专利名称：一种从骨髓中分离血管内皮前体细胞并在体外培养的方法
技术领域：
本发明涉及一种细胞分离并培养的方法，尤其是一种从骨髓中分离血管内皮前体细胞并在体外培养的方法。
背景技术：
自体骨髓来源的干/祖细胞因可以大量增殖，不易老化，体外诱导可多向分化，是近年来细胞移植及组织工程等领域的研究热点。体内骨髓干/祖细胞生物活性的维持是通过一系列复杂因素调节，例如存在于骨髓的EPCs与造血干细胞和骨髓基质细胞有着密切的联系。骨髓内造血干细胞、分化的成骨细胞和破骨细胞分泌多种促血管生成因子，如VEGF促进骨髓EPCs增殖、补充和动员。骨髓内间质干细胞可作为EPCs和造血干细胞的滋养细胞。因此如何模拟体内环境，探索最佳体外诱导培养条件，是解决细胞体外扩增的关键。目前的相关研究对此尚无统一结论，各种方法及培养体系均有报道，但仍不能解决细胞在短时间内大量扩增以满足临床应用需要的矛盾。
血管内皮前体细胞(EPCs)又称内皮干细胞，是近年发现的一类能自我更新、增殖分化为内皮细胞的定向干细胞。成年机体外周血液和骨髓中以及脐血中存在少量的血管内皮前体细胞。这些少量存在于体循环中的血管内皮前体细胞可在局部聚集并分裂、增殖及分化，在缺血组织内形成新生血管-出生后血管。这一过程对缺血性心血管疾病的治疗有重要意义。应用血管内皮前体细胞移植治疗缺血性心血管疾病将是一种有前途的治疗方法。
然而，外周血中血管内皮前体细胞存在的数量极其有限。文献报道利用传统方法体外培养、扩增血管内皮前体细胞的得率为5.0×106/100ml外周血，而动物实验显示能改善缺血部位循环所需移植的血管内皮前体细胞的数量至少为0.5～2.0×104/克体重。因此粗略的估计，为达到治疗人体下肢缺血的目的，至少需要12L外周血用于分离获得血管内皮前体细胞，这显然是达不到的。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种从骨髓中分离血管内皮前体细胞并在体外培养的方法，采用该方法，能够在短时间内获得足够量的血管内皮前体细胞，以克服现有技术的不足。
本发明解决技术问题是通过以下的技术方案来实现的一种从骨髓中分离血管内皮前体细胞并在体外培养的方法，其特征在于包括以下步骤1、收获骨髓细胞用注射器吸取含100IU/ml肝素的EBM-2培养液，通过针头注入骨髓腔，收集冲洗出来的骨髓，将收获的骨髓用注射器反复吹打成细胞悬液；以1000rpm的速度离心洗涤5分钟，去除上层脂肪及组织液，收集管底细胞；2、收集单个核细胞全骨髓细胞吹打均匀，用滴管轻轻滴加到密度为1.083g/ml的histopaque-1083分离液上，以2200rpm的速度离心20min，取界面层的单个核细胞，培养液两次洗涤；3、制备EBM-2细胞培养液在含10％胎牛血清的EBM-2细胞培养液中加入2ng/ml的bFGF和10ng/ml的VEGF生长因子；4、细胞原代培养将骨髓单个核细胞以5×106/cm2接种培养皿，加入上述EBB-2细胞培养液，置入37℃、5％CO2的培养箱内进行培养，48hrs后首次换液，去除悬浮细胞，后每2-3d换液一次；5、细胞传代培养待细胞长至80％融合状态时，用0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA液消化，再用含FBS的EBM-2基本培养液中止消化，洗涤后计数，按1∶3比例传代，置于含CO2的培养箱中培养，培养4-7天，传代至2-5代。
采用上述方法分离和培养血管内皮前体细胞的过程中，可以采用下述方法来进行细胞增殖率的测定和细胞鉴定细胞增殖率测定方法是取3份骨髓样品，每份样品计数第1代至第5代细胞增殖率，即传代时取三盘细胞计数，求其平均值，(平均值-初始接种细胞数)/初始接种细胞数，得到每代的细胞增殖率。
细胞鉴定的方法是留取第1～3代细胞爬片，细胞贴壁生长达60％融合状态时，取出细胞爬片，放入含10ug/ml DiI-acLDL的培养液中，在37℃下孵育1h。然后将细胞经2％多聚甲醛固定10min后继续与FIFC-标记的凝集素(FIFC-labeled Ulex europeus agglutinin，浓度10ug/ml)在37℃下孵育1h在荧光显微镜下观察细胞染色情况。
所有计量数据均以平均数±标准差表示。组间资料进行t检验。
本发明在相差显微镜下观察，骨髓单个核细胞接种培养皿24hrs后，开始贴壁生长，初始细胞呈小圆形，折光性强，细胞生长旺盛，5-7d后，细胞达到生长融合，可传代培养。细胞传代培养后可继续维持旺盛生长状态，约4-7天后可再次传代培养，至2-3代，细胞开始出现内皮细胞典型的铺路石样形态，并维持该形态直至第5-6代，细胞开始生长缓慢，并逐渐呈多角形态，细胞浆内可见颗粒增多，细胞折光性下降，代表细胞老化。
本发明通过实验组和对照组细胞增殖率的统计学分析，发现实验组，即本发明与对照组细胞增殖率都随传代数增多而逐渐下降，两组间第1代时细胞增殖率无显著性差异(P＞0.05)，在其余代次的细胞增殖率两组间存在显著性差异(P＜0.05)。这说明在体外培养培养初期，骨髓单个细胞中存在着多向分化的干细胞，这些干细胞能在体外维持旺盛生长增殖状态，但随着培养时间的延长，因VEGF和bFGF的作用，可促进内皮系干细胞(EPCs)的增殖。因此本发明能够在短时间内获得足够量的血管内皮前体细胞。
本发明培养的细胞经与DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白及FIFC-标记的凝集素孵育后的荧光显微镜下观察到同时发红光和绿色荧光。以上两项指标是目前普遍公认的鉴定血管内皮前体细胞的特异性指标。上述培养的细胞上两项检测结果均为阳性，结合细胞形态学特征，可以证实上述培养方法和条件获得的细胞是血管内皮前体细胞。
由于本发明采用的含VEGF和bFGF等生长因子的EBM-2培养液。尽管VEGF对其他细胞(如淋巴细胞)也有促丝裂作用，但由于VEGF受体主要表达于血管内皮细胞上，故对内皮系具有突出的促进增殖的功能。VEGF可以在从骨髓到新血管形成位点的不同水平上影响和调节EPCs。在骨髓内，各种细胞包括HSCs(造血干细胞)，MSCs(骨髓间充质细胞)，成骨细胞，破骨细胞等分泌的VEGF可诱导EPCs增殖、迁移和补充。骨髓以外组织(如缺血组织)分泌的VEGF同样可以动员和诱导EPCs，促进新生血管化。bFGF对EPCs具有非特异性促增殖作用，与VEGF产生协同作用，VEGF和bFGF联合作用所形成的EPCs克隆数(7±2/105cells)远高于VEGF的单独作用时的克隆数(0/105cells)。因此本发明采用VEGF和bFGF以及其他生长因子的组合在体外明显促进血管内皮前体细胞的生长和分化，使血管内皮前体细胞相对于其他细胞具有优势性的生长，能够在短时间内获得足够量的血管内皮前体细胞。
具体实施例方式
下面以从Wistar大鼠的骨髓中分离血管内皮前体细胞并在体外培养的实施例来详细说明本发明一种从骨髓中分离血管内皮前体细胞并在体外培养的方法，包括以下步骤1、收获骨髓细胞将Wistar大鼠颈椎脱臼处死后，侵泡于75％乙醇中消毒约15分钟。超净台、手术器械消毒。将大鼠后肢从髋关节处分离，暴露出股骨和胫骨，去除血迹绒毛。剪刀剪掉两端骨骺，暴露骨髓腔。用10毫升注射器吸取含100IU/ml肝素的EBM-2培养液，通过针头注入骨髓腔，收集冲洗出来的骨髓，将收获的骨髓用注射器反复吹打成细胞悬液；以1000rpm的速度离心洗涤5分钟，去除上层脂肪及组织液，收集管底细胞；2、收集单个核细胞全骨髓细胞吹打均匀，用滴管轻轻滴加到密度为1.083g/ml的histopaque-1083分离液上，以2200rpm的速度离心20min，取界面层的单个核细胞，培养液两次洗涤；3、制备EBM-2细胞培养液在含10％胎牛血清的EBM-2细胞培养液中加入2ng/ml的bFGF和10ng/ml的VEGF生长因子；4、细胞原代培养将单个核细胞以5×106/cm2接种培养皿，加入上述EBB-2细胞培养液，置入37℃、含5％CO2的培养箱内进行培养，48hrs后首次换液，去除悬浮细胞，后每2-3d换液一次；5、细胞传代培养待细胞长至80％融合状态时，用0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA液消化，再用含FBS的EBN-2基本培养液中止消化，洗涤后计数，按1∶3比例传代，置于含CO2的培养箱中培养，培养4-7天，传代至2-5代。
权利要求
1.一种从骨髓中分离血管内皮前体细胞并在体外培养的方法，其特征在于包括以下步骤1)、收获骨髓细胞用注射器吸取含100IU/ml肝素的EBM-2培养液，通过针头注入骨髓腔，收集冲洗出来的骨髓，将收获的骨髓用注射器反复吹打成细胞悬液；以1000rpm的速度离心洗涤5分钟，去除上层脂肪及组织液，收集管底细胞；2)、收集单个核细胞全骨髓细胞吹打均匀，用滴管轻轻滴加到密度为1.083g/ml的histopaque-1083分离液上，以2200rpm的速度离心20min，取界面层的单个核细胞，培养液两次洗涤；3)、制备EBM-2细胞培养液在含10％胎牛血清的EBM-2细胞培养液中加入2ng/ml的bFGF和10ng/ml的VEGF生长因子；4)、细胞原代培养将骨髓单个核细胞以5×106/cm2接种培养皿，加入上述EBB-2细胞培养液，置入37℃、5％CO2的培养箱内进行培养，48hrs后首次换液，去除悬浮细胞，后每2-3d换液一次；5)、细胞传代培养待细胞长至80％融合状态时，用0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA液消化，再用含FBS的EBM-2基本培养液中止消化，洗涤后计数，按1∶3比例传代，置于含CO2的培养箱中培养，培养4-7天，传代至2-5代。
全文摘要
本发明公开了一种从骨髓中分离血管内皮前体细胞并在体外培养的方法，其特征在于以下步骤1).收获骨髓细胞；2).收集单个核细胞；3).制备EBM－2细胞培养液；4).细胞原代培养；5).细胞传代培养。在步骤3)的制备EBM－2细胞培养液中加入bFGF和VEGF生长因子促进了血管内皮前体细胞的增殖。因此本发明能够在短时间内获得大量的血管内皮前体细胞。
文档编号C12N5/08GK1920007SQ20051002899
公开日2007年2月28日 申请日期2005年8月22日 优先权日2005年8月22日
发明者林昕 申请人:上海市上海中学