专利名称：海绵共生微生物混合培养及可培养种群监测方法
技术领域：
本发明涉及一种海绵共生微生物混合培养及可培养种群监测方法，具体涉及在海绵抽提物存在下的海绵共生微生物混合培养和可培养微生物的种群结构的监测。属于海洋微生物工程技术领域。
背景技术：
海绵是海洋活性物质最丰富的海洋生物之一，但是由于来源限制问题，很少有活性物质进入临床研究阶段。目前越来越多研究表明一些具有药用价值的活性物质是由海绵共生微生物产生的。因此，利用微生物发酵工程技术有可能是目前最可行的大量制备海绵活性物质的途径。
传统的微生物发酵培养是以纯菌为基础的，前提是分离得到具有某一活性物质产生能力的菌株。由于海绵及其共生微生物复杂的关系以及我们对于海绵共生微生物的生长条件几乎一无所知，因此给纯菌的分离与培养带来了很大困难。目前依赖于分离培养的微生物研究方法仅能揭示不到1％的微生物信息，99％以上的环境微生物是目前还不能分离得到的，对于海绵共生微生物的纯菌分离与培养更加困难。
由于不同的微生物在自然状态下共同存在于一个海绵宿主中，多菌间具有相互的依赖性，如果我们以多菌而不是以单菌作为分离培养的对象，就有可能得到单菌分离技术不容易得到的微生物，从而提高海绵共生微生物的培养效率。
同时，多种菌在海绵化学防御过程中可能存在协同作用，表现在活性物质产生、转移和积累可能涉及多菌的参与。海绵共生微生物在抗菌方面的协同效应已经被我们的研究证实，发现混合菌往往具有单菌不具有的或者更强的抗菌效果，这提示我们可能多菌间存在相互诱导产生某些活性物质的情况。因此以混合菌作为培养对象有可能得到单菌发酵得不到的活性物质，这将为海绵活性物质的大量制备开拓出一种有效途径。
因此，无论是从提高海绵共生微生物的培养效率，还是从利用多菌间的相互诱导作用生产单菌所不能得到的活性物质，海绵共生微生物混合培养都是一个非常重要的技术。目前国际上还没有海绵共生微生物混合培养技术的任何报道。
对于混合微生物发酵培养过程中微生物种群的动态监测，目前的常规技术还很难实现。16S rDNA-DGGE(变性梯度凝胶电泳)基因指纹技术已经成为揭示复杂微生物区系结构的有力工具，也非常适合混合微生物培养过程中微生物种群结构随时间的动态检测，目前国际上还没有将该技术应用于海绵共生微生物混合培养过程种群监测的任何报道。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种海绵共生微生物混合培养及可培养种群监测方法，为利用海绵共生微生物资源发酵制备具有药用价值的化合物提供原料和技术支撑。
为实现这一目的，本发明在微生物培养基中添加海绵浸出汁，来达到模拟微生物的海绵内营养条件，同时直接利用海绵释放的微生物混合液作为菌种进行混合微生物培养，利用微生物间的相互依赖性来尽量多地实现海绵共生微生物的体外培养。同时采用16S rDNA-DGGE基因指纹以及克隆测序、同源性与系统发育分析技术对培养过程的混合微生物的种群结构进行动态的监测，鉴定培养到的微生物，以评价混合培养的效果。
本发明的方法具体包括如下步骤1.海绵共生微生物的混合培养首先用无菌水洗净海绵表面附生的微生物，然后将海绵切成1-2mm3的细小碎块，置于无菌人工海水中振荡释放出体内共生的微生物，0.45μm膜过滤制备种子液。采用乙醇抽提、减压浓缩制备海绵浸出汁。将种子液接种到添加有海绵浸出汁的无菌海水配制的培养基中混合培养。
2.混合培养的海绵共生微生物种群的监测采用常规酚-氯仿抽提法提取混合培养的微生物的总DNA。以总DNA为模板，PCR(聚合酶链式反应)扩增小于500bp的16S rDNA片段；将得到的混合片段进行变性梯度凝胶电泳得到能反映混合培养的微生物种群结构的基因指纹图谱。割胶回收DNA条带，克隆测序。通过序列的同源性比对和系统发育树分析，鉴定所培养的细菌，监测混合培养的微生物的种群结构组成。通过不同培养时间混合微生物样品的分析实现动态监测。
采用本发明的方法可以实现难以单独体外培养的海绵共生微生物的体外培养，同时又可以对培养过程中的微生物种群结构变化进行动态监测，为今后利用海绵共生微生物资源发酵制备具有药用价值的化合物提供技术支撑，所培养的混合微生物可以直接作为制备某些活性物质的原料。
图1为本发明的技术路线流程图。
图2为本发明实施例中反映混合培养的细薄星芒海绵共生微生物种群结构的DGGE基因指纹图。
图2中1-1、1-2分别为添加有海绵浸出汁的1号培养基的培养结果；2-1、2-2分别为添加有海绵浸出汁的2号培养基的培养结果。
具体实施例方式
以下结合附图和实施例对本发明的技术方案作进一步描述。
实现本发明方法的技术路线如图1所示，首先制备混合菌种子液，制备海绵浸出汁，配制含海绵浸出汁的复合培养基；接种混合菌种子液，进行海绵共生微生物的混合培养；培养期间取样提取混合培养的微生物的总DNA，PCR扩增得到16S rDNA，通过DGGE构建反映混合培养的微生物种群结构的基因指纹图谱；通过指纹图条带的割胶回收、克隆测序与同源性和系统发育分析对每一条带代表的细菌进行分子鉴定，从而实现混合培养的海绵共生微生物种群的监测。
本发明在具体实施时，按以下步骤进行1.海绵共生微生物的混合培养(1)混合菌种子液制备将海绵切成1-2mm3的碎块，置于50mL无菌人工海水中振荡释放体内微生物，0.45μm膜过滤制备种子液。
(2)含海绵浸出汁的复合培养基的制备采用乙醇抽提、减压浓缩、添加蒸馏水制备海绵浸出汁，添加进人工海水配制的培养基制备复合培养基。
(3)混合菌培养将种子液5mL/份接种至两份185mL/份的1号和两份185mL/份的2号培养基中，其中1份1号培养基和1份2号培养基加入10mL海绵浸出汁，标为1-1、2-1培养基；另外1份1号培养基和2号培养基加入10mL无菌海水，标为1-2、2-2培养基。28℃、200r/min摇床培养。1号培养基23.4g NaCl，0.75g KCl，7.0g MgSO4·7H2O，0.2g CaCl2·2H2O，0.015g KH2PO4，1.0g甘露醇，1.0g酵母抽提物，1.0g蛋白胨，1ml微量元素溶液A，1L蒸馏水，10g琼脂。2号培养基0.1g麦芽糖，0.1g甘露醇l，0.1g葡萄糖，0.1g可溶性淀粉，0.1g半乳糖，0.1g蛋白胨，0.1g胰蛋白胨，0.1g酵母抽提物，1.0ml微量元素溶液A，1.0ml溶液B，1L人工海水，10g琼脂。微量元素溶液A2.86g H3BO3，1.81g MnCl2·4H2O，1.36g FeEDTA，0.08g CuSO4·5H2O，0.049gCo(NO3)2·6H2O，0.39g NaMoO4·2H2O，0.22g ZnSO4·7H2O，1000ml蒸馏水；溶液B5.0g NaH2PO4·H2O，1000ml蒸馏水。1L人工海水配方26.518g/L NaCl，0.725g/L KCl，2.447g/L MgCl2，0.202g/L NaHCO3，3.305g/L MgSO4，0.083g/L NaBr，1.141g/L CaCl2。
2.混合培养的海绵共生微生物种群的监测(1)总DNA提取采用常规酚-氯仿抽提法提取混合培养的海绵共生微生物的总DNA。
(2)16S rDNA的扩增以总DNA为模板，采用引物8f(5’-GGA GAG TTT GATCA/CT GGC T-3’)与798r(5’-CCA GGG TAT CTA ATC CTG TT-3’)聚合酶链式反应(PCR)扩增海绵细菌DNA的16S rDNA片段。体系及反应条件如下9μL 10×PCR缓冲液(50mmol/L Tris(三羟甲基氨基甲烷)-HCl(pH8.2)，18mmol/L MgCl2，500mmol/L KCl，0.1％甘油，1％的TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚))，10pmol的引物8f及10pmol的引物798r，2μL 10mmol/Ld NTP，1μL基因组DNA及2.5U Super Taq酶，用无菌去离子水补充体积至50μL。PCR反应程序如下94℃预变性5min，80℃保持1min，加入Super Taq酶。接着按(94℃变性1min，57℃退火1min，72℃延伸2min)25次循环，72℃延伸2min完成扩增。以获得的PCR产物为模板，采用引物P2(5’-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3’)与P3(5’-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GCCTAC GGG AGG CAG CAG-3’)进行16S rDNA-V3扩增。扩增体系及反应条件如下5μL 10×PCR缓冲液(50mmol/L Tris-HCl(pH8.2)，18mmol/LMgCl2，500mmol/LKCl，0.1％甘油，1％的TritonX-100)，25pmol的P3及25pmol的P2，1.75μL 10mmol/Ld NTP，2μL纯的16S rDNA及2.5U SuperTaq酶，用无菌去离子水补充体积至50μL。PCR反应程序如下[4]94℃预变性5min，80℃保持1min，加入Super Taq酶。65℃退火1min，(94℃变性30S，65℃(-0.5℃/循环)退火30S，72℃延伸1min)21次循环，(94℃变性30S，55℃退火30S，72℃延伸1min)5次循环，72℃延伸3min最后4℃保存备用。用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测，EB染色观察。
(3)DGGE基因指纹图构建采用Bio-Rad的DGGE分析系统，实验条件如下8％(wt/vol)聚丙烯酰胺(37.5∶1)，60℃、1倍TAE电泳缓冲液下电泳。变性剂尿素与去离子甲酰胺的线性梯度为30％-50％，电压150V，电泳时间4.5h。进样量5μL进样缓冲液+10μL PCR产物。银染，数码相机拍照得到DGGE指纹图谱。
(4)混合培养的海绵共生微生物种群的监测割胶回收DNA条带，经无菌水多次冲洗后捣碎，加入TE缓冲液浸泡过夜。离心取上清作为PCR的模板，对回收的条带进行PCR再扩增。所用引物是P15’-CCT ACG GGA GGCAGC AG-3’和P25’-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3’。扩增体系5μl10×PCR缓冲液(100mM Tris-HCl(pH9.0)，15mM MgCl2，500mM KCl，0.1％甘油，1％的TritonX-100)1.25μl 20μM的P1或P3，1.25μl 20μM的P2，1.75μl dNTP，4μl离心上清及0.5μl Taq酶，用无菌去离子水补充体积至50μl。PCR反应程序如下20次循环94℃变性30S，55℃退火30S，72℃延伸1min；72℃延伸3min。将PCR产物用上海生工生物技术公司的UNIQ-10柱按照操作指南进行纯化后与PUCm-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α，采用蓝白斑筛选的方法筛选白色的连接有外源DNA片段的重组克隆。提取质粒进行16S rDNA测序。在http://www.ncbi.nlm.nih.gov上采用Blast软件进行序列同源性比对。使用多序列联配软件Clustal X以N-J法进行系统发育树分析，鉴定对应条带的细菌，从而实现混合培养的海绵共生微生物种群的监测。
采用本发明的方法对我国南海细薄星芒海绵的共生微生物成功地进行了混合培养，并实现了基于DGGE基因指纹技术的培养过程中微生物种群结构的监测。图2为培养7天时的混合培养的微生物种群的DGGE基因指纹图。例如图中1-1泳道为采用添加了海绵浸出汁的培养基的培养结果，可以看出所得到的可培养的混合微生物种群非常丰富。白点所示为割胶回收、克隆测序后的条带，经过同源性与系统发育分析可知这些混合培养得到的细菌的种属。分子鉴定显示这些细菌属于α-，γ-Proteobacteria、Firmicutes，和Bacteroidetes细菌。
权利要求
1.一种海绵共生微生物混合培养及可培养种群监测方法，其特征在于包括如下步骤(1)海绵共生微生物的混合培养首先用无菌水洗净海绵表面附生的微生物，然后将海绵切成1-2mm3的细小碎块，置于无菌人工海水中振荡释放出体内共生的微生物，0.45μm膜过滤制备种子液，采用乙醇抽提、减压浓缩制备海绵浸出汁，将种子液接种到添加有海绵浸出汁的无菌海水配制的培养基中混合培养；(2)混合培养的海绵共生微生物种群的监测采用常规酚-氯仿抽提法提取混合培养的微生物的总DNA，以总DNA为模板，聚合酶链式反应扩增小于500bp的16S rDNA片段；将得到的混合片段进行变性梯度凝胶电泳得到能反映混合培养的微生物种群结构的基因指纹图谱，割胶回收DNA条带，克隆测序，通过序列的同源性比对和系统发育树分析，鉴定所培养的细菌，监测混合培养的微生物的种群结构组成，通过不同培养时间混合微生物样品的分析实现动态监测。
全文摘要
一种海绵共生微生物混合培养及可培养种群监测方法。无菌水洗净海绵表面附生微生物后以人工海水浸泡、震荡释放海绵体内共生微生物制备种子液；用乙醇提取制备海绵浸出汁，添加进海水培养基中制成复合培养基；接种进行混合微生物培养。提取混合培养的微生物总DNA，采用细菌通用引物PCR扩增得到小于500bp的16S rDNA片段，进行变性梯度凝胶电泳得到基因指纹图谱；通过不同培养时间混合微生物样品指纹图条带的回收、克隆测序、同源性与系统发育分析鉴定微生物种群中的细菌种类，实现体外混合培养海绵共生微生物种群的监测。本发明可提高海绵共生微生物体外分离与培养的效率，也为制备多菌诱导产生的活性物质提供原料和技术支撑。
文档编号C12Q1/68GK1766081SQ200510029319
公开日2006年5月3日 申请日期2005年9月1日 优先权日2005年9月1日
发明者李志勇, 何丽明 申请人:上海交通大学