专利名称：一种牙鲆“全鱼”溶茵酶基因重组质粒的制作方法
技术领域：
本发明涉及海洋生物牙鲆“全鱼”溶茵酶基因，具体地说是牙鲆c型溶菌酶基因的克隆和表达质粒的构建，尤其是一种牙鲆“全鱼”溶茵酶基因重组质粒。
背景技术：
溶菌酶(Lysozyme)是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶，因其有溶菌作用，故命名为溶菌酶。溶菌酶作为鱼类的非特异性免疫(先天性免疫)物质之一，在鱼体抵抗感染性致病菌的最前沿防御机制中起着重要作用。现已知，溶菌酶是一种呈抗生性的、由淋巴球分泌的溶解性酶.并主要作用于革兰氏阳性菌(G’菌)及某些特定的细菌；其主要方式之一是溶解细菌胞壁中的粘多糖。在鱼体内，溶菌酶主要存在于血液、肌肉和淋巴组织中；代表一定非特异性免疫水平的溶菌酶活性，在鱼体内比在哺乳动物体内更为重要，因为鱼类的特异性免疫(后天性免疫)系统还不完善。国外关于鱼类溶菌酶已有较深入研究，如B·Grinde等选择含溶菌酶较多的虹鳟作溶菌酶基因供体，向溶菌酶含量较少的种类(如大西洋鲑和鳕)的鱼卵中注射溶菌酶基因，从遗传上改善这些鱼类的免疫状况。
实验证明，溶菌酶参与了血清的非特异性防御过程，1973年netcher和1987年Sia4cki等分别在鲽科鱼类和鲤科鱼类中发现，溶菌酶的含量和活性都在免疫后大幅提高。溶菌酶还可与几丁质酶一起作用于细菌或其他病原的细胞壁，更有效地攻击病原。
发明内容
本发明的目的在于提供一种安全性好、可增强牙鲆鱼对病原抵抗能力的牙鲆“全鱼”溶茵酶基因重组质粒。溶菌酶来源于牙鲆鱼，名称为牙鲆“全鱼”溶茵酶重组质粒。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下一种牙鲆“全鱼”溶茵酶基因重组质粒，具有序列表中SEQ ID NO.1碱基序列。
所述牙鲆“全鱼”溶茵酶基因的编码蛋白，具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
本发明克隆了牙鲆鱼溶菌酶基因，然后连接到表达载体opAFP上。
本发明基因的目的、用途、意义如下该基因能够增强鱼类的免疫能力，将溶茵酶重组质粒质粒转入牙鲆鱼(转基因牙鲆)中也可以增强其免疫力，增强牙鲆鱼对病原的抵抗能力，从而提高产量。同时，从生物安全性角度考虑，本质粒完全克隆自鱼类自身的基因，有利于转基因鱼在水产养殖中得到应用。
图1为重组表达质粒opAFP-ly的构建过程中相关电泳图谱；其中，A示RT-PCR扩增出的长度约为486bp的Lysozyme基因；B示引物A、B筛选克隆opAFP-ly扩增出的长度约为692bp的阳性带；C示PstI酶切阳性克隆opAFP-ly，酶切片段长度约为1.8kb(图1C)的为插入片段为正向的阳性克隆；M1，M2为DNA size markers，M1为λDNA/HindIII，M2为100bp DNAladder plus；图2为经EcoR I酶切后的线性化全鱼基因元件模式图；其中，A示opAFPpromoter；B示opAFP 5’untranslated sequence；C示lysozyme gene；D示opAFP 3’sequence；图3为重组质粒构建的技术路线。
具体实施例方式
一种牙鲆“全鱼”溶茵酶基因重组质粒，具有如下特征(1)序列特征长度38716碱基对；类型核苷酸；链型单链；拓扑结构线性(2)分子类型DNA(3)假设否(4)反义否(5)最初来源牙鲆鱼(Paralichthys olivaceus)。
其序列如下GGATCCCCCAGAATGAGCTGGAACATGTTGCGGGGAGAGGGAAGTCTGGGTCAGCCTGCTTGGCCTGCTGCCACCGTGACCCGACCTCAGATAAGCGGAGGAAAATGGATGGATGGATTGAATCACAGAATGTTTCTGAAGACAGATATCACCTTCGCTTCAAAGAGGTGCGCACCTGGGCAGGCACCCACACAGCCACACAAATGGCATATGAATCAACCAAGAAGACGGTTGGAACTGGTCAAAACCTTCACTATACCATGTGTGACAGTTGTTTGTCACAGTGTATAAAAGACAGGGACTTAGAGACAGAGCTCTGAGCAGCTATGAGATTGTAGTTTGGCCAGGATGCGCTTAAGACCTTTGTGATGAAAAGTTATCAAATTCGTGAGTTTTCATGGAAGAACCTTGACGTGGCGTGGTGGCCATTTTGCGTCATTCGGCATGGAAAAGGAAGTCGTTATAACTCCCAGGTACATTATCTTATCTACACAAAATGTCTAATGCATGATACTACTTAAAGCCTGAGCATATTTCAAGGCCAGCACTTTTCAATAACTCATAGGCCACCTGCTGGCAAAAGGAAATGCCACATTTTATACTTTTATTTACTCCTAGACAGTTGACCTGATCAGTCTCAAATTTGGTAAGGATAGCCTTAAGACAATGAAGATGCTTCATCAGGAATATTGTGAGTTGTCGTTGAACGTTGTTGCCGTGGCAACGCATCATTCGCCATGAAAAAGAAGCTGATGGTTCAGTGGCTTGGGATGCTCAAAAAGTCATGGAACTTTGTACATGTGTCATAATTGATGGGAAGTTGTATGGGTTTTTGGCTTGCTTGTTATAAATTGTCTCCATAGCGCCCCCTACAATATTTCAAAAGAGCAGCCCCAGTGCTACGTACATGTATGAAACTTAGTAGCCAGATGTACCATATAGAGACTTACAAAAAGGTATCTTGGCCATGCTCTCAACCGTACTGGAAGTCGGCCATTTTGATTTTTGCATAATTTTTCAATAGATTTTTGCACATTTGTAATCGCTATACTTTAACGAACTCCTCCAAGGAACTTTGTCTAATCAATTTCAAATTTTGTCAGTACAATCTCAGTACTACAGTACCAAATCTACAGTTCTGCATCTCGTAGCTGCTCAGAGGTCTGTCTCTAAGTCCCTGTCTTTTATACACTGTGACAAACAACTGTCACACATGGTATAGTGAAGGTTTTGACCAGTTCCAACCGTCTTGTTGGTTGATTCATATGCCATTCGTGTGGCTGTGTGGGTGCCTACCCAGATGCGCACCTCTTTGAAGCGAATGTGATATCTGTCTTCATAAACATTCTGTTATTAGCAAGTTCATATGAGAATGAAGGCTGTATGCAAACAGGTGCACAGTCTGTTTCTAAGCATCATGGAAAAGTACAAGCAATTTGCACAAATCATTCTGTATTTTTCCAATAGCTAACAATGTCACCGGGACATTGTGCTATTGGATAGAAGAGACCAGCTGATCTAGACAGTTGATATCATGATCAACAGCCCCAAACAACAAGTGTGCATGCGCGAGGAGTGATTGGCAGATGTATGAGAACTAAACCACTGACTGAACTTGCACTAGAGGCATCTATTTTGTCTTTTCTCATATGATGTTGGGATGGCACATGGGAGTTTTTCCCCTGTCTCAGCTTGCTTTTTACCCCAAATATTGTATATCTATTAGAACCGTTGTCACAGGGTTCAAATTAACGTTTTAGTTTAGTTTTGATCATGATATACACATTTTATCCGTAAAGCATGTGCATATACAGTAAGGGCTTGTTATTCGACAGCAAGAAGAAGAGGATATGTGTGCAGGCAGTCAGCTAATGCATGGATCACAAGTTATAGAATGCAAGCTTGTGATAGTTTGGACAAAAACAAGTTATACTTTACTTATAAGAATATAAAATTTCCATTGCAATTGGCATAAGGAGGTGTGACACAGTGACCTACTTTCAGGCCAATAGGAAACGGGATATGCCGGTTAAGTCCTCCCACATACTGTATATTAGATGCAGCACATGGACCTGTCCTGTCAGAAGTCTCAGCTACAGCTTTCACTTCGATCCAGATCTTTTCACTTCGATCTCCGATAATTAATTAATTAATTAATTATTAATTAATTAAGTCTCAGCCACCGTTGACGATT AATCAGAGAAACATCATGAGGACTCTGGTGGTTCTGCTCCTCGTGGCTGTGGCCAACGCTCGAGTCTACGAACGCTGTGAATGGGCCCGACTGCTGAGAAATCAGGGGATGGATGGTTACCGTGGCATCAGTCTGGCTAACTGGGTTTGTCTGAGTGAGTGGGAGTCACGCTACAACACCAGAGCCACCAACCACAACACTGATGGATCCACTGACTACGGCATCTTCCAGATCAACAGTCGCTGGTGGTGTAACGACAGCCAGACGCCCACTTCTAACGCCTGTAACATCAGATGCAGTGAGCTTCTGACTGATGATGTCATTGTGGCGATCAAATGTGCCAAAAGAGTGGTCCGGGATCCAAACGGGATCGGAGCCTGGGTGGCGTGGCGTCAGCACTGTCAGGGCCAGGACCTGTCGTCCTATCTGGCAGGATGTGGTCTGTAAAAGCAACAT AATCTCTAGAGGATCCCCAACTGAACATGTCAAAACCTGTGGAGACTGTTGAGATTTGATGTTCTGAAAAGATAAAGCCTATAAATAAAATGTTGCCCAAATTTCCTGCCTGATGTTTTTCTTTGTCTTTGCTACATGGCTTTGCTGCTCGGATCGGCTCACTCTGTGTATGCCACGTTCACTTTGTACTCTCCTTCTCACGGTAGGTTTATTATTTTTAGATGTGCAGTTAGTTTCTGTGAAATAACACACCACACACTGATATTGTCTGTGCATTGACTTGGTGAGTGCACATTGTTTTTGATCTTGACATATTTATATTTGATTGATCAGGTGAACTGTGTGAATCTAAAGTGCTCCATACAGATGTTCTGCATTGAAAATATTCTCATTTTATTAGTGGAAGTGAGTGTATGCCACATCCAATCAATTTCAGCAAACACCCCAGTATGATTTAATGCAAAAAAATGAAGGTATCAAACACGCATTACTACTTTGCAGTTAAATATTTAACATTTATTCCAACACGAAAAAAAGCAGTAAATAACACTTTGACAAACACGTCAGGACATCTTATTTTTGTCACCCTCACAGGCAATTTAGTATAATATATTATATATATATATATATCATATAATAATATTCAGTATAATATATATATATATATCATATTATAATATTCAGTATAATATAAAACACAAACACATATATGTATAATATAATATAACATTTTTATTTATTGAGATGCCTCTATGGACCGTGTTATAAGAAGTAAAGATCAGGAGAAGTAAACATGAAGTGTAATTATGAATACTGATGTTAAATTAAGCTATGATGAGTTTTCACTGTTAATTTACCATCTCAATTAAATGTTGATGCCTCCATGACCAAGTTAAGCAGATGAGACTGAGACAACTGTAGAAGACAAGATGTTCACTTTGCTGAATATAGCTGGCTTGACAGTTATCTATGACTCTATAAATATATATATATTTTTTTTTTTATAAAATGATTTATTTATAACTATATATCCATTTCTCAGACAGGTGCTTCATATCCCTCACTCCCGTAGCTGTCCATGCTGGATCTGTCCCCGTTGTTTTTAAAAAGCTAAATAAGTTATTAACATGACTGCATCCAGCGAGCCAAACCTGTCTGGTGTACAGCTACCAGAGAAGCTT在序列中，带下划线的部份代表编码区，其序列为ATGAGGACTCTGGTGGTTCTGCTCCTCGTGGCTGTGGCCAACGCTCGAGTCTACGAACGCTGTGAATGGGCCCGACTGCTGAGAAATCAGGGGATGGATGGTTACCGTGGCATCAGTCTGGCTAACTGGGTTTGTCTGAGTGAGTGGGAGTCACGCTACAACACCAGAGCCACCAACCACAACACTGATGGATCCACTGACTACGGCATCTTCCAGATCAACAGTCGCTGGTGGTGTAACGACAGCCAGACGCCCACTTCTAACGCCTGTAACATCAGATGCAGTGAGCTTCTGACTGATGATGTCATTGTGGCGATCAAATGTGCCAAAAGAGTGGTCCGGGATCCAAACGGGATCGGAGCCTGGGTGGCGTGGCGTCAGCACTGTCAGGGCCAGGACCTGTCGTCCTATCTGGCAGGATGTGGT共426bp，在原序列上的位置为2230-2655。它编码的蛋白质序列为MRTLVVLLLVAVANARVYERCEWARLLRNQGMDGYRGISLANWVCLSEWESRYNTRATNHNTDGSTDYGIFQINSRWWCNDSQTPTSNACNIRCSELLTDDVIVAIKCAKRVVRDPNGIGAWVAWRQHCQGQDLSSYLAGCG，共142个碱基。俩个双下划线部分为RT-PCR的引物，两个之间的部分是RT-PCR的产物，碱基对2195-2690，共496bp。
其具体制备过程如下1牙鲆c型溶菌酶基因的分离a.RNA提取利用15月龄的牙鲆外周血(背部抽血)单个核细胞作为RNA提取来源。将细胞按照不低于1∶10(重量g体积ml)加入TRIZOL试剂(TRIROLTM试剂盒购自LIFE TECHNOLOGY公司)，冰上用研磨棒碾磨后，室温下温浴5分钟，然后按照每毫升TRIZOL加0.2毫升的氯仿的比例加入氯仿，剧烈振荡15秒，然后室温放置3分钟，然后4℃12000g离心15分钟；取水相，按照每毫升TRIZOL试剂加入0.5毫升异丙醇的比例加入异丙醇，混匀后室温温浴10分钟，然后4℃12000g离心10分钟；弃上清，用75％的乙醇(每毫升TRIZOL用1毫升75％的乙醇)洗涤沉淀，然后4℃7500g离心5分钟，弃上清，自然沉淀干燥，用无Rnase的水溶解沉淀；b.RT-PCR引物设计按照牙鲆(Paralichthys olivaceus)c型溶菌酶cDNA序列，设计一对RT-PCR引物P15’gtagctgcagctgtggagac，P2 5’aatcaccggagatgtttcag；P1 5’端带Pst I酶切位点；c.RT-PCR(RT-PCR试剂盒购自Promega公司)在10μl无Rnase的无菌水中加入2μgRNA和1μg引物，70℃水浴5分钟，然后立即放在冰上冷却。然后按照下列顺序加入试剂M-MLV 5×Reaction Buffer 5μl，dATP 10mM 1.25μl，dCTP 10mM1.25μl，dGTP 10mM 1.25μl，dTTP 10mM 1.25μl，rRNasinRibonuclease Inhibitor 25units，M-MLV RT 200units；加无Rnase的无菌水至25μl，轻轻混匀后42℃水浴60分钟，然后做PCR；PCR反应参数为95℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸45s；循环30次，72℃延伸10min。
2构建“全鱼”元件基因a.RT-PCR产物纯化使用试剂盒胶回收(小量)试剂盒(GelExtraction Mini Kit(Watson Biotechnologies)上海华舜生物工程有限公司，W5211)纯化产物。
将产物进行1％的琼脂糖电泳，切取目的片断胶块，称重后加入三倍体积的试剂盒中的S1液(上海华舜生物工程有限公司，W5211)，50℃水浴10分钟，使胶块完全融化，加入与S1液等体积的异丙醇，50℃水浴1分钟，将液体转移至吸附柱(上海华舜生物工程有限公司，W5211)中，12000rpm离心30秒，弃离出液，加入500微升试剂盒中的W1液上海华舜生物工程有限公司，W5211)，12000rpm离心15秒，弃离出液，加入500微升W1液，室温静置1分钟，12000rpm离心15秒，弃离出液，12000rpm离心1分钟；将吸附柱转移至干净的1.5毫升的离心管中，加入30微升试剂盒中的T1液(上海华舜生物工程有限公司，W5211)于柱中心，室温放置1分钟，12000rpm离心1分钟，零下20℃保存。
b.回收产物与载体的连接回收产物与PMD-T载体在T4DNA连接酶(takara)的作用下室温连接3小时；连接反应体系如下回收产物3μl；PMD-T载体1μl；10×连接缓冲液1μl；无菌水5μl；总体积10μl。
c.连接产物的转化加10微升连接产物至100微升感受态细胞DH-5α中，冰上放置35分钟，42℃水浴45秒，冰上放2分钟，加500微升LB液体培养基(蛋白胨1％酵母粉0.5％NaCl 0.5％)，37℃培养50分钟，铺于加10μl IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)和50μl X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)的含氨苄青霉素的LB平板上，37℃生长过夜。
d.转化产物的检测挑取白色单菌落(阳性克隆)接种于含有50μl/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃下220rpm振荡培养过夜；5000rpm 5分钟收集菌体，PCR方法检测确定阳性克隆PMD-T-ly，并送至博亚测序。
e.PMD-T-ly的小量提取挑取白色单菌落(阳性克隆)接种于含有50μl/ml氨苄青霉素的2.5毫升LB液体培养基中，37℃下220rpm振荡培养过夜；5000rpm 5分钟收集菌体，弃上清，加入200微升溶液1，剧烈振荡混匀，加入200微升溶液2，轻轻混匀，室温放置5分钟，加入200微升溶液3，混匀后冰上放置5分钟；然后12000rpm离心5分钟；转移上层液体至干净的1.5毫升的离心管，加入600微升异丙醇，混匀后冰上放置5分钟；然后12000rpm离心5分钟；把异丙醇抽吸净，加入300微升70％乙醇，振荡后12000rpm离心5分钟，将乙醇抽吸干净，风干后溶于40微升无菌水中。
其中溶液150mMol/L葡萄糖，25mMol/LTris·Cl(PH8.0)，10mMol/LEDTA(PH8.0)；溶液20.2MolNaOH，1％SDS；溶液35Mol/L；f.PMD-T-ly 2的双酶切和opAFP-V的单酶切用Sma I和HindII(Sangon公司)37℃双酶切PMD-T-ly(小量提取产物)2小时，用Hpa I(Sangon公司)37℃单酶切表达载体opAFP-V 2小时，其反应体系分别如下PMD-T-ly 2的双酶切反应体系Buffer Y+1μl，DDW 4μl，SmaI 1μl，HindII 1μl，DNA模板3μl，共10μl的反应体系。opAFP-V的单酶切反应体系Buffer Y+1μl，DDW 5μl，HpaI 1μl，DNA模板3μl，共10μl的反应体系。
g.酶切产物纯化后(方法同2-a)，将ly基因片段和线性化的表达载体opAFP-V在T4DNA连接酶(takara)作用下室温进行平末端连接3小时，并转化100μl感受态DH-5α，铺于加10μl IPTG和50μl X-gal的含氨苄青霉素的LB平板上，37℃下培养过夜。
h.转化产物的检测挑取白色单菌落(阳性克隆)接种于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡过夜；5000rpm 5分钟收集菌体，PCR方法检测确定阳性克隆opAFP-ly，测序(方法同2-d)。测序结果表明该质粒构建正确。
PCR检测引物A、B，A5’atctcaacagtctccacaggt；B5’tctgctgatgccagtcttact。
PCR反应参数为95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸60s；循环30次，72℃延伸10min。
牙鲆全鱼SEQUENCE LISTING<110>中国科学院海洋研究所<120>一种牙鲆″全鱼″溶茵酶基因重组质粒<130>
<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>3871<212>DNA<213>牙鲆鱼(Paralichthys olivaceus)<220>
<221>CDS<222>(2230)..(2655)<223>
<400>1ggatccccca gaatgagctg gaacatgttg cggggagagg gaagtctggg tcagcctgct 60tggcctgctg ccaccgtgac ccgacctcag ataagcggag gaaaatggat ggatggattg120aatcacagaa tgtttctgaa gacagatatc accttcgctt caaagaggtg cgcacctggg180caggcaccca cacagccaca caaatggcat atgaatcaac caagaagacg gttggaactg240gtcaaaacct tcactatacc atgtgtgaca gttgtttgtc acagtgtata aaagacaggg300acttagagac agagctctga gcagctatga gattgtagtt tggccaggat gcgcttaaga360cctttgtgat gaaaagttat caaattcgtg agttttcatg gaagaacctt gacgtggcgt420ggtggccatt ttgcgtcatt cggcatggaa aaggaagtcg ttataactcc caggtacatt480atcttatcta cacaaaatgt ctaatgcatg atactactta aagcctgagc atatttcaag540gccagcactt ttcaataact cataggccac ctgctggcaa aaggaaatgc cacattttat600acttttattt actcctagac agttgacctg atcagtctca aatttggtaa ggatagcctt660aagacaatga agatgcttca tcaggaatat tgtgagttgt cgttgaacgt tgttgccgtg720gcaacgcatc attcgccatg aaaaagaagc tgatggttca gtggcttggg atgctcaaaa780agtcatggaa ctttgtacat gtgtcataat tgatgggaag ttgtatgggt ttttggcttg840cttgttataa attgtctcca tagcgccccc tacaatattt caaaagagca gccccagtgc900tacgtacatg tatgaaactt agtagccaga tgtaccatat agagacttac aaaaaggtat960cttggccatg ctctcaaccg tactggaagt cggccatttt gatttttgca taatttttca 1020
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权利要求
1.一种牙鲆“全鱼”溶茵酶基因重组质粒，其特征在于具有序列表中SEQ ID NO.1碱基序列中的2195-2690碱基序列。
2.一种牙鲆“全鱼”溶茵酶基因重组质粒，其特征在于具有序列表中SEQ ID NO.1碱基序列。
3.一种权利要求1所述牙鲆“全鱼”溶茵酶基因的编码蛋白，其特征在于具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
全文摘要
本发明涉及海洋生物牙鲆“全鱼”溶茵酶基因，具体地说是牙鲆c型溶菌酶基因的克隆和表达质粒的构建，尤其是一种牙鲆“全鱼”溶茵酶基因重组质粒，具有序列表中SEQ ID NO.1碱基序列。该基因能够增强鱼类的免疫能力，将溶茵酶重组质粒质粒转入牙鲆鱼(转基因牙鲆)中也可以增强其免疫力，增强牙鲆鱼对病原的抵抗能力，从而提高产量。同时，从生物安全性角度考虑，本质粒完全克隆自鱼类自身的基因，有利于转基因鱼在水产养殖中得到应用。
文档编号C12N9/36GK1837368SQ200510046100
公开日2006年9月27日 申请日期2005年3月25日 优先权日2005年3月25日
发明者纪伟, 张培军, 刘庆华 申请人:中国科学院海洋研究所