻璃片结构示意4为本发明管状膜缠绕架“工”字形有机玻璃片结构示意图具体实施方式
如图1、2、3、4所示，本发明包括气泵1、气体滤器2、温控培养箱3、气体流量计4、气体增湿装置5、硅橡胶膜生物反应瓶6、硅胶输气管7、磁力搅拌子8、磁力搅拌器9。气体增湿装置5主体是圆柱型半球顶玻璃容器，其顶部整合有第一进气接口10和第一出气接口11，第一进气接口10伸入圆柱型半球顶玻璃容器内近底部处，气体流量计4、气体增湿装置5、硅橡胶膜生物反应瓶6、硅胶输气管7、磁力搅拌子8、磁力搅拌器9均位于温控培养箱3内部，磁力搅拌子8置于硅橡胶膜生物反应瓶6内底部，磁力搅拌器9位于硅橡胶膜生物反应瓶6外底部，气泵1、气体滤器2、气体流量计4、第一进气接口10、第一出气接口11间通过硅胶输气管7依次相连。
所述的硅橡胶膜生物反应瓶6，包括500mL锥形瓶12、橡胶塞13、第二进气接口14、第二出气接口15、管状膜缠绕架16、硅橡胶管状膜17，其连接方式为第二进气接口14、第二出气接口15、管状膜缠绕架16均插于橡胶塞13上，硅橡胶管状膜17一端和第二进气接口14相连，管身缠绕在管状膜缠绕架16上，直至硅橡胶管状膜17另一端和第二出气接口15相连；该已插有第二进气接口14、第二出气接口15和管状膜缠绕架16及其上硅橡胶膜17的橡胶塞13再将500mL锥形瓶12瓶口密闭，从而构成了整套硅橡胶膜生物反应瓶6。
所述的第二进气接口14和第二出气接口15，即为1mL一次性无菌注射器的不含针尖和内筒的外筒部分，第二进气接口14和第二出气接口15顺着针筒方向由橡胶塞13横截面大的方向插入该已打两个孔的橡胶塞13中。
所述的管状膜缠绕架16，由含长方形状凹槽的“土”字形和“工”字形两块有机玻璃片交错插合而成，两块有机玻璃片厚度均为5mm，“土”字形有机玻璃片由上下两部分构成，上下部分等长，“工”字形有机玻璃片的形状结构与“土”字形有机玻璃片下半部分完全一致。“土”字形有机玻璃片，其上半部分又均分为两部分，两部分也等长，从正面看由上至下依次为等腰三角形18和第一长方形19，该等腰三角形18的底边和高分别为4mm和50mm，第一长方形19的长和宽分别为50mm和10mm。“土”字形有机玻璃片，其下半部分，从正面看是中下部含凹槽20，四边含突角21的不规则长方形22，该第二长方形22的长和宽分别为100mm和24mm，凹槽20位于第二长方形22正中下部，该凹槽20的长和宽分别为50mm和5mm，第二长方形22的四个突角21均为边长为3mm的正方形。由于“土”字形有机玻璃片其下半部分形状结构与“工”字形有机玻璃片完全一致，将两者的凹槽20部分对准相插，即得俯视为“十”字形、上部含尖角、下部为“十”字立体结构且含有八个突角21的管状膜缠绕架16，该管状膜缠绕架16顶部，即“土”字形有机玻璃片的顶部等腰三角形18部分，从橡胶塞13横截面小的部分插入橡胶塞13中。
所述的硅橡胶管状膜17，为内外径和长度分别为3mm、4mm和2.5m的硅橡胶管，其一端和已固定在橡胶塞13上的第二进气接口14相连，管身一圈一圈紧密缠绕在管状膜缠绕架16下部“十”字立体结构上，8个突角23可固定硅橡胶管状膜17，当硅橡胶管状膜17缠绕至管状膜缠绕架16最底端时，将硅橡胶管状膜17从管状膜缠绕架16下部立体结构的空隙出穿至管状膜缠绕架16上部，并和已固定在橡胶塞13上的第二出气接口15相连。
权利要求
1.一种植物细胞简易硅橡胶膜生物反应瓶培养系统，包括气泵(1)、气体流量计(4)、硅橡胶膜生物反应瓶(6)、硅胶输气管(7)、磁力搅拌子(8)、磁力搅拌器(9)，其特征在于，还包括气体滤器(2)、温控培养箱(3)、气体增湿装置(5)，气体增湿装置(5)主体是圆柱型半球顶玻璃容器，其顶部整合有第一进气接口(10)和第一出气接口(11)，第一进气接口(10)伸入圆柱型半球顶玻璃容器内近底部处，气体流量计(4)、气体增湿装置(5)、硅橡胶膜生物反应瓶(6)、硅胶输气管(7)、磁力搅拌子(8)、磁力搅拌器(9)均位于温控培养箱(3)内部，磁力搅拌子(8)置于硅橡胶膜生物反应瓶(6)内底部，磁力搅拌器(9)位于硅橡胶膜生物反应瓶(6)外底部，气泵(1)、气体滤器(2)、气体流量计(4)、第一进气接口(10)、第一出气接口(11)间通过硅胶输气管(7)依次相连。
2.根据权利要求1所述的植物细胞简易硅橡胶膜生物反应瓶培养系统，其特征是，所述的硅橡胶膜生物反应瓶(6)，包括锥形瓶(12)、橡胶塞(13)、第二进气接口(14)、第二出气接口(15)、管状膜缠绕架(16)、硅橡胶管状膜(17)，第二进气接口(14)、第二出气接口(15)、管状膜缠绕架(16)均插于橡胶塞(13)上，硅橡胶管状膜(17)一端和第二进气接口(14)相连，其管身缠绕在管状膜缠绕架(16)上，直至硅橡胶管状膜(17)另一端和第二出气接口(15)相连，锥形瓶(12)瓶口通过橡胶塞(13)密闭。
3.根据权利要求2所述的植物细胞简易硅橡胶膜生物反应瓶培养系统，其特征是，所述的第二进气接口(14)和第二出气接口(15)，为一次性无菌注射器的外筒部分，橡胶塞(13)上设两个孔，第二进气接口(14)和第二出气接口(15)顺着针筒方向由橡胶塞(13)横截面大的方向插入该两个孔中，气泵(1)、气体滤器(2)、气体流量计(4)、第一进气接口(10)、第一出气接口(11)、第二进气接口(14)、第二出气接口(15)间通过硅胶输气管(7)依次相连。
4.根据权利要求2所述的植物细胞简易硅橡胶膜生物反应瓶培养系统，其特征是，所述的管状膜缠绕架(16)，由含长方形状凹槽的“土”字形和“工”字形两块有机玻璃片交错插合而成，两块有机玻璃片厚度均为5mm，“土”字形有机玻璃片由上下两部分构成，上下部分等长，“工”字形有机玻璃片的形状结构与“土”字形有机玻璃片下半部分完全一致。
5.根据权利要求4所述的植物细胞简易硅橡胶膜生物反应瓶培养系统，其特征是，所述的“土”字形有机玻璃片，其上半部分又均分为两部分，两部分也等长，从正面看由上至下依次为等腰三角形(18)和第一长方形(19)，该等腰三角形(18)的底边和高分别为4mm和50mm，第一长方形(19)的长和宽分别为50mm和10mm。
6.根据权利要求4或者5所述的植物细胞简易硅橡胶膜生物反应瓶培养系统，其特征是，所述的“土”字形有机玻璃片，其下半部分，从正面看是中下部含凹槽(20)、四边含突角(21)的第二长方形(22)，凹槽(20)位于第二长方形(22)正中下部。
7.根据权利要求6所述的植物细胞简易硅橡胶膜生物反应瓶培养系统，其特征是，第二长方形(22)的长和宽分别为100mm和24mm，凹槽(20)的长和宽分别为50mm和5mm，四个突角(21)均为边长为3mm的正方形。
8.根据权利要求4或者5或者6所述的植物细胞简易硅橡胶膜生物反应瓶培养系统，其特征是，所述的“土”字形有机玻璃片，其下半部分形状结构与“工”字形有机玻璃片完全一致，将两者的凹槽(20)对准相插，即得俯视为“十”字形、上部含尖角、下部为“十”字立体结构且含有八个突角(21)的管状膜缠绕架(16)，该管状膜缠绕架(16)顶部，即“土”字形有机玻璃片的等腰三角形(18)部分，从橡胶塞(13)横截面小的部分插入橡胶塞(13)中。
9.根据权利要求2所述的植物细胞简易硅橡胶膜生物反应瓶培养系统，其特征是，所述的硅橡胶管状膜(17)，其一端和第二进气接口(14)相连，管身一圈一圈紧密缠绕在管状膜缠绕架(16)下部“十”字立体结构上，八个突角(23)固定硅橡胶管状膜(17)，当硅橡胶管状膜(17)缠绕至管状膜缠绕架(16)最底端时，硅橡胶管状膜(17)从管状膜缠绕架(16)下部立体结构的空隙穿出至管状膜缠绕架(16)上部，并和第二出气接口(15)相连。
10.根据权利要求9所述的植物细胞简易硅橡胶膜生物反应瓶培养系统，其特征是，所述的硅橡胶管状膜(17)，为内外径和长度分别为3mm、4mm和2.5m的硅橡胶管。
全文摘要
一种植物细胞简易硅橡胶膜生物反应瓶培养系统，用于植物细胞工程技术领域。本发明包括气泵、气体滤器、温控培养箱、气体流量计、气体增湿装置、硅橡胶膜生物反应瓶、硅胶输气管、磁力搅拌子、磁力搅拌器。气体增湿装置主体是圆柱型半球顶玻璃容器，其顶部整合有第一进气接口和第一出气接口，第一进气接口伸入容器内近底部处；除了气泵和气体滤器外，其它部件均位于温控培养箱内部，磁力搅拌子置于硅橡胶膜生物反应瓶内底部，磁力搅拌器位于硅橡胶膜生物反应瓶外底部，气泵、气体滤器、气体流量计、第一进气接口、第一出气接口间通过硅胶输气管依次相连。本发明扩大了现有技术用途，大大降低构建成本，使低剪切力生物反应器更平民化和常规化。
文档编号C12M1/00GK1737105SQ20051002821
公开日2006年2月22日 申请日期2005年7月28日 优先权日2005年7月28日
发明者陈思晔, 齐瀚实, 张宝红, 黄娜 申请人:上海交通大学