专利名称：一种血管平滑肌的消化方法
技术领域：
本发明涉及一种血管平滑肌的消化方法，属于生物医学技术领域。
背景技术：
血管平滑肌细胞培养常用的方法有贴块法(explant)和酶解离法(enzymedisperse)。贴块法具有获得平滑肌细胞纯度高，量多，操作简便的优点。但用贴块法易使平滑肌细胞胞质内肌丝丧失，亚细胞器增加。相反，酶解离法，由于酶的作用使细胞间失去连接，细胞内肌丝含量丰富，保持收缩型状态且形态分化良好，故可用于研究细胞表观变化和影响细胞收缩的因素。
要进行酶解离法培养血管平滑肌细胞，首先必须解决血管平滑肌的消化问题。现有消化方法主要有1、涂永生等“II型胶原酶/弹性蛋白酶消化法培养大鼠血管平滑肌细胞”，《中国动脉硬化杂志》2001，9(5)438-440.中提出，血管平滑肌分两次消化，首先将动脉用Hanks液漂洗2～3次，并剪去血管外脂肪及结缔组织，放入2g/L胶原酶II(1ml/aorta)消化液中消化20～30min。然后，用5号镊子夹住外膜，向相反方向柔和拉扯除掉外膜。将动脉(aorta)置于含10％新生牛血清(Newborn Calf Serum，NCS)的DMEM(Dulbcco’sModifed Eagle Medium，Dulbecco’s改良的Eagle’s培养基)中孵育24h。然后取出动脉，再放入含2g/L胶原酶II以及0.25g/L弹性蛋白酶的复合消化液中，每条动脉所需的消化液的量为1.5ml，在5％CO2、37℃培养箱中孵育2h左右。
2、高平进等“蛋白激酶Ca与血管平滑肌细胞表型转化”，《中华心血管病杂志》1999，27(6)453-455.中提出，分离主动脉，用胶原酶3mg/ml，弹性蛋白酶1mg/ml，大豆胰蛋白酶抑制剂1mg/ml，牛血清白蛋白1mg/ml分离血管平滑肌细胞。
3、李智等“大鼠肺动脉平滑肌细胞的培养”，《中国医科大学学报》1996，25(3)221-224.中提出，在通入95％O2和5％CO2的混合气体的冰浴Hanks液中，将Sprague-Dawley(SD)大鼠肺动脉剪成约1～2mm3的碎块，此碎块经0.2％的胶原酶和0.0125％的弹性蛋白酶(1∶1)3ml消化，在37℃的恒温震荡水浴中孵育20min后将含有细胞及其它组织的上清液吸掉，沉淀加入0.1％的胶原酶和0.0125％的弹性蛋白酶(1∶1)3ml再孵育40min，两次孵育过程中需通入混合气体。上清用10％FBS(胎牛血清)一PNM(0.1M NaH2PO4，0.1M Na2HPO4(pH8.0)，0.1％Nonidet P-40；5％nonfat dry milk；0.02％sodium azide)液中止反应；沉淀加入0.125％胰蛋白酶1ml混匀，再二氧化碳孵箱37℃孵育5min。
4、王关嵩等“2种酶消化法培养大鼠血管平滑肌细胞生长特性的比较《第三军医大学学报》1999，21(10)765-767.中提出，单独用胶原酶消化先用钟表镊将动脉撕成1mm×1mm左右的小条，放入预先盛有2～3ml0.2％的胶原酶液，盖紧瓶塞，置摇摆仪上37℃25次/min振摆10～12h。复合酶消化先用钟表镊将动脉撕成1mm×1mm左右的小条，放入2ml 0.2％的复合消化酶液(包括胶原酶、弹性蛋白酶和胰蛋白酶)中，于37℃ CO2孵箱培养30～40分钟。
以上几种消化方法，有的所用的酶种类及数量多，成本过高，步骤繁琐，如高平进等用胶原酶、弹性蛋白酶、大豆胰蛋白酶抑制剂和牛血清白蛋白消化培养血管平滑肌；有的消化时间过长，使细胞在酶环境中暴露时间过长，不利于细胞的存活，如王关嵩等将血管平滑肌置摇摆仪上37℃25次/min振摆10～12h；有的将血管平滑肌暴露在胰蛋白酶环境中时间过长，造成大量细胞细胞膜损害，如涂永生等将血管平滑肌放入含2g/L胶原酶II以及0.25g/L弹性蛋白酶的复合消化液中(1.5ml/aorta)，在5％CO2、37℃培养箱中孵育2h左右。
发明内容
本发明提供了一种血管平滑肌的消化方法，使用的酶的种类少，成本低；步骤简便。
本发明的方法步骤如下a.将处理好的血管平滑肌组织块置于离心管中，加入平滑肌组织体积8-10倍的、用DMEM配制的0.15％胶原酶II溶液，置于37℃水浴箱中作用1.2h-1.5h至组织呈絮状，弃去上清液。
上述DMEM(Dulbcco’s Modifed Eagle Medium)是Dulbecco’s改良的Eagle’s培养基。
b.再用平滑肌组织体积3-5倍的0.02％乙烯二胺四乙酸(ethylene diaminetetra-acetic acid，EDTA)清洗消化成絮状的平滑肌组织，以消除来自培养基中所有的二价离子，以便保持胰蛋白酶的活性。
c.加入平滑肌组织体积3-5倍的0.125％胰蛋白酶溶液，于37℃水浴振荡消化1-2次，每次10min-15min，得分散的平滑肌细胞悬液。
d.再向分散的平滑肌细胞悬液中加入新生牛血清，经3000r离心7min-8min，弃去上清液。
上述新生牛血清是纯新生牛血清或含10-20％新生牛血清的DMEM培养液。
纯新生牛血清用量为胰蛋白酶量的1/15-1/10。
所加含10-20％新生牛血清的DMEM培养液的量为胰蛋白酶量的1/3-1/2。
e.加入含20％新生牛血清的DMEM培养液，并用吸管吹打分散细胞，用计数板计数细胞，调节细胞密度为5×104～5×105个/ml。
f.将调整好密度的细胞悬液2～3ml，接种于25ml培养瓶中。放入5％CO2、37℃培养箱中培养。24h后有少量贴壁平滑肌细胞，3-4天更换新鲜培养液，当细胞达到70％～80％融合，即可。
上述新鲜培养液是含10％新生牛血清的DMEM培养液。
以上各组分的浓度均为重量百分比。
消化好的血管平滑肌用于按常规方法传代。
经实验证实该消化方法缩短了消化时程，对细胞膜的损害程度轻，利于细胞的存活；并且两种酶作用互补，消化充分，收集的细胞数量多、纯度高；同时更好地保护了离体细胞的性状和代谢。
由于该方法使用的酶的种类少，成本低；步骤简便，效果优于现有的其它消化方法，可大大提高工作的可行性、准确性和重复性，在进行酶解离法血管平滑肌培养时具有独特的优点。
本发明适用范围广，可用于医学、生物学等领域。
与其它方法相比，本方法主要有以下优良效果①血管平滑肌在胰蛋白酶中暴露时间短，缩短了消化时程，对细胞膜的损害程度轻，利于细胞的存活。
②两种酶作用互补，消化充分，收集的细胞数量多。
③具有良好的选择性，细胞纯度高。
④更好地保护离体细胞的性状和代谢。
具体实施方式
实施例1材料与方法1.1试剂胶原酶II型(Sigma)0.15％；胰蛋白酶(Sigma)0.125％；D-Hanks液各成分均为市售分析纯；新生牛血清(NCF)及DMEM均为哥兰德岛生物公司(Grand IslandBiological Company(GIBCO))产品。均为重量百分比。
1.2取材SD大鼠购自山东大学医学院实验动物中心。于无菌超净台中打开胸腔，剪掉心脏放血，迅速取出胸主动脉(起于左锁骨下，止于动脉进入膈的部位)，浸泡入装有无菌DMEM的培养皿中，漂洗2～3次，并剪去血管外脂肪及结缔组织。
1.3消化将处理好的血管平滑肌组织块0.2ml置于10ml离心管中，加入用DMEM配制的0.15％胶原酶II溶液1.8ml，在37℃水浴箱中作用1.5h，至组织呈絮状，弃去上清液；用1ml0.02％EDTA清洗消化成絮状的平滑肌组织，然后，加入0.125％胰蛋白酶溶液1ml，于37℃水浴振荡消化10min，即可得到分散的平滑肌细胞。均为重量百分比。
1.4培养向盛有细胞悬液的刻度离心管中，加入用DMEM配制的10％的新生牛血清0.5ml，终止酶的作用。过200目网，3000r离心7min，弃去上清液。加入用DMEM配制的20％新生牛血清的培养液，轻轻吹打，并用计数板计数细胞，调节(细胞密度＝细胞数/毫升原液＝4大格细胞总数/4×10,000×稀释倍数，通过改变稀释倍数调节细胞密度)细胞密度为5×104～5×105个/L，将调整好密度的细胞悬液2～3ml，接种于25ml培养瓶中，放入5％CO2、37℃培养箱中培养。24 h后便可看到少量贴壁平滑肌细胞，第4天更换新鲜培养液(用DMEM配制的10％的新生牛血清)。均为重量百分比。第6天细胞达到75％融合时即可按常规方法传代。取第3-4代细胞进行生物学特性鉴定。
1.5鉴定将培养的血管平滑肌细胞滴种于培养皿里的事先涂好多聚赖氨酸的盖玻片上，2～3天贴壁生长后，依次做如下处理培养皿里加入1/3培养液体积的10％多聚甲醛(三蒸水配制，pH7.2)，预固定15min(在37℃培养箱中温育)，倾去培养液并用0.01M的PBS(磷酸盐缓冲液)漂洗3遍，每次5分钟，再用10％多聚甲醛固定20min，然后用PBS冲洗。采用小鼠抗大鼠α-Actin免疫组织化学染色，鉴定血管平滑肌细胞肌动蛋白，以胞浆棕黄色为阳性结果。
1.6传代细胞成活率取消化传代的血管平滑肌细胞悬液9滴，加入1滴0.4％台盼蓝液，混匀后吸取1滴于细胞计数板上，置显微镜下观察，凡着色细胞均为不正常细胞或死亡细胞。共计数1000个细胞，计算细胞成活率。
2结果2.1细胞生长情况接种第2天，即可见到细胞贴壁，贴壁的原代细胞大小不等，形状多样，有梭形、三角形或星形等。核位于中央，核中有1个或数个大小不一、深色的核仁，胞浆丰富。传代细胞接种于培养瓶，24h时大多数细胞已贴壁伸展，随着时间的延长透明度渐增高，并相互接触，呈典型的“谷与峰”生长。
2.2肌动蛋白的免疫组织化学染色运用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶(SP)法对血管平滑肌肌动蛋白免疫组织化学染色，96％的细胞染色阳性。倒置显微镜下可见胞质中有较多的条丝状物，呈棕黄色，即为肌动蛋白。胞核为淡蓝色。
2.3台盼蓝染色结果共计数1000个细胞，其中30个为阳性，有97％以上的细胞染色呈阴性，表明培养的细胞消化传代成活率较高。
权利要求
1.一种血管平滑肌的消化方法，步骤如下a.将处理好的血管平滑肌组织块置于离心管中，加入平滑肌组织体积8-10倍的、用DMEM配制的0.15％胶原酶II溶液，置于37℃水浴箱中作用1.2h-1.5h至组织呈絮状，弃去上清液；b.再用平滑肌组织体积3-5倍的0.02％乙烯二胺四乙酸清洗消化成絮状的平滑肌组织；然后c.加入平滑肌组织体积3-5倍的0.125％胰蛋白酶溶液，于37℃水浴振荡消化1-2次，每次10min-15min，得分散的平滑肌细胞悬液；d.再向分散的平滑肌细胞悬液中加入新生牛血清，经3000r离心7min-8min，弃去上清液；e.加入用DMEM配制的含20％新生牛血清的培养液，用计数板计数细胞，调节细胞密度为5×104～5×105个/ml；f.将调整好密度的细胞悬液2～3ml，接种于25ml培养瓶中，放入5％CO2、37℃培养箱中培养，第3-4天更换新鲜培养液，细胞达到70％～80％融合，即可；以上各组分的浓度均为重量百分比。
2.如权利要求1所述的血管平滑肌的消化方法，其特征在于，步骤d中所述的新生牛血清是纯新生牛血清或含重量百分比10-20％新生牛血清的DMEM培养液。
3.如权利要求1所述的血管平滑肌的消化方法，其特征在于，步骤d中所述的新生牛血清是纯新生牛血清时，用量为胰蛋白酶量的1/15-1/10。
4.如权利要求1所述的血管平滑肌的消化方法，其特征在于，步骤d中所述的新生牛血清是含重量百分比10-20％新生牛血清的DMEM培养液时，用量为胰蛋白酶量的1/3-1/2。
5.如权利要求1所述的血管平滑肌的消化方法，其特征在于，步骤f中所述的新鲜培养液是含重量百分比10％新生牛血清的DMEM培养液。
全文摘要
一种血管平滑肌的消化方法，属于生物医学技术领域。向血管平滑肌组织块中，加入用DMEM配制的0.15％胶原酶II溶液，水浴箱中作用1.5h，至组织呈絮状，用0.02％的EDTA清洗，然后，加入0.125％胰蛋白酶溶液，于37℃水浴振荡消化，即可得到分散的平滑肌细胞，用10％新生牛血清的培养液终止酶的作用。加入含20％新生牛血清的培养液，调节细胞密度为5×10
文档编号C12N5/08GK1673357SQ200510042438
公开日2005年9月28日 申请日期2005年2月3日 优先权日2005年2月3日
发明者邢毅, 李振中, 王钰童, 李淑玲, 黄飞, 李永刚 申请人:山东大学