专利名称：一种检测土壤亚硝酸还原酶活性的分析方法
技术领域：
本发明涉及土壤亚硝酸还原酶活性的检测，具体地说是一种检测土壤亚硝酸还原酶活性的分析方法。
背景技术：
土壤亚硝酸还原酶是土壤N素反硝化过程中的两种关键酶之一，其活性强弱影响着温室气体氮氧化物的排放，同时也受农田管理措施、自然或人为扰动、以及土壤条件如水分、温度、土壤质地的强烈影响。因此，对亚硝酸还原酶活性的检测意义重大。但到目前为止，有关亚硝酸还原酶活性的测定基本上都是参照[苏]Φ.X.哈兹耶夫著，郑洪元、周礼恺、张德生译的《土壤酶活性》一书中的方法，而该种方法操作步骤繁琐，需要专用的试剂瓶和抽滤装置进行抽真空培养，且试验结果随不同质地土壤在培养时间和称样量上应有的差异性以及嫌气培养程度的不确定性，使其难以适应土壤亚硝酸还原酶活性的定性比较和定量研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测土壤亚硝酸还原酶活性的分析方法；该分析方法是在前人测定方法的原理基础上，对亚硝酸还原酶活性的测定步骤进行了部分改进(对其通过在一定压力下抽真空而实现嫌气培养的过程进行了改进)，从而减少了嫌气培养程度的复杂性和不确定性，使分析结果更加稳定可靠，重现性好。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为一种土壤亚硝酸还原酶活性的分析方法，1)分别称取1g过筛的土壤风干样品3份于3只试管中，往其中2只试管中加入2-2.5ml 0.20％-0.25％的亚硝酸钠溶液，另1只试管中加入等量的蒸馏水作为样品对照，调PH为7-8.5；然后向3只试管中分别加入1-2ml0.5％-1.0％的葡萄糖溶液作为氢供体，再用蒸馏水补充到5-10ml，封口，摇匀，30℃恒温嫌气培养24小时；同时作试剂空白对照(不加土壤，其余同样品处理)；
2)培养结束后，用蒸馏水将试管内的土液混合物完全转移至三角瓶中，再加入1ml铝钾矾饱和溶液；将悬液仔细摇荡，并用致密滤纸过滤；3)取滤液1ml于50ml容量瓶中加显色剂，然后用水定容至刻度，在520nm下比色测定，测定吸光值A；4)在520nm下比色测定一系列已知浓度的NaNO2溶液的吸光值A1，以NaNO2溶液的浓度和测定的吸光值A′制备标准曲线，得到斜率b；5)根据吸光值A和斜率b，计算所测定液中NO2-N的含量S，S＝A*b；6)计算样品中NO2-N的含量；计算公式[S1-(S2-S3)*50*V1/1000*V2]/W＝mgNO2--N/g土·24h式中S1为试剂空白中的NO2-N的含量mg/L，S2为样品中的NO2-N的含量mg/L，S3为样品对照中的NO2-N的含量mg/L，50为定容的溶液体积ml，V1为浸提液总体积ml，V2为吸取滤液的体积(ml)，W为称土样重g，1000为单位转换系数。
对于酸性土壤，调PH为7-8.5时，采用加入CaCO3的方式。(对石灰性土壤而言，CaCO3无需加入，因为土壤本身的CaCO3量既可以满足微生物的最适pH)所述显色剂既可以采用对氨基苯磺酸和α-萘酚的等体积混合液(Γpиcc试剂)，也可以采用磺胺和N-(1-萘基)-乙二胺盐酸的混合液。
嫌气培养时用直径10-15mm，长150-180mm的普通玻璃试管；在土壤样品中加入5-10ml的液体，即保证土面以上5cm以上的液面高度；所用底物NaNO2溶液的浓度为0.20％-0.25％，其浓度及用量根据硝酸还原酶活性的不同适当调整；所述液体量为底物溶液、葡萄糖溶液和蒸馏水的加入量之和。
本发明方法改进依据为土壤亚硝酸还原酶与土壤硝酸还原酶一样，都是参与土壤反硝化过程中的还原酶。二者测定过程中均需要嫌气培养条件。硝酸还原酶活性的测定是以KNO3为底物，通过加入2，4-二硝基酚抑制亚硝酸还原酶的活性，来检测单位时间内NO2--N的生成量。而本方法中亚硝酸还原酶活性的测定则是以NaNO2为底物，经过24小时嫌气培养后，通过单位时间内NO2--N的减少量来表征。已有研究结果表明，1-5g土壤样品中加入5-10ml水(使土壤上层液面的高度保持5cm以上)培养形成的土水混合物中的溶解氧与充入N2三分钟形成的厌氧条件是相似的，淹水6-10个小时足可以使土水混合物中的O2含量降为0。
与过去的分析方法相比，本发明具有如下优点1.所需设备简单，成本低。将称量好的土壤样品置于10-15mm×100-150mm(直径×高度)的普通玻璃试管中即可，而不需用原来方法中提及的用来实现抽真空的带磨口塞的专用真空瓶。
2.无需专用的抽真空装置，通过使土层以上保持一定液面来实现测定过程中的嫌气培养条件。原来方法中抽真空时需要在一定压力(10-12毫米水银柱)下进行，亚硝酸还原酶活性随真空度的变化具有较大的差异性，因此操作过程中容易造成较大的系统误差。而本发明通过使土壤样品以上保持一定高度的液面来实现嫌气条件，克服了此方面明显的不足，既简化了操作步骤，同时又减小了系统误差。
3.操作简便。原有方法中需设置灭菌土壤作为对照(180℃，3小时)，而本方法只需用一个不加底物溶液，其余步骤同土壤样品一样的处理作为样品对照即可。
具体实施例方式
试剂配制1.0.20％-0.25％的NaNO2溶液称取0.20-0.25g NaNO2用蒸馏水定容至100ml。
2.0.5％-1.0％的葡萄糖溶液称取0.5g-1.0g葡萄糖，用蒸馏水定容至100ml。
3.CaCO3，分析纯试剂。
4.铝钾矾饱和溶液将硫酸铝钾溶于蒸馏水中，直至过饱和。
5.显色剂1(Γpиcc试剂)用比重为1.04的醋酸分别配制0.1％的α-萘胺溶液和0.5％的对氨基苯磺酸溶液(b)，用前将等体积a、b混合即成。
比重1.04的醋酸(相当于重量百分数35％的醋酸)配置取175ml100％的醋酸，定容至500ml，即为35％，比重1.04的醋酸。
称取0.2g α-萘胺用重量百分数35％，比重1.04的醋酸溶解并定容至200ml，此为(a)液。
称取1.0g对氨基苯磺酸用重量百分数35％，比重1.04的醋酸溶解并定容至200ml，此为(b)液。
显色剂2称取2g磺胺和0.1gN-(1-萘基)-乙二胺盐酸溶于150ml蒸馏水中，加入20ml浓磷酸，冷却至室温，用蒸馏水定容至200ml。此液应为无色溶液，并需当日配制。
6.标准贮备液(250mgNO2--N/L)溶解1.2314gNaNO2并用蒸馏水定容至1000ml，放于4℃冰箱中保存，保存时间不宜过久，以不超过数周为宜。
7.标准曲线的制备吸取上述标准贮备液1ml，定容至100ml，此为2.5mgNO2--N/L的溶液。再分别吸取该液0、1、2、3、4、5ml于50ml容量瓶中，加少量蒸馏水和4ml显色剂，并用蒸馏水定容。此标准系列含亚硝态氮的量分别为0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25mgNO2--N/L。在520nm下比色测定一系列已知浓度的NaNO2溶液的吸光值A1，以NaNO2溶液的浓度和测定的吸光值A′制备标准曲线，得到斜率b；操作步骤
1.称取1g过1mm筛的土壤风干样品3份于3只试管中，分别加入20mgCaCO3(对石灰性土壤而言，CaCO3无需加入，因为土壤本身的CaCO3量既可以满足微生物的最适pH)，仔细混合后往其中2只试管中加入2-2.5ml0.20％-0.25％的亚硝酸钠溶液，另1只试管中加入等量的蒸馏水作为样品对照。然后3只试管中分别加入1-2ml 0.5％-1.0％的葡萄糖溶液作为氢供体，再用蒸馏水补充到5-10ml，塞上不透气的橡胶塞，摇匀，置于30℃恒温箱中培养24小时。同时作试剂空白对照(不加土壤，其余同样品处理)。
2.培养结束后，用50ml蒸馏水将试管内的土液混合物完全转移至100ml三角瓶中，再加入1ml铝钾矾饱和溶液。将悬液仔细摇荡，并用致密滤纸过滤。
3.取滤液1ml于50ml容量瓶中，加少量蒸馏水和4ml显色剂，然后用水定容至刻度。15分钟后，在520nm下比色，测定吸光值A。
4.根据吸光值A和斜率b，计算所测定液中NO2-N的含量S，S＝A*b；5.计算样品中NO2-N的含量；计算公式[S1-(S2-S3)*50*V1/1000*V2]/W＝mgNO2--N/g土·24h式中S1为试剂空白中的NO2-N的含量(mg/L)S2为样品中的NO2-N的含量(mg/L)，S3为样品对照中的NO2-N的含量(mg/L)，50为定容的溶液体积(ml)，V1为浸提液总体积(ml)，V2为吸取滤液的体积(ml)，W为称土样重(g)，1000为单位转换系数；实施例1选用经过不同处理的四种土壤样品，其中1为对照，2、3、4号样品加入某种化合物的量依次加大，在温度25℃，土壤含水量保持20％(以烘干基计)的条件下培养1周后，检测该化合物的加入量对土壤亚硝酸还原酶活性的影响。具体分析步骤如下1.称取1g过1mm筛的土壤风干样品3份于3只试管中，分别加入20mgCaCO3，仔细混合后往其中2只试管中加入2ml 0.25％的亚硝酸钠溶液，另1只试管中加入等量的蒸馏水作为样品对照。然后3只试管中分别加入2ml 0.5％的葡萄糖溶液作为氢供体，再加入蒸馏水2ml，塞上不透气的橡胶塞，摇匀，置于30℃恒温箱中培养24小时。同时作试剂空白对照(不加土壤，其余同样品处理)2.培养结束后，用50ml蒸馏水将试管内的土液混合物完全转移至100ml三角瓶中，再加入1ml铝钾矾饱和溶液。将悬液仔细摇荡，并用致密滤纸过滤。
3.取滤液1ml于50ml容量瓶中，加少量蒸馏水和4ml显色剂1(Γpиcc试剂)，然后用水定容至刻度。15分钟后，在520nm下比色，测定吸光值A。
4.根据吸光值A和斜率b，计算所测定液中NO2-N的含量S，S＝A*b。
5.计算样品中NO2-N的含量。
试验结果如下
由表中数据可以看出，各处理之间结果差异显著，较低的标准差值表明该分析方法结果之间的偏差小，试验精密度高，重现性好。
实施例2对四种不同处理的土壤样品进行亚硝酸还原酶活性的测定，具体分析步骤如下底物NaNO2的浓度为0.20％，加入2ml；葡萄糖的浓度为1％加入1ml，然后加入5ml蒸馏水，显色时加入显色剂2，其余操作步骤同实施例1。试验结果如下
表中数据同样显示了分析结果的稳定性，且各处理之间的差异达极显著水平。
权利要求
1.一种土壤亚硝酸还原酶活性的分析方法，其特征在于1)分别称取1g过筛的土壤风干样品3份于3只试管中，往其中2只试管中加入2-2.5ml 0.20％-0.25％的亚硝酸钠溶液，另1只试管中加入等量的蒸馏水作为样品对照，调PH为7-8.5；然后向3只试管中分别加入1-2ml0.5％-1.0％的葡萄糖溶液作为氢供体，再用蒸馏水补充到5-10ml，封口，摇匀，30℃恒温嫌气培养24小时；同时作试剂空白对照；2) 培养结束后，用蒸馏水将试管内的土液混合物完全转移至三角瓶中，再加入1ml铝钾矾饱和溶液；摇荡，过滤；3)取滤液1ml于50ml容量瓶中加显色剂，然后用水定容至刻度，在520nm下比色测定，测定吸光值A；4)在520nm下比色测定一系列已知浓度的NaNO2溶液的吸光值A1，以NaNO2溶液的浓度和测定的吸光值A′制备标准曲线，得到斜率b；5)根据吸光值A和斜率b，计算所测定液中NO2-N的含量S，S＝A*b；6)计算样品中NO2-N的含量；计算公式[S1-(S2-S3)*50*V1/1000*V2]/W＝mgNO2--N/g土·24h式中S1为试剂空白中的NO2-N的含量mg/L，S2为样品中的NO2-N的含量mg/L，S3为样品对照中的NO2-N的含量mg/L，50为定容的溶液体积ml，V1为浸提液总体积ml，V2为吸取滤液的体积(ml)，W为称土样重g，1000为单位转换系数。
2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于对于酸性土壤，调PH为7-8.5时，采用加入CaCO3的方式。
3.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于所述显色剂既可以采用对氨基苯磺酸和α-萘酚的等体积混合液，也可以采用磺胺和N-(1-萘基)-乙二胺盐酸的混合液。
4.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于嫌气培养时用直径10-15mm，长150-180mm的普通玻璃试管；在土壤样品中加入5-10ml的液体，即保证土面以上5cm以上的液面高度。
全文摘要
本发明涉及一种检测土壤亚硝酸还原酶活性的分析方法，1)称取土壤风干样品3份于3只试管中，其中2只试管中加入2－2.5ml 0.20％－0.25％的亚硝酸钠溶液，另1只试管中加入等量的蒸馏水，调pH为7－8.5；然后向3只试管中分别加入1－2ml 0.5％－1.0％的葡萄糖溶液，再用蒸馏水补充到5－10ml，封口，摇匀，30℃恒温嫌气培养24小时；2)加入铝钾矾饱和溶液；摇荡，过滤；3)取滤液加显色剂，在520nm下比色测定，测定吸光值A；4)计算样品中NO
文档编号C12Q1/00GK1979134SQ200510047888
公开日2007年6月13日 申请日期2005年11月30日 优先权日2005年11月30日
发明者武志杰, 孙志梅, 张丽莉 申请人:中国科学院沈阳应用生态研究所