一种杨树的农杆菌基因转化方法

专利名称：一种杨树的农杆菌基因转化方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，具体地说涉及一种新疆杨农杆菌基因转化方法。
背景技术：
杨树是重要的速生用材树种，在以往的研究中多以提高杨树产量为目标，忽视了对其抗逆性等性状的改良。同时，环境的不断恶化，自然灾害的频繁发生，杨树生产受到病虫害等自然逆境的严重制约。目前，杨树在全世界及我国人工林中占有较大比重，因此培育抗病抗虫转基因杨树新品种具有十分重要的现实意义。
新疆杨(Populus alba var.pyramidalis)是银白杨的变种，在我国西部各省区常有栽种，在新疆南部分布较多，抗大气干旱、较耐盐碱、生长较快，是西部地区造林绿化的重要树种之一。新疆杨虽适合西北部地区种植，但大规模单一树种的造林易遭受病虫特别是白杨透翅蛾、杨毒蛾等食叶害虫危害。随着环境的不断恶化，自然灾害的频繁发生，虫害日益严重。由于林木世代周期长，采用常规育种技术难以在短时间内选育出抗逆新品种，自1987年Fillatti等首次获得抗除草剂杨树基因工程植株以来，杨树遗传转化研究已取得了较大进展。白杨派已有银白杨的一些派间杂交种、毛白杨等获得了转基因植株。但目前尚未有新疆杨转基因系统建立的报道。

发明内容
本发明的目的是提供一种利用基因工程技术培育新疆杨抗逆新品种，为林木的遗传改良提供了一个新途径。
本发明的技术方案是一种杨树的农杆菌基因转化方法，其特征是该方法包括以下步骤(1)将新疆杨试管苗置于基本培养基上继代繁殖；(2)将继代的试管苗上选取幼嫩、平展的叶，剪去叶边缘，剪成预定面积的叶盘为外植体，接种于叶盘分化培养基T上预培养；(3)挑取农杆菌LBA4404(pFZY1)的菌落接种到含有四环素和链霉素的YEB(农杆菌)液体培养基中，振荡培养一段时间后，取预定体积转接至YEB液体培养基，待菌体进入指数生长期，通过离心得到菌体，取基本培养基MS液体培养基悬浮菌体，获得侵染菌液；(4)将步骤(2)的预培养后叶盘浸入步骤(3)的侵染菌液，振荡，浸泡一段时间后，除去多余菌液，放回叶盘分化培养基T上进行共培养；(5)共培养后的叶盘洗涤以除去农杆菌，叶柄转移到叶柄分化筛选培养基T3上培养，叶盘转移到叶盘分化初次筛选培养基T1上培养，一段时间后，换用叶盘分化二次筛选培养基T2，直至分化出可见Kmr(卡那霉素抗性)芽；(6)将Kmr芽连同外植体一同移入不定芽伸长筛选培养基Y继代培养；(7)待Kmr芽伸长至一定长度，将每个Kmr芽分离独立接入不定芽伸长筛选培养基Y筛选，2-3周继代一次，至Kmr芽长至一定长度后，移入生根筛选培养基G。
其中在步骤1中所述新疆杨试管苗以根部萌蘖芽方式继代繁殖，所述的基本培养基为1/2MS，蔗糖25-30g/L，pH5.6-5.8，琼脂6-7g/L，121±1℃，灭菌16-20min。
在步骤(2)中所述的试管苗继代时间为约1个月，外植体接种方式为以远轴面和培养基相接触。预培养条件为，培养温度25±2℃，光照3000-4000lux，光照时间16-18小时/天，预培养时间。所述叶盘分化培养基T为1/2MS中含有的新型细胞分裂素TDZ浓度为0.005-0.006mg/L，细胞分裂素BA浓度为0.15-0.25mg/L，细胞分裂素ZT浓度为0.15-0.25mg/L，生长素IAA浓度为0.4-0.5mg/L。其中最优配方为1/2MS中含有的新型细胞分裂素TDZ浓度为0.005mg/L，细胞分裂素BA浓度为0.25mg/L，生长素IAA浓度为0.5mg/L。
在步骤(3)中所述所述的YEB液体培养基中四环素的浓度为3-5mg/L、链霉素浓度为20-30mg/L，所述的振荡培养条件为27±1℃，220-230rpm，12小时；离心时5000rpm，5-8min。基本培养基MS液体培养基悬浮菌体的OD600值为0.3-0.4。侵染菌液通过两次液体培养活化农杆菌来制备。
在步骤(4)中所述浸泡一段时间为10-15分钟，共培养时间为2-3天。所述的共培养培养基中的乙酰丁香酮含量为20-200μmol/L。
在步骤(5)中所述叶盘分化初次筛选培养基T1为叶盘分化培养基T中的Cef(头孢曲松)浓度为40-50mg/L，Km(卡那霉素)浓度为10-15mg/L；叶盘分化二次筛选培养基T2为叶盘分化培养基T中的Cef浓度为40-50mg/L，Km浓度为10-20mg/L；叶柄分化筛选培养基T3为叶盘分化培养基T中的Cef浓度为40-50mg/L，Km浓度为20-25mg/L。
在步骤(6)中所述不定芽伸长筛选培养基Y为1/2MS中的细胞分裂素BA的浓度为0.1-0.2mg/L，生长素IAA的浓度为0.1-0.2mg/L，Cef的浓度为40-50mg/L，Km的浓度为20-30mg/L。
在步骤(7)中所述生根筛选培养基G为1/2MS中的Cef浓度为50mg/L，Km的浓度为10mg/L。
本发明与现有技术相比，其显著优点是通过建立高效的新疆杨遗传转化系统，在短时间内可选育出新疆杨抗逆新品种。
四

图1是NAA对不定芽分化的影响。
图2是IAA对不定芽分化的影响。
图3是BA对不定芽分化的影响。
五具体实施例方式
下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1新疆杨试管苗以根部萌蘖芽方式继代繁殖，基本培养基为1/2MS，蔗糖25-30g/L，pH5.6-5.8，琼脂6-7g/L，121+1℃，灭菌16-20min。附加的各种生长素、细胞分裂素和抗生素均为过滤灭菌，加入高压灭菌后冷却到40℃左右的培养基中。在继代约1个月的试管苗上选取幼嫩、平展的第3-5片叶，叶的大小、形状和色泽基本一致。剪去叶边缘，剪成0.7-0.8cm2的叶盘为外植体，以远轴面和培养基接触的方式接种。培养温度为25±2℃，光照3000-4000lux，光照时间16-18h/d。置于T培养基预培养2-3d，叶盘远轴面与培养基接触。挑取农杆菌LBA4404(pFZY1)的单菌落接种到YEB液体培养基中，加入四环素3-5mg/L、链霉素20-30mg/L，于27±1℃振荡培养(220-230rpm)，过夜；次日取0.8-1ml转接25-30ml的YEB液体培养基。培养至一定浓度(进入指数生长期)；5000rpm离心5-8min收集菌体，取适当MS液体培养基悬浮菌体至0D600值为0.3-0.4左右备用。将预培养后叶盘浸入侵染菌液，轻微振荡，充分浸泡10-15min左右，在无菌滤纸上吸去多余菌液，放回T培养基进行共培养。暗中共培养2-3d(天)后，叶盘洗涤3-4次以除去农杆菌，叶柄转移到T3筛选培养基培养，叶盘转移到T1筛选培养基培养，2-3周后换用T2筛选培养基，直至分化出可见Kmr芽。将Kmr芽连同原外植体一同移入Y不定芽伸长筛选培养基，2-3周继代1次。待Kmr芽伸长至1cm左右，将每个Kmr芽分离独立接入Y培养基筛选2周以上，直至Kmr芽长至约1.5cm，移入G生根筛选培养基。上述具体参数是基本培养基1/2MS；新疆杨叶盘分化培养基(T)1/2MS+TDZ0.005-0.006mg/L+BA0.15-0.25mg/L+IAA0.4-0.5mg/L；新疆杨叶盘分化初次筛选培养基(T1)T+Cef40-50mg/L+Km10-15mg/L；新疆杨叶盘分化二次筛选培养基(T2)T+Cef40-50mg/L+Km15-20mg/L；新疆杨叶柄分化筛选培养基(T3)T+Cef40-50mg/L+Km20-25mg/L；新疆杨不定芽伸长筛选培养基(Y)1/2MS+BA0.1-0.2mg/L+IAA0.1-0.2mg/L+Cef40-50mg/L+Km20-30mg/L；生根筛选培养基(G)1/2MS+Gef50mg/L+Km10mg/L。
实施例2生长素对叶盘不定芽分化的影响。
在基本培养基中附加BA0.5mg/L，并附加不同浓度的NAA及IAA两种生长素，从实验结果(见图1和图2，BA均为0.5mg/L)可以看到，不同浓度的NAA与IAA对不定芽分化均有促进作用，最高分化频率分别为28.8％、15.2％，生长素的种类和浓度不是影响叶盘不定芽分化的主要因素。培养基中添加NAA，分化频率提高，但分化形成的芽呈半透明状，玻璃化现象较严重；而在含IAA的培养基中分化形成的芽较健壮。
实施例3细胞分裂素BA、ZT对叶盘不定芽分化的影响。
在基本培养基中附加IAA0.15mg/L的条件下，分析不同浓度的BA对叶盘不定芽分化的影响。BA共设置了6个浓度水平，从0.15mg/L至5.0mg/L。从实验结果(图3，IAA为0.15mg/L)可见，BA浓度为2.0mg/L时叶盘的不定芽分化频率最高，为45.0％，平均分化芽数为1.44个。在组培过程中还发现，叶盘的叶柄切口最易分化，叶主脉切口次之，叶边缘切口最差。当叶盘不定芽分化频率较低时(低于30％)，一般为叶柄及叶主脉处分化，平均分化芽数可以达到较高水平(最高4.00)。当叶盘边缘伤口也分化时，不定芽分化频率会高于30％，但因叶盘边缘伤口分化能力较差，平均分化芽数反而减少。所以激素处理BA2.0mg/L+IAA0.15mg/L，不定芽分化频率最高为45％，平均分化芽数1.44。
玉米素ZT对不少杨树种叶盘不定芽分化有较好促进作用，故设计以下两类配方，一类是仅添加一种细胞分裂素ZT；另一类是使用两种细胞分裂素，BA与ZT合用，分析其对叶盘不定芽分化的影响。从结果(表1)可见，只附加ZT的培养基中未见芽的形成。叶盘在15天左右能形成类似于芽点的愈伤组织，呈红色半透明状，玻璃化，随着培养时间的延长不能分化成芽，但不论ZT的添加浓度高低都有大量根的形成。ZT与BA两种细胞分裂素配合使用，分化较好，不定芽分化频率可达37.7％，平均分化芽数也可达3.78个。
表1 ZT对叶盘不定芽分化的影响

实施例4新型细胞分裂素TDZ对叶盘不定芽分化的影响。
Thidiazuron(TDZ)是德国Schering公司在1976年推出的一种新的棉花脱叶剂，具有细胞分裂素活性。本实验设计TDZ单独使用或和BA配合使用的4种配方。
表2 TDZ对叶盘不定芽分化的影响

表2结果显示，使用TDZ的4个处理分化频率均高于50％，高于使用其他细胞分裂素的处理。其中TDZ0.01mg/L+BA0.25mg/L+IAA0.15mg/L分化频率达到100％，但芽较细弱，玻璃化现象严重，在后续培养中不能正常生长。故选用1/2MS+TDZ0.005mg/L+BA0.25mg/L+IAA0.15mg/L为新疆杨叶盘分化基本培养基，再优化以下4个条件去除较大面积的叶边缘区，以近轴面和培养基接触的方式接种，换用MS为基本培养基，提高IAA浓度。
表3 TDZ优化对叶盘不定芽分化的影响

从表3结果可见远轴面接触培养基的接种方式优于近轴面接触培养基，分化频率和平均分化芽数都有降低；以MS为基本培养基不如1/2MS，前者分化频率大幅下降；去除较大面积的叶边缘区的操作可大幅提高分化频率。从表4结果得出，提高IAA的使用浓度可提高分化频率和平均分化芽数，芽生长较健壮，玻璃化较少。最后确定配方1/2MS+TDZ0.005mg/L+BA0.25mg/L+IAA0.5mg/L为最佳分化培养基，分化频率可达100％，平均分化芽数可达6.18。
表4 不同IAA浓度对叶盘不定芽分化的影响

实施例5预培养时间对新疆杨产生Kmr芽的影响。
在植物遗传转化中预培养的主要作用是促进细胞分裂，分裂状态的细胞更易整合外源DNA，提高转化率。本实验结果表明(表5)，随着预培养时间的延长，转化频率降低，预培养8h转化频率最高为17.4％。
表5 预培养时间对新疆杨产生Kmr芽的影响

实施例6农杆菌侵染时间和共培养时间对新疆杨产生Kmr芽的影响。
本实验采用菌液侵染时间4种处理。结果显示(表6)叶盘侵染15min稍优于其他处理，差异不显著。据报道在杨属植物的遗传转化实验中，采用的菌液浓度和侵染时间有很大差异。本实验中因新疆杨叶片相对不太敏感，故使用中等浓度的菌液进行侵染(OD600＝0.4)，由于杨树是农杆菌的天然宿主，故采用较短的侵染时间。另一方面，农杆菌菌液对植物细胞有毒害作用，因此倾向于采取较低的菌液浓度和较短的侵染时间。
表6 农杆菌侵染时间对新疆杨产生Kmr芽的影响

农杆菌和植物共培养是整个转化过程中最重要的环节，因为农杆菌的附着，T-DNA的转移及整合都在共培养时期内完成。本实验结果表明(表7)，随共培养时间延长，获Kmr芽的频率显著增加，共培养5d叶盘分化Kmr芽的频率达到28％，比共培养2d提高了6倍多。杨属植物的共培养时间一般较短一般认为杨属植物分化较快，又是农杆菌的天然宿主，属于易转化种类，无需长时间共培养。但本实验结果表明，共培养时间的延长并不会引起假阳性增加。本实验中观察发现共培养2d内，不会出现肉眼可见农杆菌微小菌落；共培养3-5d，一般都能出现微菌落。
表7 不同共培养时间对新疆杨产生Kmr芽的影响

实施例7添加乙酰丁香酮对新疆杨产生Kmr芽的影响。
根癌农杆菌T-DNA的转移和整合，需Ti质粒中相关vir基因的表达调控，vir基因属诱导型操纵子，植物细胞受伤后所分泌的一些化学物质如酚类物质(乙酰丁香酮、羟基乙酰丁香酮)，酸性多糖，中性糖(葡萄糖、甘露糖等)是vir基因的诱导物，其中诱导效果最佳的为乙酰丁香酮。本实验在菌液培养和共培养培养基中加入乙酰丁香酮，结果表明(表8)共培养培养基中添加乙酰丁香酮，转化频率比CK提高了近4倍；侵染菌液中添加乙酰丁香酮，转化频率稍高于CK；两种培养基中都加入乙酰丁香酮，转化频率反而低于CK。在共培养培养基中添加乙酰丁香酮200μmol/L，Kmr芽的产生频率有明显提高。本实验所用菌株是章鱼碱型根癌农杆菌LBA4404，属于宿主范围较小、毒力中等的菌株，在杨属内表现一般，共培养培养基中添加乙酰丁香酮对其转化有促进作用。
表8 不同添加乙酰丁香酮方式对新疆杨产生Kmr芽的影响

其中CK指未添加乙酰丁香酮的处理；AS1指在侵染菌液中添加乙酰丁香酮200μmol/L；AS2指在共培养培养基中添加乙酰丁香酮200μmol/L；AS3指代在侵染菌液利共培养培养基均添加乙酰丁香酮200μmol/L。
杨属内常用的乙酰丁香酮浓度是200μmol/L，使用更高浓度的报道极少。本实验结果表明(见表9)，叶盘添加乙酰丁香酮所有处理的转化率都明显高于对照，最适浓度为80μmol/L。可能原因为(1)乙酰丁香酮是一种植物受伤后分泌的酚类物质，浓度过大对植物细胞本身有毒害作用；(2)杨树是农杆菌的天然宿主，细胞受伤后本身就有酚类物质的分泌，但可能数量较少；(3)乙酰丁香酮对农杆菌的生长也有一定的伤害。
表9 共培养培养基中添加不同乙酰丁香酮浓度对新疆杨产生Kmr芽的影响

实施例8侵染菌液的制备方法对新疆杨产生Kmr芽的影响。
在转化操作中，制备侵染菌液的方法多种多样。本实验设计4种制备侵染菌液处理，结果(见表10)表明，按b方法制备的菌液转化率最高为14.3％，明显优于其他处理方式。虽这种制备菌液的方法比较复杂，但有两方面优点①和单菌落一次接种大体积液体培养基方法比较，两次液体活化法生长至一定浓度所需时间更少，农杆菌的状态更一致、活力也更强。②农杆菌液体培养过程中会产生一些代谢物质，这些代谢物质对植物细胞有伤害；为纯化农杆菌菌株，通常要在农杆菌培养基中添加抗生素，抗生素对植物细胞也有伤害，所以菌液离心重悬比直接用菌液侵染好。有研究认为二次液体活化时，直接用植物培养基更好，本实验处理d采用了离心重悬后再用植物培养基培养2h的操作，结果发现在pH5.2的植物培养基中农杆菌长势很差，培养2h OD600没有任何增加，可能是由于pH5.2适于诱导vir基因表达，并不适于农杆菌生长。
表10 侵染菌液的不同制备方法对新疆杨产生Kmr芽的影响

其中a液体培养活化农杆菌一次；b液体培养活化农杆菌两次；c液体培养活化农杆菌两次加离心收集菌体重悬；d液体培养活化农杆菌两次加离心收集菌体重悬再培养2h。
实施例9外植体状态对新疆杨产生Kmr芽的影响。
研究中发现，植物材料的外植体状态对转化频率影响较大，设计了用不同继代方式的植物材料，结果(表11)表明，B方式继代的外植体转化频率更高。在木本植物组织培养和扦插取材时，均认为多年生树木的根部萌条比树梢枝条再生能力强。本实验，根部萌蘖芽方式继代的植株，比顶芽植株转化率高，可能是由于前一种外植体分化能力保持更好。
表11 外植体状态对新疆杨产生Kmr芽的影响

其中A离体继代16个月的外植体(每1个月继代一次，每次取顶芽继代)；B离体继代16个月的外植体，每1.5月继代一次，每次取根部萌蘖芽继代。
权利要求
1.一种杨树的农杆菌基因转化方法，其特征是该方法包括以下步骤(1)将新疆杨试管苗置于基本培养基上继代繁殖；(2)在继代的试管苗上选取幼嫩、平展的叶，剪去叶边缘，剪成预定面积的叶盘为外植体，接种于叶盘分化培养基T上预培养；(3)挑取农杆菌的菌落接种到含有四环素和链霉素的YEB液体培养基中，振荡培养时间后，取预定体积转接至YEB液体培养基，待菌体进入指数生长期，通过离心得到菌体，取基本培养基MS液体培养基悬浮菌体，获得侵染菌液；(4)将步骤(2)的预培养后的叶盘浸入步骤(3)的侵染菌液，振荡，浸泡后，除去多余菌液，放回叶盘分化培养基T上进行共培养；(5)对共培养后的叶盘洗涤除去农杆菌，叶柄转移到叶柄分化筛选培养基T3上培养，叶盘转移到叶盘分化初次筛选培养基T1上培养，一段时间后，换用叶盘分化二次筛选培养基T2，直至分化出可见Kmr芽；(6)将Kmr芽连同外植体一同移入不定芽伸长筛选培养基Y继代培养；(7)待Kmr芽伸长至一定长度，将每个Kmr芽分离独立接入不定芽伸长筛选培养基Y筛选，2-3周继代一次，至Kmr芽长至一定长度后，移入生根筛选培养基G。
2.根据权利要求1所述的一种杨树的农杆菌基因转化方法，其特征在于在步骤(1)中所述新疆杨试管苗以根部萌蘖芽方式继代繁殖，所述的基本培养基为1/2MS，蔗糖25-30g/L，pH5.6-5.8，琼脂6-7g/L，121±1℃，灭菌16-20min。
3.根据权利要求1所述的一种杨树的农杆菌基因转化方法，其特征在于在步骤(2)中所述的预培养条件为，培养温度25±2℃，光照3000-4000lux，光照时间16-18小时/天。
4.根据权利要求1所述的一种杨树的农杆菌基因转化方法，其特征在于在步骤(2)中所述叶盘分化培养基T为1/2MS中的细胞分裂素TDZ浓度为0.005-0.006mg/L，细胞分裂素BA浓度为0.15-0.25mg/L，细胞分裂素ZT浓度为0.15-0.25mg/L，生长素IAA浓度为0.4-0.5mg/L。
5.根据权利要求1所述的一种杨树的农杆菌基因转化方法，其特征在于在步骤(3)中所述的YEB液体培养基中四环素的浓度为3-5mg/L、链霉素浓度为20-30mg/L。
6.根据权利要求1所述的一种杨树的农杆菌基因转化方法，其特征在于在步骤(3)中所述基本培养基MS液体培养基悬浮菌体的OD600值为0.3-0.4。
7.根据权利要求1所述的一种杨树的农杆菌基因转化方法，其特征在于在步骤(5)中所述叶盘分化初次筛选培养基T1为叶盘分化培养基T中的Cef浓度为40-50mg/L，Km浓度为10-15mg/L；叶盘分化二次筛选培养基T2为叶盘分化培养基T中的Cef浓度为40-50mg/L，Km浓度为10-20mg/L；叶柄分化筛选培养基T3为叶盘分化培养基T中的Cef浓度为40-50mg/L，Km浓度为20-25mg/L。
8.根据权利要求1所述的一种杨树的农杆菌基因转化方法，其特征在于在步骤(6)中所述不定芽伸长筛选培养基Y为1/2MS中的细胞分裂素BA的浓度为0.1-0.2mg/L，生长素IAA的浓度为0.1-0.2mg/L，Cef的浓度为40-50mg/L，Km的浓度为20-30mg/L。
9.根据权利要求1所述的一种杨树的农杆菌基因转化方法，其特征在于在步骤(7)中所述生根筛选培养基G为1/2MS中的Cef浓度为50mg/L，Km的浓度为10mg/L。
全文摘要
本发明公开了一种杨树(新疆杨)的农杆菌基因转化方法，该方法包括从外植体选择、培养基筛选、激素调配、抗生素敏感性、培养条件等方面建立新疆杨高效遗传转化受体技术系统，本发明的有益效果是通过建立高效的新疆杨遗传转化系统，在短时间内可选育出新疆杨抗逆新品种。
文档编号C12N15/82GK1657629SQ200510037948
公开日2005年8月24日 申请日期2005年3月3日 优先权日2005年3月3日
发明者诸葛强, 王婕琛, 陈英, 黄敏仁, 王明庥, 潘惠新, 李火根, 王光萍 申请人:南京林业大学