生物质连续发酵产氢串并联多级复合装置及方法

专利名称：生物质连续发酵产氢串并联多级复合装置及方法
技术领域：
本发明属于以固定化微生物对生物质发酵产氢的方法及装置。
背景技术：
生物质制氢原料来源广泛，在获得氢能的同时，能够处理有机污染物，是现代生物化学研究的热点领域。
近年来，针对生物质发酵产氢技术，国内外对发酵产氢的相关生物反应器、工艺流程以及固定化微生物对生物质发酵产氢的厌氧消化技术方法的研究较多，也有较大的进展。2001年Narendra Kumar，Debabrata Das等人利用填充床生物反应器，以椰子壳为材料固定菌种Enterobacter cloacae IIT-BT08发酵葡萄糖产氢，得到的最大氢产量是同等条件下批量发酵的2.1倍。2005年G.Chittibabu，Kaushik Nath，Debabrata Das等人利用厌氧附着膜膨胀床(AAFEB)，以重组后的菌株Escherichia coli BL21为接种物进行发酵葡萄糖产氢，通过计算得到气体的能源转化率(其中葡萄糖按蔗糖计算)为26.68％，氢气的产率为3.12mol H2/(molglucose)。2003年，Feng-Yung Chang，Chiu-Yue Lin等证实了上流式厌氧污泥床可以用作生物质发酵产氢的生物反应器，并且当反应器工作容积为3L时，每天可产生53.3mmol的氢气，氢气平均含量达到42.4％。2002年Jo-Sbu Changa，Kuo-Shing Leeb，Pin-Jei Linb等利用固定床生物反应器进行生物质发酵产氢试验，分别以丝瓜瓤，膨胀粘土和活性炭为载体通过吸附驯化后的活性污泥对菌种进行固定，以蔗糖为原料进行连续产氢，其中以活性炭为吸附剂效果最好，最大产氢速率可以达到1.21L/L.d，氢气含量25％-35％。Sun-Kee Han，Hang-Sik Shin等利用滤床反应器对食品废水进行发酵产氢，去除的COD最大氢气的转化率为19.3％。KrishnanVijayaraghavan等利用接触滤池对木菠萝水果加工厂废弃物进行厌氧消化产氢，氢气产率为0.72L/gVS木菠萝，最大氢气含量为55％左右。Krishnan Vijayaraghavan等利用普通的厌氧生物反应器，通过对牛粪为主的厌氧菌群进行分离和驯化，得到最大氢气含量为62％，平均氢气含量达45.9％。此外，国内对于生物发酵产氢反应器也有大量的研究。清华大学的左宜，左剑恶等人利用自行改装的升流式污泥床以河底污泥为菌种进行连续厌氧生物产氢的试验研究，反应器体积为2.6L，H2含量约为52.3％，反应器的容积产氢率最高达6.7L/L.d，基质产率为1.3～1.4mol/mol葡萄糖。任南琪等人研制的生物反应器最大产氢速率为10.4m3/m3.d即416mL/L.h。以上技术，对于生物质发酵产氢，生物反应器的研究很多。但大都集中在作为培养菌种和主发酵的生物反应器——单级的生物反应器来进行发酵产氢，通过定时或连续流进出料达到连续产氢的目的。由于对脱氢酶与产氢之间关系未进一步研究，原料的产氢利用率，产氢的高效性和稳定性不能很好地实现。
固定化产氢细胞与非固定化产氢细胞相比，有耐低pH值，持续产氢时间长，抑制氧气扩散速率，防止产氢细胞流失等特点。此前，本发明申请人提出“一种用于生物质发酵产氢的固定化微生物及制备方法”，申请号200510011085.4，利用驯化的混和菌种与载体结合，固定产氢细菌细胞，使反应系统内的细胞持有量及微生物细胞内氢化酶的稳定性和产氢速率大幅增加，为持续、稳定的生物质氢技术提供了工业化条件。
厌氧生物处理是利用厌氧微生物的代谢过程，在不需要提供氧气的情况下把有机物转化为无机物和少量细胞物质，这些无机物主要是包括大量沼气(称生物气Biogas)和水。因此，厌氧技术既有效、又简单，且费用低廉。
本发明发酵罐是指以上、下为圆锥形，中部罐体为圆柱形的通用生物反应器。

发明内容
本发明的目的是在脱氢酶与产氢之间关系研究基础上，提出以混合菌种固定化微生物为种源的生物质发酵产氢的方法，并设计发酵产氢生物反应装置，提高连续和批量发酵的不同生物质原料产氢利用率、高效性和稳定性。
本发明生物质发酵产氢的串并联多级复合装置，具有(1)发酵液流通管18依次串联的二级以上的发酵罐罐列，(2)发酵罐的集气管19并联并收集氢气。
本发明在在第1级发酵罐11和第3级发酵罐13之间以设置阀门的管道相联，且第1级发酵罐11和第2级副发酵罐12也同样以设置阀门的管道相联，形成串并联组合。
所述的发酵罐中设置2～4组螺旋盘管或蛇形管5。
在第1～5级发酵罐中设置2～4组螺旋盘管或蛇形管，或通入冷却水，对发酵中温度过高时控制；或通入蒸汽或热水用于起动或低温季节保温。其它各级根据设计的规模和原料负荷来设置或间隔设置。
所述的在第1级发酵罐11和第2级副发酵罐12罐体高度的上、下1/3处固定有承放混合菌种固定化微生物块的网隔4。
生物质发酵产氢的串并联多级复合装置的发酵产氢方法，包括用于生物质发酵产氢的固定化微生物，其特征在于(1)第1级发酵罐放入经驯化后脱氢酶酶活力≥50U/mL的混合菌种固定化微生物，其重量W(ton)与罐容积V(m3)之比为1％～10％，作为种源培养兼发酵生物反应器，(3)生物质原料通过发酵液管(18)从上一级发酵罐流向下一级发酵罐为无动力供给的自然行进。
所述的副发酵罐12放入经驯化后脱氢酶酶活力≥50U/mL的混合菌种固定化微生物，其重量W与罐容积V之比为1％～10％，作为辅助种源培养兼发酵生物反应器。而且，第1级发酵罐11和第3级发酵罐13之间的管道阀一般是关闭的，其它一般都是开通的。
所述的第1级发酵罐11和第2级副发酵罐12添加以下盐离子之一或其组合为培养基原料(1)硫酸盐阳离子M(M＝20mg/L Fe2+、1mg/L Ni2+、100mg/L Fe3+、10mg/L Mg2+、100mg/L K+、1mg/L Mn2+)，(2)铵盐阴离子N(N＝0.1g/L钼酸根[Mo7O24]6-、1g/L草酸根[C2O4]2-、5g/L柠檬酸根[C6H5O7]3-、1.5g/L SO42-)。
提出本发明前申请人进行了以下基础性研究1、以厌氧活性污泥为接种物，进行了柠檬酸、苹果酸、乳酸、丙酮酸、甲酸、草酸、琥珀酸、富马酸、丁酸、丙酸和乙酸11种有机酸的发酵产氢，以及以乳酸调节厌氧活性污泥pH值后为接种物，进行了稻草、玉米秆、小麦秆、大麦秆、蚕豆秆、黄豆秆等秸秆以及猪粪、牛粪、鸡粪、马粪等为原料的批量发酵产氢的研究。
2、研究了发酵产氢的影响因素，找出了不同硫酸盐阳离子M(M＝20mg/L Fe2+、1mg/L Ni2+、100mg/L Fe3+、10mg/L Mg2+、100mg/L K+、1mg/L Mn2+)和不同铵盐阴离子N(N＝0.1g/L钼酸根[Mo7O24]6-、1g/L草酸根[C2O4]2-、5g/L柠檬酸根[C6H5O7]3-、1.5g/L SO42-)的作用及其组合。研究证实了Ni2+-Fe3+具有形成有利于发酵产氢过程放氢的条件，使氢酶向着发生放氢反应的方向进行，从而提高了混合菌群发酵产氢的能力，也促进了微生物的代谢，增加了CO2的产生。也进一步证实了钼酸根[Mo7O24]6-柠檬酸根[C6H5O7]3-组合的阴离子交互作用对生物发酵产氢的代谢有良好的促进作用，以促进混合菌种之间的协同作用，提高氢气产量和原料的利用与转化率。
3、申请了“一种用于生物质发酵产氢的固定化微生物及制备方法”的发明专利，申请号200510011085.4。其以微生物混合菌种制作发酵产氢固定化微生物，广泛适用于不同生物质原料发酵产氢；可以实现在不同糖S(S＝木糖、乳糖、葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、马铃薯)为原料下，以及将六碳糖(单糖葡萄糖)、五碳糖(单糖木糖)、双糖的蔗糖和乳糖和多糖淀粉的混合原料的批量固定化微生物发酵产氢。
3、建立了以脱氢酶选育产氢微生物的方法，先后分析检测了亚麻废水、沼气发酵活性污泥、城市废水处理、垃圾渗滤液等的脱氢酶酶活，并进行了发酵产氢的研究，脱氢酶酶活与产氢成正相关；同时以脱氢酶为指标进行了产氢微生物的分离和筛选，进一步的产氢实验表明，脱氢酶酶活较高的产氢微生物具有产气量多、气体中氢气含量高、稳定且持续性好。
4、研究了马铃薯水解液为原料的混合菌种固定化微生物连续发酵产氢，马铃薯水解工艺中，马铃薯不作任何处理(不洗，也不去皮直接用)，加水打浆后，进行酶水解，投入7级连续产氢发酵反应器中，即，鲜马铃薯→打浆→酶水解→多级发酵产氢体系→产氢。证实了混合菌种固定化微生物用于马铃薯水解液连续发酵产氢具有高效、持续稳定的效能。
5、改进了TTC-脱氢酶活性测定方法，建立了脱氢酶在发酵产氢方面的应用，建立了以脱氢酶酶活力选育产氢微生物的方法，此方法具有创造性地引入用于检测所用菌种的产氢潜力品质和监测发酵过程的状态变化参数情况。先后分析检测了亚麻废水、沼气发酵活性污泥、城市废水处理、垃圾渗滤液等的脱氢酶酶活。研究了解了用于固定化的混合菌种的最低脱氢酶活力水平，进一步的产氢实验表明，脱氢酶酶活较高的产氢微生物具有产气量多、气体中氢气含量高、稳定且持续性好。
脱氢酶酶活力单位(U)定义以红四氮唑TTC(2，3，5-triphenyltetrazolium)为底物，样品与底物在40℃下恒温反应2h，以1mL或1g样品在1h内生成的1μg甲簪TPF(triphenylformazan)的量(μg TPF/mL h)定义为一个酶活力单位U。
脱氢酶活性的测定方法过程取2mL样液悬浮液，加入1mL 0.5％TTC溶液(其中空白用1mL蒸馏水代替TTC溶液)振荡摇匀，40℃水浴2h后煮沸10min，加入1mL饱和NaCl溶液混合均匀，冷却再加萃取剂丙酮3mL混合均匀，静置5min，加入5mL甲苯萃取。将萃取上清液移入1cm比色皿中，在721分光光度计上测定OD490nm值。以测定OD490nm值，查标准曲线找出对应的TPF的量，通过下式计算所测样品的脱氢酶活性(酶活力单位)DHA(U)＝(m·B)/(A·C)B-实测OD490nm值从标准曲线查出的TPF值，μg。
A-样品的反应体积，mL。
m-样品稀释倍数，C-保温反应时间，2hDHA-脱氢酶活性，单位U＝μg TPE/h·mL6、为全面考察和分析了解氢气净产量和脱氢酶酶活关系，将81个氢气的产量指标以从小到大的顺序排列后分成三组，将每组中的氢气产量相对应实验号的脱氢酶酶活的结果数值也分别归入不同组，采用单因子统计分析方法，对脱氢酶与产氢量组间的方差统计分析表明FA为3.18，大于F0.05(2，78)＝3.113，小于F0.01(2，78)＝4.888，证明氢气的净产量和脱氢酶酶活存在显著的正相关关系，即脱氢酶酶活高低直接反映出氢气产量的高低。
7、研究了脱氢酶酶活在固定化批量发酵产氢过程中的动态变化，以发酵产氢直接相关的指标，氢气产量、产氢速率、残糖含量，分析了与脱氢酶酶活在混合菌种固定化微生物发酵产氢过程中的动态变化规律，得出(1)、经驯化后脱氢酶酶活力≥50U/mL的微生物制作的混合菌种固定化微生物，以马铃薯水解液为原料进行的批量发酵产氢，启动时间为12h，总产氢量达到7.14L，从启动到产氢结束(以在发酵罐内检测不到氢气为准)共进行了74小时，氢气产率高达2.60mol/moL葡萄糖。
(2)、整个产氢过程来看体系内脱氢酶酶活和氢气的产量随时间的变化表征出相反的变化趋势，也就是说在氢气产量为零或较低时，混合微生物对原料或中间代谢物进行大量的脱氢反应，从而向铁氧还原蛋白(ferredoxin)提供更多的电子，以便通过氢化酶的重氧化而释放出氢气。更进一步说明脱氢酶的脱氢反应是生物质发酵产氢的第一步也是重要的一步。
(3)本研究通过对整个生物质发酵产氢的动态变化过程对脱氢酶酶活进行跟踪检测，初步研究了脱氢酶与氢气产生的变化关系。证实了脱氢酶与产氢的消长呈现交替规律。据此，若采用多级连续发酵，以适应脱氢酶与产氢的交替规律，就可能弥补批量发酵的后继乏力缺陷。
本发明利用通常的发酵罐串并联构成发酵产氢装置，可利用原有设备，成本低，容易实施。
本发明在探索影响菌种和菌群的产氢适宜条件、研究从处理有机废物到直接利用天然淀粉、纤维素大规模产氢的发展重点生物质发酵产氢基础上，用多级连续发酵产氢装置适应了脱氢酶与产氢交替出现的规律，解决了单级生物反应器产氢挂一漏万后继乏力的缺陷，充分提高了原料的产氢利用率，实现产氢的高效性、持续稳定性。


图1、设计的工业规模的发酵产氢多级发酵罐装置及联接工艺简略图。图中标号为1、固定化微生物进出口；2、人孔；3、混合菌种固定化微生物；4、筛网板；5、螺旋或蛇形盘管；6、排污口；7、膨大球体；8、检修口；9、取样口；10、直接进料口；11、第1级发酵罐；12、第2级发酵罐；13、第3级发酵罐；14、第4～n级发酵罐；15、CO2去除装置；16、O2去除装置；17、H2贮气装置。18、发酵液流通管和通道阀门；19、集气管图2、1L的实验型发酵产氢发酵罐装置。
图3、以马铃薯水解液为原料的7级连续发酵工艺流程图。
具体实施例方式
实施例1图1、2中，用1L的实验型发酵产氢发酵罐装置，将发酵罐7级串联，只第1级投入混合菌种固定化微生物块50～100g。串联的其它各级发酵产氢发酵罐中都不投入固定化微生物块。从第1级进料口定时、定量加入马铃薯水解液，从出料口吸出同样体积量从第2级进料口进入，如此依序操作至最后一级来进行发酵产氢。各级分别测定气体体积，氢气含量，以及取样分析有关指标和脱氢酶酶活力。
第1级，混合菌种固定化微生物种源的能力考察从启动开始的前14h，脱氢酶活处于一个相对较高的水平，而此时氢气几乎没有产生；14h后随着氢气的产生，脱氢酶活出于一个相对较低的水平，直到40h后才又出现一个小峰而此时氢气的产量却由最大产量1068mL降到141mL。在整个动态过程中氢气的净产量总是与脱氢酶活的变化呈交替的规律变化，当脱氢酶活处在波峰时，氢气的净产量总是处在波谷；而当脱氢酶活处在波谷时，氢气的净产量则通常都是处于波峰。而整个发酵产氢的动态变化过程中总是当脱氢酶活处于较高水平时，其相应随后的下一时期氢气产量也较高。证明由脱氢酶主导的脱氢反应是生物质发酵产氢的第一步也是最重要的一步，其与氢气的产生有着密切的联系；发酵产氢过程脱氢酶活的高低是一个重要的指标，它直接影响了后续氢气的产量。
单批产氢潜力118.1mL/g马铃薯干重，相当于1.07moL/moL葡萄糖。
实施例2经单批考察第1级种源的1个发酵周期符合预期的要求后，正式起动多级发酵罐串联的以马铃薯水解液为原料的连续发酵产氢。
图1、3中，第1级(11)为种源培养兼发酵的发酵罐，第2级(12)为辅助种源培养兼发酵的副发酵罐。这两级发酵罐用直径≥1.5cm的钢筋，纵横交错间距10cm左右焊制上、下2块筛网板，板分别设在罐体高度的上、下约1/3处。两板之间为网住混合菌种固定化微生物菌种块空间。上板留有用于放入、取出固定化块的90cm方孔。
两两发酵罐之间管道上设有阀门。各级发酵罐的顶部为气体出口，气体经过一管径为正常管径3倍的膨大球状体7，将发酵液及所带出的泡沫回落入反应器中。气体可由三通阀控制进入CO2去除装置(15)，再进入O2去除装置(16)处理，最后的纯净H2进入贮气装置(17)；也能分别处理。各反应器底部为由阀门控制的发酵沉淀等污物排放出口，含水量高的可进入沼气发酵、含水量低的可制肥料。
在第1级发酵罐和第2级副发酵罐中分别放入6％(重量W/罐容积V)的混合菌种固定化微生物菌种，该菌种采用“一种用于生物质发酵产氢的固定化微生物及制备方法”专利申请(申请号200510011085.4)方法制备，固定化微生物菌种的种量以重量t计，发酵罐容积以m3计。在混合菌种固定化微生物的培养基中添加硫酸盐阳离子M(M＝20mg/L Fe2+、1mg/L Ni2+、100mg/LFe3+、10mg/L Mg2+、100mg/L K+、1mg/L Mn2+)和铵盐阴离子N(N＝0.1g/L钼酸根[Mo7O24]6-、1g/L草酸根[C2O4]2-、5g/L柠檬酸根[C6H5O7]3-、1.5g/L SO42-)。调配好的原料可从1、2级进料口由上部流加进入，正常情况下只从第1级进料口流加进入。在起动、检修和更换菌种等特殊情况时，分别由第1、2同时或单独进入。更换第1级菌种或检修时，关闭1、2和1、3之间的管道联接阀门，由2、3管道正常输送提供种源；更换或检修第2级时，开通1、3并联管输送提供种源。1、3并联管正常情况下一般是关闭的。
第3级(13)以后各级不放入固定化微生物种源块，进入原料为不加无机盐M、N的粗制原料，只控制糖浓度或COD等负荷。发酵液的液流顺次向下一级自然流入为无动力流动。
第1级，脱氢酶总是保持较高的酶活力163.01U，H2含量较低35～40％，CO2含量较高；第2级，脱氢酶酶活力66.49U较第1级下降，H2含量较第1级高，CO2含量较第1级低5％左右；第3级，在7级串联体系中，脱氢酶最高水平酶活力1427.27U出现在该级中，该级脱氢酶酶活力、H2含量、CO2含量是变化和波动最大的；第4级，该级各指标变化较平稳，脱氢酶酶活力69.98U，H2含量和CO2含量各为一半；第5级，在7级串联体系中，除第7级外，该级的脱氢酶酶活力19.43U是体系中最低的，H2含量最高可达85％以上，CO2含量最低；第6级，脱氢酶与第5级比较，经常出现不平稳酶活力上升现象，H2含量下降到65％左右，CO2含量也升高；第7级，到第6级原料几乎耗完，在该第7级中只有较少的气体产生，脱氢酶酶活力一般为3.28U，H2含量16.28％，CO2含量较高82.14％。
以上7级发酵中，分别在各级中的H2含量，H2产生量，以及脱氢酶活性变化较大，但就整个体系而言，每天的总产气量和总的氢气产生量在量上无显著差别。以固定时刻实测考察脱氢酶酶活力、H2含量在各级中差别很大，但不同时刻的平均值之间却无显著差别。以此多级装置的连续发酵产氢，弥补了单级装置连续流进料或批量发酵的缺陷，同时又容纳了两者的优点。
该7级装置的连续发酵体系，共发酵80d，共用新鲜马铃薯14400g，以TS折合干重3577.2g，干重马铃薯淀粉含量为89％，以1g淀粉的量相当于1g葡萄糖计，总产H2潜力为303.89mL/g葡萄糖，相当于2.286moLH2/moL葡萄糖，最大产氢速率为450mL/L.h，即10.8L/L.d；起动期以第7级流满发酵液为限，之后为正常发酵平稳期共75d，平稳期总产H2潜力386.0mL/g马铃薯的葡萄糖，相当于3.10moLH2/moL葡萄糖，停止进入原料收集余气的结束结果不计入此期间。
体系运行80d的产氢量比第1级单一反应器批量考察值提高了70％；就以平稳期而论比第1级单一反应器批量考察产氢量值提高了91.0％。结果说明本发明的装置多级连续及多种技术工艺复合设计合理，能够高效、持续、稳定地发酵产氢，明显提高了原料的产氢利用率。
本发明同国内清华大学左宜，左剑恶等人以河底污泥为菌种，利用改装的升流式污泥床单一反应器，连续流进出葡萄糖料液进行的较长时间连续产氢相比。本发明80d的平均产氢为2.286moLH2/moL葡萄糖，与左宜，左剑恶等的最高产氢1.4mol/mol葡萄糖相比提高了63.3％。
权利要求
1.生物质发酵产氢的串并联多级复合装置，其特征在于该装置具有(1)发酵液流通管(18)依次串联的二级以上的发酵罐罐列，(2)发酵罐的集气管(19)并联并收集氢气。
2.根据权利要求1所述的生物质发酵产氢的串并联多级复合装置，其特征在于在第1级发酵罐(11)和第3级发酵罐(13)之间以设置阀门的管道相联，且第1级发酵罐(11)和第2级副发酵罐(12)也同样以设置阀门的管道相联，形成串并联组合。
3.根据权利要求1所述的生物质发酵产氢的串并联多级复合装置，其特征在于在发酵罐中设置2～4组螺旋盘管或蛇形管(5)。
4.根据权利要求1所述的生物质发酵产氢的串并联多级复合装置，其特征在于在第1级发酵罐(11)和第2级副发酵罐(12)罐体高度的上、下1/3处固定有承放混合菌种固定化微生物块的网隔(4)。
5.生物质发酵产氢的串并联多级复合装置的发酵产氢方法，包括用于生物质发酵产氢的固定化微生物，其特征在于(1)第1级发酵罐放入经驯化后脱氢酶酶活力≥50U/mL的混合菌种固定化微生物，其重量W(ton)与罐容积V(m3)之比为1％～10％，作为种源培养兼发酵生物反应器，(2)生物质原料通过发酵液管(18)从上一级发酵罐流向下一级发酵罐为无动力供给的自然行进。
6.根据权利要求5所述的发酵产氢方法，其特征在于第2级副发酵罐(12)放入经驯化后脱氢酶酶活力≥50U/mL的混合菌种固定化微生物，其重量W与罐容积V之比为1％～10％，作为辅助种源培养兼发酵生物反应器。
7.根据权利要求5所述的发酵产氢方法，其特征在于第1级发酵罐(11)和第3级发酵罐(13)之间的管道阀是关闭的。
8.根据权利要求5所述的发酵产氢方法，其特征在于第1级发酵罐(11)和第2级副发酵罐(12)添加以下盐离子之一或其组合为培养基原料(1)硫酸盐阳离子M(M＝20mg/L Fe2+、1mg/L Ni2+、100mg/L Fe3+、10mg/L Mg2+、100mg/L K+、1mg/L Mn2+)，(2)铵盐阴离子N(N＝0.1g/L钼酸根[Mo7O24]5-、1g/L草酸根[C2O4]2-、5g/L柠檬酸根[C6H5O7]3-、1.5g/L SO42-)。
全文摘要
生物质连续发酵产氢串并联多级复合装置及方法，涉及以固定化微生物对生物质发酵产氢的方法及装置。第1级为种源培养兼发酵的发酵罐，第2级为辅助种源培养兼发酵的副发酵罐，第3级为主发酵发酵罐，后为串联的n(n＞3)级发酵罐。在第1、2级中分别放入1％～10％(重量W/罐容积V)的混合菌种固定化微生物菌种。其它各级无固定化块。工艺过程主进料在1、3两级，1级为配制原料，3级为粗制原料。各级液流向下一级为无动力供给的自然行进。各级气体以三通实现分别收集处理或集中处理。该发酵产氢装置及复合技术的多级连续能够弥补、平衡单一发酵罐中存在的脱氢酶与产氢呈交替出现的规律，解决了不一致性问题，充分提高了原料的产氢利用率，实现产氢的高效性、持续稳定性。
文档编号C12P3/00GK1814742SQ20051004865
公开日2006年8月9日 申请日期2005年11月28日 优先权日2005年11月28日
发明者刘士清, 张无敌, 马欢 申请人:云南师范大学