专利名称：中国对虾c－型凝集素基因及其编码的c－型凝集素多肽与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种凝集素基因及其编码的蛋白与应用，尤其涉及一种中国对虾C-型凝集素基因及其编码的C-型凝集素多肽与应用；属基因工程技术领域。
背景技术：
无脊椎动物遭受病原感染后可激活多种细胞和体液免疫反应，从微生物侵袭到最终清除病原一般要经过下列几个步骤首先这些无脊椎动物必须能够识别外来异物，称为感染的非己识别(Recognition of infectious non-self)；随后，引发了激活丝氨酸蛋白酶和解除丝氨酸蛋白酶抑制剂的细胞外级联反应，从而将受到感染的信号放大为更强的“危险”信号或解除错误警报，这个过程称为信号的调整和放大(Signal modulationand amplification)；然后引发信号转导途径(Signal transduction pathway)，而导致目的基因的转录活性；最后，激活了效应物反应系统。
虽然有很多效应物基因的功能还不为人们所知，但有3大类效应物系统是很清楚的即抗菌肽、酚氧化酶依赖性黑化系统和凋亡相关基因系统。
下面主要阐述先天免疫的起始步骤——免疫识别受体研究方面的进展。
以前对无脊椎动物识别侵染微生物的机制了解的很少，近几年来这方面的研究进展很快。现在基本证实这种“非己”识别是因为存在某些特异性的、可溶的或与细胞膜结合的模式识别受体(pattern recognition receptors，PRRs)，也称为模式识别蛋白或模式识别分子。虽然它们没有高等动物B细胞和T细胞系统显著的特异性，但可以识别或结合那些微生物表面保守的、而在宿主中又不存在的病原相关分子模式，如脂多糖(LPS)、肽聚糖(peptidoglycans)和甘露聚糖(mannans)等。识别后，这些受体通过激活存在于血淋巴的蛋白酶和利用免疫反应组织的细胞内信号转导途径而引起免疫反应。免疫识别受体还可以作为促进吞噬的调理素，也可以是凝集、黑化或其他蛋白质修饰级联反应等免疫过程的起始因子。关于这些免疫识别受体的分类，不同的作者意见不一，有人将高等动物包括人类中发现的PRR分为7个家族，即C型凝集素、富亮氨酸蛋白、清除受体、五聚体蛋白、脂类转移酶、整合素和补体调节蛋白。最近有的学者将在果蝇和按蚊中发现的模式识别受体分为6种类型肽聚糖识别蛋白，含硫酯键蛋白，革兰阴性菌结合蛋白，清除受体，C-型凝集素和硫依赖型凝集素。
模式识别受体的研究，实际上是研究先天免疫系统识别“自己”与“非己“的本质，这对深入了解无脊椎动物的先天免疫的功能与调节机制、对免疫学研究的完整性和学科发展具有重要的理论意义，同时可为经济动物免疫防治策略的制定提供指导。因此进行该方面的研究具有重要的理论和实际意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种从对虾中克隆的模式识别受体——中国对虾C-型凝集素基因序列，并提供其克隆方法与载体。
本发明的中国对虾C-型凝集素基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；其所示信息为(a)序列特征*长度557碱基对*类型核酸*链型双链*拓扑结构线性(b)分子类型cDNA(c)假设否(d)反义否(e)最初来源对虾(Fenneropenaeius chinensis)(f)序列描述SEQ ID NO.1atgaagttcc tggcgccggt tattcttact acgttgatct ccgtcgctgc gtcagccagt 60gtccgtgcga ccgagtgccc ctccccctac gagcccctgg acgaaacgag gtgcattttc 120ttggacgcct tcgtcagcta cacttggcaa gagacggttg acttgtgcaa gagccacggc 180ggagaaatcc tgacaatcga ggactgcgag acgttcgccc ttgtctatga ctacatcagg 240agccaggatg tcacgaaagg aaaacactac tggttaggag caaccgatga agtagaagaa 300ggcacatgga aatttgtaaa caacagactc actcccatgg gcattcctta ctggggtgta 360aacgagccta acaatgggaa tacctacaac tgcgctatga tgcatgctag ttataaccat 420tattggtacg atgccgcgtg cggaagcaag tataacccca tttgtctcaa gaattattaa 480aaagtgcatg ggcaagggag cactgtgata aaaggtacga cttggaaatg aagagacagc 540taaaaaaaaa aaaaaaa557本发明的另一个目的是提供一种由中国对虾C-型凝集素基因编码的C-型凝集素多肽，它具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；其所示信息为(a)序列特征*长度159氨基酸*类型氨基酸*链型单链*拓扑结构线性(b)分子类型蛋白质(c)序列描述SEQ ID NO.2Met Lys Phe Leu Ala Pro Val Ile Leu Thr Thr Leu Ile Ser Val5 10 15Ala Ala Ser Ala Ser Val Arg Ala Thr Glu Cys Pro Ser Pro Tyr20 25 30Glu Pro Leu Asp Glu Thr Arg Cys Ile Phe Leu Asp Ala Phe Val
35 40 45Ser Tyr Thr Trp Gln Glu Thr Val Asp Leu Cys Lys Ser His Gly50 55 60Gly Glu Ile Leu Thr Ile Glu Asp Cys Glu Thr Phe Ala Leu Val65 70 75Tyr Asp Tyr Ile Arg Ser Gln Asp Val Thr Lys Gly Lys His Tyr80 85 90Trp Leu Gly Ala Thr Asp Glu Val Glu Glu Gly Thr Trp Lys Phe95 100 105Val Asn Asn Arg Leu Thr Pro MET Gly Ile Pro Tyr Trp Gly Val110 115 120Asn Glu Pro Asn Asn Gly Asn Thr Tyr Asn Cys Ala Met Met His125 130 135Ala Ser Tyr Asn His Tyr Trp Tyr Asp Ala Ala Cys Gly Ser Lys140 145 150Tyr Asn Pro Ile Cys Leu Lys Asn Tyr155其中，还包括SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的变异体，它编码具有少于8个氨基酸改变的同源变异蛋白，而且氨基酸改变是保守性氨基酸改变。
本发明的中国对虾C-型凝集素cDNA的克隆方法是采用一步法或RNA kit从对虾中提取总RNA，或者用mRNA kit分离提取mRNA。然后利用总RNA或mRNA反转录合成cDNA；其中根据对虾C-型凝集素的保守序列设计的引物为正向引物5’GGT GCA TTT TCT TGG ACG CCT-3’反向引物5’ATG GGA GTG AGT CTG TTG TTT-3’PCR反应条件为首先94℃变性2分钟，然后进入下列循环94℃ 30秒，53℃ 45秒，72℃ 45秒，共进行30个循环，最后72℃延伸10分钟。
纯化通过链式聚合酶反应(PCR)扩增获得DNA片段；取上述纯化产物克隆到pGEM-T Easy载体(Promega公司产品)或pMD 18-T载体(TaKaRa公司产品)，转化DH5α细胞(常用载体宿主细胞)，平板培养；提取并纯化质粒，扩增质粒并测序；再经过3’和5’末端快速扩增，将3’和5’端序列拼接，即得SEQ ID NO.1所示中国对虾C-型凝集素基因全长核苷酸序列。
本发明的中国对虾C-型凝集素基因在制备具有抗菌活性的重组蛋白中的应用。
其中，上述应用的方法是通过基因重组技术使所述基因在大肠杆菌、酵母和昆虫核型多角体病毒中进行表达，获得具有抗菌活性的重组蛋白。
例如将获得的中国对虾C-型凝集素基因克隆到pET-30a(Novagen公司)表达载体，转化大肠杆菌BL21 DE3细胞，进行诱导表达，纯化；并利用获得重组蛋白进行抑菌实验。
其抗菌谱和最小抑菌浓度(以菌体不生长的浓度为最小抑菌浓度)见表1。
表1中国对虾C-型凝集素最小抑菌浓度
利用本发明的中国对虾C-型凝集素基因通过基因工程方法将其转入作物，可以获得具有抗菌能力的作物。
利用本发明的方法通过现有基因工程方法修饰中国对虾C-型凝集素基因，还可用于其他研究和生产。
利用本发明获得的重组的C-型凝集素可用于抗菌的饲料添加剂、食品保存、动植物基因转化和药物开发。
图1中国对虾C-型凝集素的重组表达其中1诱导前菌株，2诱导后菌株，3细胞破碎后的上清液，4细胞破碎后的沉淀，5纯化的C-型凝集素，M标准Marker。
具体实施例方式
实施例1中国对虾C-型凝集素cDNA的克隆1)总RNA的提取采用现有技术一步法提取总RNA。
2)cDNA第一链合成6微克总RNA，加反应液20微升，反应液是50毫摩尔氯化钾和3毫摩尔氯化镁混合液，10毫摩尔三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(Tris-HCl)pH8.3，1毫摩尔二硫苏糖醇(DTT)，5微摩尔寡聚脱氧胸腺核苷酸(Oligod(T)17)，500微摩尔脱氧核糖核苷酸混合物(dNTP)，25单位RNA酶抑制剂，8单位AMV逆转录酶，42℃反应90分钟，70℃ 10分钟终止反应。
3)PCR反应链式聚合酶反应(PCR)试剂与条件首先将下列试剂混在一起
·10xTaq DNA聚合酶缓冲液5微升(μl)·模板cDNA 1μl·正向引物(1.25μg/μl)1μl·反向引物(1.25μg/μl)1μl·脱氧核苷酸混合物(dNTP) 4μl·Taq DNA聚合酶0.25μl·灭菌水 37.75μl·总体积 50μl根据对虾C-型凝集素的保守序列设计的引物为正向引物5’GGT GCA TTT TCT TGG ACG CCT-3’反向引物5’ATG GGA GTG AGT CTG TTG TTT-3’PCR反应条件为首先94℃变性2分钟，然后进入下列循环94℃ 30秒，53℃ 45秒，72℃ 45秒，共进行30个循环，最后72℃延伸10分钟。
4)反应产物纯化利用德国奎因(QIAGEN)公司产品QIAquick Gel Extraction Kit，操作步骤按产品说明书进行。
5)对虾C-型凝集素cDNA克隆取纯化产物3微升，连接于pGEM-T Easy载体(Promega公司产品)。转化到大肠杆菌DH5α菌株，在含有氨苄青霉素(100微克/毫升)、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal 0.2微克/毫升)和异丙基硫代半乳糖苷(IPTG0.1摩尔/毫升)的平板生长过夜，挑取3个白斑，在LB液体培养基(5毫升，含100微克/毫升安苄青霉素)中培养过夜。
6)质粒纯化收取过夜培养菌液2毫升，离心(10000转/分，1分钟)收集细胞。用微量DNA纯化试剂盒(Wizard plus SV Minipreps DNA Purification System，美国普洛麦格Promega公司)纯化质粒，纯化步骤按说明书进行。
7)序列测定与同源检索取纯化质粒4微升，用载体引物T7进行全自动测序(本工作在上海生工公司完成)。将所得序列与基因库序列比较。
8)对虾C-型凝集素cDNA 3’端快速扩增根据得到抗菌肽基因片段后，又设计一条特异性正向引物F35’-GTT TAC AAA TTTCCA AGT CCC TTC-3’，进行cDNA 3’端快速扩增，操作步骤按宝生物3’RACE试剂盒说明书进行。
取血细胞总RNA约20μg，其他试剂的调制和反应条件按说明书进行。用特异性引物F3与3’接头进行3’端PCR扩增，采用55℃退火，其余与上述的PCR扩增程序相同，对所得产物按前述方法进行克隆、验证和测序。
9)对虾C-型凝集素cDNA 5’端克隆按CLONTECH公司(美国)SMARTTMPCR cDNA文库构建试剂盒说明书进行，包括下列步骤第一链cDNA合成1.0μl RNA样品(0.05-1.0μg总RNA)
1.0μl SMART寡核苷酸(5’TACGGCTGCGAGAAGACGACAGAAGGG-3’)1μlCDS/3’PCR引物2.0μl 水将上述试剂在0.5ml离心管内混匀，72℃孵育2分钟。再冰浴2分钟，然后加入下列试剂2.0μl 5x第一链缓冲液1.0μl DTT(20mM)1.0μl dNTP(10mM)1.0μl MMLV逆转录酶10μl 总体积混匀，42℃孵育1小时，冰浴终止反应。
以上述cDNA为模板，以试剂盒提供的5’PCR引物和反向引物5’TGT CCT TAC CCCTAC GAG CCC CTG 3’为引物进行PCR扩增，获得对虾C-型凝集素cDNA的5’序列。
将3’和5’端序列拼接，即获得SEQ ID NO.1所示中国对虾C-型凝集素基因全长核苷酸序列。
实施例2重组表达载体构建、表达与抑菌功能测定(1)根据中国对虾C-型凝集素的序列和表达载体pPET30a(Novagen公司)的克隆位点，设计引物LEC-pet F5’AAT ATTGAA TTCATG AAG TTC CTG GCG CCG GTT 3’(EcoR1)LEC-pet R5’GCC CGACTC GAGTTA ATA ATT CTT GAG ACA AAT G 3’(Xhol)本发明选择了pET30a克隆位点的EcoR I和Xho I酶切位点，因此，设计引物时在上游引物引入了EcoR I酶切位点，下游引物上引入了Xho I酶切位点。
(2)基因扩增、克隆与重组质粒筛选以pMD-18T-Lec为模板，用上述引物进行PCR反应，扩增条件为94℃，2min预变性；94℃，30s，56℃，45s，72℃，45s，35个循环；72℃延伸10min。
2％的琼脂糖凝胶电泳PCR产物检测。
将PCR产物作制备电泳，用UNIQ-5 Column DNA Gel Extraction Kit(上海生工产品)回收、纯化PCR产物，经过EcoR I和Xho I内切酶酶切，切下两端带有Xho I和EcoR I内切酶位点的家蝇防御素成熟肽cDNA片段，同样表达载体pET30a经过EcoR I和Xho I内切酶酶切，暴露出多克隆位点两端的Xho I和EcoR I内切酶位点。然后，将酶切后的扩增产物与表达载体用T4 DNA连接酶连接，转化DH5α感受态细胞，LB+Amp平板PCR筛选阳性克隆。挑取PCR筛到的菌落，37℃振荡扩增培养并抽提质粒，EcoR I和Xho I双酶切与测序验证后，即为重组表达质粒pET30a-Lec。接转化E.coli表达菌株BL21 DE3感受态细胞，涂布LB+Amp平板，37℃倒置过夜培养。
(3)筛选表达菌株从上述LB+Amp平板上挑取8个单克隆菌落，2ml LB+Amp液体培养基37℃振荡过夜培养，次日，取20μl过夜培养液加入到2ml LB+Amp液体培养基中转培养，37℃振荡培养3h，至OD600在0.5～0.7之间，然后加入IPTG至终浓度为1mmol，继续37℃振荡培养诱导表达4h。诱导前，随机从一个样品中取出0.5ml菌液，电泳检测时作未诱导对照。
表达完后，各取0.5ml菌液，5000r/min离心5min收集细胞，包括未诱导的样品，重悬于100μl去离子水中，以此为电泳样品作12.5％的SDS-PGAE。根据电泳结果，鉴定表达菌株。
(5)重组C-型凝集素表达与纯化挑取表达菌株单克隆在LB+Amp液体培养基中37℃过夜振荡培养，次日，按照体积比1∶100加入到100ml LB+Amp培养基中转培养，37℃振荡培养3h后，再加入IPTG至终浓度为1mmol，再37℃振荡诱导培养4h。诱导前取出0.5ml的菌液，作为诱导前对照样品。诱导培养完后，菌液在合适的离心管中7000r/min离心10min收集细胞，细胞重悬于5ml预冷的1×PBS，加入50μl 20％的Triton X-100，充分混匀后冰浴30min。超声波破碎细胞，超声循环为超声1s；间隔1s；全程40s。重复4次，每次间隙时将菌液在冰浴中混匀，避免局部温度太高，使蛋白质变性。最后，将破碎后的菌液10000r/min离心15min，收集上清液和沉淀，上清液和沉淀分别留样、备用。
重组蛋白以包含体的形式存在，以常规方法经过包含体纯化、复性和亲和层析，即获得到了重组蛋白——重组C-型凝集素(见图1)。
(6)重组蛋白活性测定活性鉴定采用液体生长抑制方法。
分别取测试菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌等单菌落(见表1)LB过夜培养液，用LB液体培养基稀释到OD600＝0.01(约106左右)为测试菌液。取100μl测试菌液分别与10倍稀释的重组C-型凝集素样品混匀，于96孔培养板30℃振荡培养，每隔1h用酶标仪测A630吸收值，用Microsoft Excel处理数据，绘制生长曲线图，以氨苄青霉素和Elution Buffer为对照。
抑菌实验结果其抗菌谱和最小抑菌浓度(以菌体不生长的浓度为最小抑菌浓度)见表1。
表1中国对虾C-型凝集素最小抑菌浓度
序列表SEQ ID NO.1<110>山东大学<120>中国对虾C-型凝集素基因及其编码的C-型凝集素多肽与应用<141>2005-9-1<160>2<210>1<211>557<212>cDNA<213>对虾(Fenneropenaeius chinensis)<221>中国对虾C-型凝集素基因<222>(1)…(557)<400>1atgaagttcc tggcgccggt tattcttact acgttgatct ccgtcgctgc gtcagccagt 60gtccgtgcga ccgagtgccc ctccccctac gagcccctgg acgaaacgag gtgcattttc120ttggacgcct tcgtcagcta cacttggcaa gagacggttg acttgtgcaa gagccacggc180ggagaaatcc tgacaatcga ggactgcgag acgttcgccc ttgtctatga ctacatcagg240agccaggatg tcacgaaagg aaaacactac tggttaggag caaccgatga agtagaagaa300ggcacatgga aatttgtaaa caacagactc actcccatgg gcattcctta ctggggtgta360aacgagccta acaatgggaa tacctacaac tgcgctatga tgcatgctag ttataaccat420tattggtacg atgccgcgtg cggaagcaag tataacccca tttgtctcaa gaattattaa480aaagtgcatg ggcaagggag cactgtgata aaaggtacga cttggaaatg aagagacagc540taaaaaaaaa aaaaaaa 557SEQ ID NO.2<210>2<211>159<212>PRT<221>中国对虾C-型凝集素基因编码的C-型凝集素多肽<222>(1)…(159)<400>2Met Lys Phe Leu Ala Pro Val Ile Leu Thr Thr Leu Ile Ser Val5 10 15
Ala Ala Ser Ala Ser Val Arg Ala Thr Glu Cys Pro Ser Pro Tyr20 25 30Glu Pro Leu Asp Glu Thr Arg Cys Ile Phe Leu Asp Ala Phe Val35 40 45Ser Tyr Thr Trp Gln Glu Thr Val Asp Leu Cys Lys Ser His Gly50 55 60Gly Glu Ile Leu Thr Ile Glu Asp Cys Glu Thr Phe Ala Leu Val65 70 75Tyr Asp Tyr Ile Arg Ser Gln Asp Val Thr Lys Gly Lys His Tyr80 85 90Trp Leu Gly Ala Thr Asp Glu Val Glu Glu Gly Thr Trp Lys Phe95 100 105Val Asn Asn Arg Leu Thr Pro MET Gly Ile Pro Tyr Trp Gly Val110 115 120Asn Glu Pro Asn Asn Gly Asn Thr Tyr Asn Cys Ala Met Met His125 130 135Ala Ser Tyr Asn His Tyr Trp Tyr Asp Ala Ala Cys Gly Ser Lys140 145 150Tyr Asn Pro Ile Cys Leu Lys Asn Tyr15权利要求
1.一种中国对虾C-型凝集素基因，它具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；其所示信息为(a)序列特征*长度557碱基对*类型核酸*链型双链*拓扑结构线性(b)分子类型cDNA(c)假设否(d)反义否(e)最初来源对虾(Fenneropenaeius chinensis)(f)序列描述SEQ ID NO.1atgaagttcc tggcgccggt tattcttact acgttgatct ccgtcgctgc gtcagccagt 60gtccgtgcga ccgagtgccc ctccccctac gagcccctgg acgaaacgag gtgcattttc120ttggacgcct tcgtcagcta cacttggcaa gagacggttg acttgtgcaa gagccacggc180ggagaaatcc tgacaatcga ggactgcgag acgttcgccc ttgtctatga ctacatcagg240agccaggatg tcacgaaagg aaaacactac tggttaggag caaccgatga agtagaagaa300ggcacatgga aatttgtaaa caacagactc actcccatgg gcattcctta ctggggtgta360aacgagccta acaatgggaa tacctacaac tgcgctatga tgcatgctag ttataaccat420tattggtacg atgccgcgtg cggaagcaag tataacccca tttgtctcaa gaattattaa480aaagtgcatg ggcaagggag cactgtgata aaaggtacga cttggaaatg aagagacagc540taaaaaaaaa aaaaaaa 557
2.权利要求1所述中国对虾C-型凝集素基因编码的C-型凝集素多肽，它具有SEQ IDNO.2所示的氨基酸序列；其所示信息为(a)序列特征*长度159氨基酸*类型氨基酸*链型单链*拓扑结构线性(b)分子类型蛋白质(c)序列描述SEQ ID NO.2Met Lys Phe Leu Ala Pro Val Ile Leu Thr Thr Leu Ile Ser Val5 10 15Ala Ala Ser Ala Ser Val Arg Ala Thr Glu Cys Pro Ser Pro Tyr20 25 30Glu Pro Leu Asp Glu Thr Arg Cys Ile Phe Leu Asp Ala Phe Val35 40 45Ser Tyr Thr Trp Gln Glu Thr Val Asp Leu Cys Lys Ser His G1y50 55 60Gly Glu Ile Leu Thr Ile Glu Asp Cys Glu Thr Phe Ala Leu Val65 70 75Tyr Asp Tyr Ile Arg Ser G1n Asp Val Thr Lys Gly Lys His Tyr80 85 90Trp Leu Gly Ala Thr Asp Glu Val Glu Glu Gly Thr Trp Lys Phe95 100 105Val Asn Asn Arg Leu Thr Pro MET G1y Ile Pro Tyr Trp Gly Val110 115 120Asn Glu Pro Asn Asn Gly Asn Thr Tyr Asn Cys Ala Met Met His125 130 135Ala Ser Tyr Asn His Tyr Trp Tyr Asp Ala Ala Cys Gly Ser Lys140 145 150Tyr Asn Pro Ile Cys Leu Lys Asn Tyr155
3.权利要求2所述SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的变异体，它编码具有少于8个氨基酸改变的同源变异蛋白，而且氨基酸改变是保守性氨基酸改变。
4.权利要求l所述中国对虾C-型凝集素基因在制备具有抗菌活性的重组蛋白中的应用。
5.如权利要求4所述中国对虾C-型凝集素基因在制备具有抗菌活性的重组蛋白中的应用，其方法是通过基因重组技术使所述基因在大肠杆菌、酵母和昆虫核型多角体病毒中进行表达，获得具有抗菌活性的重组蛋白。
全文摘要
本发明公开了一种中国对虾C－型凝集素基因及其编码的C－型凝集素多肽，还公开了所述中国对虾C－型凝集素基因在制备具有抗菌活性的重组蛋白中的应用。利用本发明获得的重组的C－型凝集素可用于抗菌的饲料添加剂、食品保存、动植物基因转化和药物开发。
文档编号C12P21/02GK1766109SQ20051004458
公开日2006年5月3日 申请日期2005年9月13日 优先权日2005年9月13日
发明者王金星, 赵小凡 申请人:山东大学