专利名称：制备人淋巴细胞模拟物的方法
技术领域：
本发明涉及来自动物的血红细胞医用配制技术，特别是涉及利用动物的血红细胞制备人淋巴细胞模拟物的技术。
背景技术：
人外周白细胞主要由淋巴、单核、粒细胞3群细胞组成，他们在体积上是一个连续分布的整体，其测试主要通过血液细胞分析仪进行，细胞在仪器测试的分布情况如图1所示。为了保证测试仪器的准确，需要制造长期稳定的质控和校准物对测试仪器进行质量控制和校准维护。在多参数的质控物中，含有一定的大小的细胞粒子，称为人细胞模拟物或类细胞。这些粒子一般为塑胶粒子或固定后的动物红细胞粒子。美国专利US3541137、US4179398、US4264470、US4704364等描述了3分群血液细胞分析仪质控的白细胞和血小板研制方法，其中人粒细胞模拟物可以从爬行类、鱼类红细胞经过固定后获得；人单核细胞模拟物使用火鸡红细胞固定处理后获得；淋巴细胞模拟物由人或其他哺乳动物红细胞处理后获得，而血小板模拟物使用山羊红细胞处理后获得等等。
人淋巴细胞分布具有两个特点一是体积小，二是分布窄。现有人淋巴细胞模拟物存在一定的不足使用塑胶粒子成本比较高，分布范围比较宽，不适合降低临床工作的成本，广泛应用受到限制；而使用动物源的固定红细胞粒子一般不容易使其处于人淋巴细胞正常分布范围，其中重要的一个因素就是由于淋巴细胞体积小，处于血液细胞分析仪的白细胞测定域值附近，如果其分布不佳，会导致白细胞测定出现较大误差，所以容易产生数据变异较大而使质控失败，或产生无意义的报警信息。为了尽量缩小淋巴细胞计数误差，一个很好的方法就是增加血液细胞分析仪测定的淋巴细胞中央分布区域的细胞数量，这样就会在仪器测定的淋巴细胞分布的最左侧区域(最小的淋巴细胞区域)出现小的上升沿台阶，由于这部分细胞在整个白细胞分布中所占比例非常微小，仪器域值变化对白细胞计数影响也就非常小，因而进一步提高了质控的稳定性。但是，使用人红细胞或其他哺乳动物来源的红细胞不容易达到以上要求，仪器测定的淋巴细胞分布缺乏小的上升沿，容易出现细胞碎片报警信息，也不容易提高计数稳定性。而且在混合白细胞粒子中，淋巴细胞的分布过宽也会将单核区域细胞掩盖，因为单核的数量很少，仪器测定的淋巴细胞分布右侧细胞多时就会明显影响单核细胞的分布曲线。这些变化如图2所示图2-1中的I1部分曲线显示小淋巴粒子处于仪器测定域值附近，图2-2中的I2部分曲线显示大淋巴粒子影响单核区细胞的分布曲线，图中R2为报警信息。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于避免上述现有技术的不足之处而提出一种制备人淋巴细胞模拟物的方法，解决淋巴细胞模拟物的体积大小问题和仪器测定的淋巴细胞分布问题，使人淋巴细胞模拟物的体积长期保持稳定。
本发明解决所述技术问题可以通过采用以下技术方案来实现提出一种制备人淋巴细胞模拟物的方法，取得动物红细胞后，将所述红细胞进行体积固定处理；所述红细胞是有核红细胞，将该有核红细胞进行体积固定处理时，通过渗透压调节所述有核红细胞的体积使其处于人淋巴细胞正常分布范围；将有核红细胞体积调小时所述渗透压值高于该有核红细胞的生理渗透压值，将有核红细胞体积调大时所述渗透压值低于该有核红细胞的生理渗透压值。
经过研究发现，使用含细胞核的红细胞的分布具有良好的前上升沿，而且分布比人或其他哺乳动物窄，可以更好模拟淋巴细胞的形态，这类红细胞如禽、鸟类红细胞。但这类红细胞体积大小和人淋巴差异明显，所以必须考虑将细胞体积调节到人淋巴细胞范围。
使用渗透压可以有效解决这个问题。使用低渗透压可以使细胞体积涨大，使用高渗透压可以使细胞体积缩小，再配合固定试剂作用，这样处理后的细胞粒子体积在仪器试剂作用下符合人淋巴细胞体积区域，而且保持了动物有核红细胞的分布特征。与现有技术相比，本发明的技术效果在于1、被处理的红细胞分布良好，小粒子所占比例少，而且稳定性强，不容易产生异常报警信息，满足质量控制要求；2、样本来源丰富而且没有限制，成本低廉。
图1是正常人外周血液白细胞测试分布情况示意图；图2是现有技术中人外周白细胞测试分布情况由于淋巴细胞体积变化引起变化的示意图，其中图2-1着重示意出测试分布的左侧变化，图中的I1部分曲线显示小淋巴粒子处于仪器测定域值附近；图2-2着重示意出测试分布的右侧变化，图中的I2部分曲线显示大淋巴粒子影响单核区细胞的分布曲线；图3是禽类红细胞使用渗透压调节固定的测试分布差异情况示意图，其中图3-1是未经渗透压调节直接固定禽类红细胞体积的测试分布情况示意图，图3-2是经渗透压调节固定禽类红细胞体积的测试分布情况示意图。
图中，横坐标单位为细胞体积单位飞升(f1)，纵坐标单位为细胞数量单位；R2为报警信息。
具体实施例方式
以下结合附图所示之最佳实施例作进一步详述。
采用动物细胞固定后模拟人白细胞已经有多年历史，但由于动物红细胞不容易符合人细胞的正常分布，所以对细胞模拟物的处理和保存提出了很高要求。即使这样，目前也缺乏非常稳定不变的红细胞源性的细胞模拟物。
人淋巴细胞使外周血液中最小的一群细胞，其小细胞群体测定处于仪器测定域值附近，如果这部分细胞很多，就会带来白细胞计数结果的较大变化。所以对于仪器质量控制产品提出了更高的要求。就是要尽量缩小这部分淋巴细胞在整个白细胞粒子中的数量。同样为了减少对单核区域细胞的分布影响，必须同时尽量减少右侧大淋巴细胞粒子的数量，否则单核区细胞分布情况变差，容易出现报警信息。上面两点要求淋巴细胞模拟物必须尽量增加中央细胞的比率。人淋巴细胞分布比较窄，使用人或其他哺乳动物红细胞加工不容易满足要求。通过实验发现，含细胞核的动物红细胞如禽类或鸟类的红细胞分布就比较窄，但体积大小往往偏离人淋巴细胞体积范围，此时使用渗透压控制调节该类动物红细胞的体积范围，结合固定计数就可以制造比较好的淋巴细胞模拟物。
本发明制备人淋巴细胞模拟物的方法，是在取得动物红细胞后，将所述红细胞进行固定处理；所述红细胞是有核红细胞，将该有核红细胞进行体积固定处理时，通过调节渗透压使所述有核红细胞的体积处于人淋巴细胞正常分布范围；将有核红细胞体积调小时所述渗透压值高于该有核红细胞的生理渗透压值，将有核红细胞体积调大时所述渗透压值低于该有核红细胞的生理渗透压值。通过试验证明，将有核红细胞体积调小时，一般来说，渗透压值须高于350mOsm/kgH2O，由于在高渗透压条件下细胞不会受损，因而高渗透压值在理论上没有上限；而将有核红细胞体积调大时，一般来说，渗透压值低于250mOsm/kgH2O，低渗透压值的下限高于细胞明显破裂的临界渗透压值即可，对于不同的动物细胞该临界渗透压值不同，但该临界渗透压值可以通过简单的试验即可确定，如观察细胞是否破裂释放出内容物。对应每一种具体动物红细胞选定渗透压时，首先，根据细胞需要调大还是调小来确定选择低渗透压还是高渗透压；然后，从需要调节的细胞生理渗透压值起，降低或加大渗透压值，直至得到能将细胞体积调节到处于人淋巴细胞正常分布范围的具体渗透压值。
用渗透压调控制备人淋巴细胞模拟物的方法具体步骤如下1、配制试剂。
抗凝剂生理盐水加入1％的乙二胺四乙酸二钠(EDTA2钠盐)；基础试剂1-5g聚乙二醇(PEG)1～5g葡萄糖0.5-5g柠檬酸钠0.1～2g青霉素0.1-2g链霉素
0.5-5g硫柳汞1～9g 氯化钠将上述成份加入蒸馏水配制为1L，使用氯化钠调节渗透压到300mOsm/kgH2O(人正常渗透压为300mOsm/kgH2O)，可以使用盐酸和氢氧化钠调节试剂ph范围。
固定试剂1在基础试剂中加入氯化钠，将渗透压调节到所需渗透压值；动物红细胞不同所需渗透压值不同，各种动物细胞所需渗透压值可以通过一般试验得出。如经过试验证明，对于三皇鸡红细胞，所需渗透压值为600mOsm/kgH2O，即在600mOsm/kgH2O这个数值下，三皇鸡红细胞体积可以缩小到处于人淋巴细胞正常分布范围。
固定试剂2浓度大于5％甲醛溶液，实际操作中可选用市售的37％甲醛溶液。
2、处理过程(1)从禽类或鸟类动物取血，如三皇鸡，并将取得的动物血液使用抗凝剂抗凝；(2)使用基础试剂对抗凝后的血液进行离心洗涤1～3次，去掉上清中的血浆蛋白成分。可以将多个样本进行混合以增加处理样本总量，再次离心浓缩；(3)去掉上清液，使用固定试剂1悬浮经过离心处理后的红细胞，加入的固定试剂1体积大于经过离心后的红细胞体积；(4)样本静置10-30分钟；(5)加入固定试剂2，直至甲醛终浓度为2-5％，静置固定30分钟以上时间；(6)使用基础试剂或者生理盐水充分离心洗涤去掉甲醛，静置沉淀红细胞，得到人淋巴细胞模拟物。
使用本发明方法处理后的禽类细胞体积缩小情况如图3所示，图3-1是未经渗透压调节直接固定禽类红细胞体积的测试分布情况示意图，图3-2是经渗透压调节固定禽类红细胞体积的测试分布情况示意图。两两比较图3-2、图3-1和图1，明显可以看出，经渗透压调节固定的禽类红细胞体积分布已经处于人淋巴细胞正常分布范围。而且，洗涤保存后的处理细胞稳定期长，不含固定试剂，不会被试剂中的表面活性剂溶解，可以与其他粒子配合形成多参数质控产品。
权利要求
1.一种制备人淋巴细胞模拟物的方法，取得动物红细胞后，将所述红细胞进行固定处理；其特征在于所述红细胞是有核红细胞，将该有核红细胞进行体积固定处理时，通过调节渗透压使所述有核红细胞的体积处于人淋巴细胞正常分布范围；将有核红细胞体积调小时所述渗透压值高于该有核红细胞的生理渗透压值，将有核红细胞体积调大时所述渗透压值低于该有核红细胞的生理渗透压值。
2.如权利要求1所述的制备人淋巴细胞模拟物的方法，其特征在于取得动物有核红细胞，用渗透压调控技术制备人淋巴模拟物具体包括以下步骤下述基础试剂是指1～5g聚乙二醇、1～5g葡萄糖、0.5～5g柠檬酸钠、0.1～2g青霉素、0.1～2g链霉素、0.5～5g硫柳汞和1～9g氯化钠，使用蒸馏水配制为1L，使用氯化钠调节渗透压到人正常渗透压水平；下述固定试剂1是指在基础试剂中加入氯化钠，将渗透压调节到所需渗透压值；下述固定试剂2是指甲醛溶液；①将取得的动物血液使用抗凝剂抗凝；使用基础试剂对抗凝后的血液进行离心洗涤，去掉上清中的血浆蛋白成分；②去掉上清液，使用固定试剂1悬浮离心处理过的红细胞，静置10～30分钟；③加入固定试剂2，甲醛最终浓度为2～5％，静置超过30分钟；④使用基础试剂或者生理盐水充分离心洗涤去掉甲醛，静置沉淀，得到人淋巴细胞模拟物。
3.如权利要求2所述的制备人淋巴细胞模拟物的方法，其特征在于所述抗凝剂是指生理盐水加入1％的乙二胺四乙酸二钠。
4.如权利要求2所述的制备人淋巴细胞模拟物的方法，其特征在于所述固定试剂2采用市售的浓度为37％的甲醛溶液。
5.如权利要求1或2所述的制备人淋巴细胞模拟物的方法，其特征在于所述有核红细胞从禽类或鸟类动物取得。
6.如权利要求2所述的制备人淋巴细胞模拟物的方法，其特征在于所述有核红细胞从三皇鸡中取得。
7.如权利要求6所述的制备人淋巴细胞模拟物的方法，其特征在于所述固定试剂1的渗透压值调节到600mOsm/kgH2O。
8.如权利要求1所述的制备人淋巴细胞模拟物的方法，其特征在于将有核红细胞体积调小时所述渗透压值高于350mOsm/kgH2O，将有核红细胞体积调大时所述渗透压值低于250mOsm/kgH2O。
全文摘要
本发明涉及一种制备人淋巴细胞模拟物的方法，取得动物红细胞后，将所述红细胞的体积固定；所述红细胞是有核红细胞，将该有核红细胞的体积固定时，通过调节渗透压使所述有核红细胞的体积处于人淋巴细胞正常分布范围；将有核红细胞体积调小时所述渗透压值高于该有核红细胞的生理渗透压值，将有核红细胞体积调大时所述渗透压值低于该有核红细胞的生理渗透压值。本发明的技术效果在于1.被处理的红细胞分布良好，小粒子所占比例少，而且稳定性强，不容易产生异常报警信息，满足质量控制要求；2.样本来源丰富而且没有限制，成本低廉。
文档编号C12N5/06GK1891816SQ200510035800
公开日2007年1月10日 申请日期2005年7月4日 优先权日2005年7月4日
发明者刘牧龙, 徐祖越, 张晖 申请人:深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司