专利名称：实时定量pcr检测人ddit3转录本试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，涉及一种新的DDIT3基因转录本快速定量PCR检测试剂盒，使DDIT3转录本的测定更为快速、方便，并且能够精确定量。
背景技术：
肿瘤是威胁人类生命的主要疾病之一，目前呈逐年上升趋势。原癌基因激活和抑癌基因功能丧失是引起肿瘤发生发展的重要分子基础。各种细胞损伤如紫外线、电离辐射和许多基因毒药物都会引起DNA损伤和基因组不稳定，DNA保护系统在维持遗传物质的完整性中起着至关重要的作用，细胞受到损伤后会启动DNA保护系统对受损DNA进行修复，而该过程需要通过激活G1/S和G2/M“控制点”使细胞周期阻滞和有丝分裂停止来提供时间，涉及P53、Rb、WT1和P21等转录因子。如果这些转录因子发生功能异常，受损细胞就缺乏足够的时间对损伤DNA进行修复，基因组损伤就会在有丝分裂后被传递给子代细胞，随着基因损伤的不断积累，细胞最终就会发生恶性转化。
DNA损伤诱导的转录因子3(DDIT3)是近年来发现的一个新的转录因子，在诱导细胞周期阻滞、促进细胞分化和凋亡等方面发挥着重要的调控作用。许多肿瘤患者中存在DDIT3基因的结构异常。DDIT3位于染色体12q13，该位点的扩增常与多种软组织肿瘤如恶性纤维性组织细胞瘤、恶性胶质瘤和胶质母细胞瘤的发生密切相关。而累及该位点的易位t(12；16)(q13；p11)和t(12；22)(q13；q12)则引起TLS/FUS-DDIT3和EWS/DDIT3融合基因的形成，导致粘液样脂肪肉瘤和粘液样/圆细胞脂肪肉瘤发生。DDIT3表达在黑色素瘤中较良性痣显著降低，并且其表达水平与黑色瘤患者的生存时间密切相关。并且，目前的研究发现CML患者的C/EBPζ转录本也明显降低。因此，检测DDIT3基因的表达水平有助于肿瘤患者的诊断和预后判断。
DDIT3转录本检测主要通过聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)，该技术的基本原理是在待扩增的片段两端分别设计一个互补的寡核苷酸引物，在耐热DNA聚合酶的作用下，在体外以dNTPs为原料、以待测核酸为模板反复扩增，可以使微量目的核酸扩增上百万倍，再将产物在琼脂糖凝胶上电泳，以溴乙锭染色，在凝胶成像仪上观察结果，PCR技术已被广泛应用于各种感染性疾病和恶性肿瘤的分子诊断。目前PCR方法主要有定性和定量检测两种定性检测主要应用巢式PCR，其优点是非常灵敏，但其缺点是仅能显示阳性、阴性结果，无具体数值，不能观察其动态变化和根据数值进行预后判断，且操作繁琐；定量方法为竞争性PCR，是在定性PCR的基础上，以不同稀释度的内参(修饰的对照核酸)与标本共同扩增，以内参的稀释度及结果作标准曲线，判断标本中目的核酸的量；虽然竞争性PCR能够准确定量，但是操作更为繁琐，难以在临床上常规开展。
随着技术的发展，又产生了实时定量PCR(real-time quantitative PCR，RQ-PCR)。TaqMan探针RQ-PCR技术及相应检测仪器如PE5700、PE7700的推出有效地克服定性PCR和竞争性定量PCR的不足，能快速、简便、特异地对DDIT3转录本进行精确定量。
发明内容
本发明试剂盒包含PCR缓冲液、dNTPs、MgCl2、特异性TaqMan探针、特异性引物、Taq酶、标准品和对照品。
特异性引物分上游引物和下游引物
上游引物序列为5’-GGAGCTGGAAGCCTGGTATG-3’，下游引物序列为5’-GCTCTGGGAGGTGCTTGT-3’，特异性探针序列为5’-FAM-TCTTCACCACTCTTGACCCTGCTTCTCT-TAMRA-3’标准品序列为GATCCAACTG CAGAGATGGC AGCTGAGTCA TTGCCTTTCT CCTTTGGGACACTGTCCAGC TGGGAGCTGG AAGCCTGGTA TGAGGACCTG CAAGAGGTCCTGTCTTCAGA TGAAAATGGG GGTACCTATG TTTCACCTCC TGGAAATGAAGAGGAAGAAT CAAAAATCTT CACCACTCTT GACCCTGCTT CTCTGGCTTGGCTGACTGAG GAGGAGCCAC AACCAGCAGA GGTCACAAGC ACCTCCCAGAGCCCTCACTC TCCAGATTCC AGTCAGAGCT CCCTGGCTCA GGAGGAAGAGGAGGAAGACC AAGGGAGAAC CAGGAAACGC AAACAGAGTG GTCATTCCCCAGCCCGGGCT GGAAAGCAGC GCATGAAGGA GAAAGAACAG GAGAATGAAAGGAAAGTGGC ACAGCTAGCT GAAGAGAATG AACGGCTCAA GCAGGAAATCGAGCGCCTGA CCAGGGAAGT AGAGGCGACT CGCCGAGCTC TGATTGACCGAATGGTGAAT CTGCACCAAG CATGAACAAT T对照品分为阳性对照和阴性对照，阳性对照为正常细胞的DDIT3 cDNA样品，阴性对照为无DDIT3的无菌双蒸水。
本试剂盒保存于-20℃，尽量减少反复冻融。
本发明建立了利用TaqMan实时定量PCR技术检测DDIT3表达的方法，并经检测患者和正常对照标本，表明该方法切实可行。由于本方法采用的是先进的TaqMan荧光探针杂交定量PCR技术，可以对检测标本进行精确定量；并且由于使用的是互补探针，使得PCR扩增的特异性大为提高，降低了定性PCR扩增的假阳性率；此外，由于本方法采用的是闭管操作，不需电泳及凝胶成像等PCR后处理，使定性和竞争性定量PCR的后处理操作所引起的污染大为减少，并且使检测时间缩短工作更为简便。
本发明试剂盒使用方法每次检测均应设立阳性对照和阴性对照。标准品用无菌去离子水稀释为108～102拷贝/μl。
扩增检测在荧光定量PCR仪上进行，总体积25μl，其中13.5μl无菌双蒸水、2.5μlPCR缓冲液、4μl MgCl2、特异性引物各1μl、1μl TaqMan探针、1U Taq DNA聚合酶和1μl检测样品(标准品、待测cDNA、阳性对照或阴性对照)。反应条件为95℃预变性5min，然后94℃15s、60℃1min共45个循环，根据所获得的标准曲线，计算得到待测标本中DDIT3转录本的量(拷贝数/μl)。
图1为实时定量PCR标准品检测(108～102拷贝/μl)。
图2为实时定量PCR标准曲线。
具体实施例方式
本发明结合附图和具体实施例作进一步说明。应该理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。
实施例1荧光定量PCR法检测DDIT3的引物、探针设计以及标准品制备一、材料Trizol试剂购自美国Gibco公司，MMLV逆转录酶、RNAsin购自美国Invitrogen公司，dNTPs、Taq DNA聚合酶购自美国MBI公司，PE5700荧光定量PCR仪为美国Perkin Elmer公司产品。
二、引物及探针设计与合成以DDIT3全长cDNA序列(Genbank登录号NM_004083)为模板，使用Primer Express2.0软件(美国PE公司)设计RQ-PCR的引物和TaqMan探针序列，并应用Primer Premier5.0软件(美国PremierBiosoft公司)对所设计的序列进行评价，从中选择最佳组合。
RQ-PCR上游引物序列为5’-GGAGCTGGAAGCCTGGTATG-3’，下游引物序列为5’-GCTCTGGGAGGTGCTTGT-3’，TaqMan探针序列为5’-FAM-TCTTCACCACTCTTGACCCTGCTTCTCT-TAMRA-3’，引物和探针均由上海博亚公司合成。
标准品PCR上游引物序列为5’-ACGGATCCAACTGCAGAGATGGCA-3’，下游引物序列为5’-CCGAATTCTTCATGCTTGGTGCAGA-3’，均由上海生工公司合成。
三、检测标准品制备取正常人骨髓经Ficoll液分离单个核细胞，RPMI1640无菌洗涤2次，离心收集细胞加入Trizol试剂提取总RNA，取2μg总RNA，在40μl反应体系中用六随机引物和MMLV对其进行逆转录后，用标准品PCR上下游引物在PE5700型PCR仪上进行PCR扩增，条件为95℃预变性5min，然后94℃45秒、58℃45秒、72℃60秒共扩增35个循环，最后于72℃延伸5分钟后置4℃保存。
PCR产物经凝胶电泳分离纯化，用T-A克隆法克隆入pMD18-T载体，并将阳性克隆经测序鉴定。标准品即为携带阳性克隆的pMD18-T载体，全长3223bp，测定其含量并稀释至109拷贝/μl，置-20℃保存。
实施例2荧光定量PCR法检测DDIT3转录本的应用一、标本检测20例经形态学和细胞遗传学确诊的急性髓系白血病(AML)患者骨髓标本，应用Ficoll液分离单个核细胞，经PBS洗涤后离心收集细胞用加入Trizol提取总RNA，取2μg总RNA，在40μl反应体系中用六随机引物和MMLV对其进行逆转录后，用RQ-PCR上下游引物在PE5700型PCR仪上进行PCR扩增，条件为95℃预变性5min，然后94℃15秒、60℃1分钟共扩增45个循环。同时加标准品检测作标准曲线。测定结果经仪器处理根据标准曲线计算出检测标本的DDIT3表达量。
二、结果(一)标准曲线标准品检测结果参见图1，标准曲线参见图2。
(二)样品检测
10例正常对照和10例AML患者骨髓标本检测结果如下
本发明是结合最佳实施例进行描述的，然而在阅读了本发明的上述内容后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种实时定量PCR检测人DDIT3基因转录本的快速定量检测试剂盒，其特征在于PCR缓冲液、dNTPs、MgCl2、特异性TaqMan探针、特异性引物、Taq酶、标准品和对照品。
2.根据权利1，反应体系为1×PCR缓冲液、0.3μM特异性引物、0.2mM dNTPs、4.0mMMgCl2、0.2μM TaqMan探针、1U Taq酶。
3.根据权利1所述的试剂盒，其特征是上下游特异性引物序列为5’-GGAGCTGGAAGCCTGGTATG-3’和5’-GCTCTGGGAGGTGCTTGT-3’。
4.根据权利1所述的试剂盒，其特征是特异性探针为荧光标记探针，其序列为5’-FAM-TCTTCACCACTCTTGACCCTGCTTCTCT-TAMRA-3’。
5.根据权利1所述的试剂盒，其特征是标准品浓度为109拷贝/μl，所含DDIT3序列为GATCCAACTG CAGAGATGGC AGCTGAGTCA TTGCCTTTCT CCTTTGGGACACTGTCCAGC TGGGAGCTGG AAGCCTGGTA TGAGGACCTG CAAGAGGTCCTGTCTTCAGA TGAAAATGGG GGTACCTATG TTTCACCTCC TGGAAATGAAGAGGAAGAAT CAAAAATCTT CACCACTCTT GACCCTGCTT CTCTGGCTTGGCTGACTGAG GAGGAGCCAC AACCAGCAGA GGTCACAAGC ACCTCCCAGAGCCCTCACTC TCCAGATTCC AGTCAGAGCT CCCTGGCTCA GGAGGAAGAGGAGGAAGACC AAGGGAGAAC CAGGAAACGC AAACAGAGTG GTCATTCCCCAGCCCGGGCT GGAAAGCAGC GCATGAAGGA GAAAGAACAG GAGAATGAAAGGAAAGTGGC ACAGCTAGCT GAAGAGAATG AACGGCTCAA GCAGGAAATCGAGCGCCTGA CCAGGGAAGT AGAGGCGACT CGCCGAGCTC TGATTGACCGAATGGTGAAT CTGCACCAAG CATGAACAAT T
6.根据权利1所述的试剂盒，其特征是对照品分阴性对照和阳性对照，其中阴性对照为无DDIT3的无菌双蒸水，阳性对照为正常细胞的DDIT3cDNA样品。
7.根据权利1所述的试剂盒，其特征是利用该试剂盒所设计的引物及探针进行的PCR进行DDIT3的定性和定量检测。
全文摘要
本发明涉及一种人DDIT3基因转录本快速定量检测的实时定量PCR(RQ－PCR)试剂盒，该试剂盒通过实时定量PCR检测技术检测cDNA标本，可以对标本中DDIT3基因转录本的拷贝数进行精确定量。该试剂盒可以用于临床及科研中检测急、慢性白血病和骨髓增生异常综合征患者骨髓、外周血等标本中DDIT3的表达，用以辅助诊断、指导治疗和随访。
文档编号C12Q1/25GK1814792SQ20051003773
公开日2006年8月9日 申请日期2005年2月2日 优先权日2005年2月2日
发明者陈子兴, 钱军, 岑建农 申请人:苏州大学附属第一医院, 镇江市第一人民医院