专利名称：一种液体深层发酵生产大团囊虫草菌体的方法
技术领域：
本发明涉及微生物工程技术领域，特别涉及一种大团囊虫草菌(Cordyceps ophioglossoides)的液体深层发酵培养工艺。
背景技术：
大团囊虫草是一种名贵中草药，我国南方地区民间使用较为普遍，具有悠久的历史。该虫草子实体在治疗妇科疾病方面药用价值极高，主要用于治疗月经不调、痛经、闭经等病，对产后出血、促进产后子宫复原也具有显著效果。由于野生资源的匮乏和生长环境的恶化，现有该真菌的天然资源已不能满足人们的需求，利用现代的生物技术来挽救这种名贵的中药十分必要。
上个世纪中后期发展起来的现代发酵技术已成功应用于多种药用真菌的大规模生产，其中以液体发酵技术最为成熟。本次将液体发酵技术应用到大团囊虫草菌体的生产在国内尚属首例，研究结果表明该方案是可行的。
发明内容
本发明的目的在于针对液体发酵过程中的营养需求与菌体生长的关系，提供了一种液体深层发酵生产大团囊虫草菌体的方法，菌种是本实验室分离得到的大团囊虫草菌的纯菌株(拉丁文学名为Cordycepsophioglossoides)，现保存于中国专利局指定的保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保存编号为CGMCC No.1146。
本发明提供的一种液体深层发酵生产大团囊虫草菌体的方法的实施方案为以人工分离培养到的大团囊虫草纯菌株为出发菌种，依次经固体斜面培养，摇床种子培养和发酵培养完成。
固体斜面培养的条件为，从保藏菌种接种到配制的斜面培养基上，温度20～30℃，培养200～240小时。
每1000毫升斜面培养基的主要成份为马铃薯100～300克、蔗糖或葡萄糖10～30克、琼脂15～25克，加水定容至1升，调pH值为4.8～6.5。
摇床种子培养的条件为，菌种固体斜面培养200～240小时后，挑取菌丝体接种于装有液体种子培养基的摇瓶中，在20～30℃培养，转速150～200rpm，培养60～72小时。
种子培养基与摇瓶的容积比为1∶3～1∶5。
每1000毫升种子培养基的主要成份为蔗糖20～60克、酵母粉或酵母膏10～50克、蛋白胨10～50克、MgSO4·7H2O 0.1～0.5克、KH2PO40.1～0.5克，pH自然。
发酵培养的方法是，液体种子摇床培养60～72小时后接种至装有发酵培养基的发酵罐中，接种量5～15％(V/V)、保持罐温20～30℃、罐压0.4～0.8kg/cm，搅拌速率100～250rpm，通气量1∶0.3～1∶1.2，发酵时间85～110小时。
每1000毫升发酵培养基的主要成份为蔗糖50～100克、酵母粉或酵母膏10～60克，蛋白水解液20～100毫升(V/V)、MgSO4·7H2O 0.2～1克、KH2PO40.2～1克，培养基的pH值调为4.8～6.5。
发酵培养采用液体深层通气发酵培养。
本发明的放罐标准是发酵液变得粘稠，镜检发现菌丝体开始衰老。
经与其他培养工艺进行比较、反复试验验证，本发明效果显著(1)本发明中种子培养基提供了菌体短期内快速生长所需的营养物质，培养60小时左右即可进行深层发酵。
(2)本发明中液体深层通气发酵培养基，营养成分配比合理，能够保证大团囊虫草菌的生长需要，培养基材料丰富，整个分批发酵过程中只需一次配料、一次灭菌即可，具有省时、省工，又减少了由于中途加料造成污染杂菌的机会。
(3)采用本发明中的液体深层通气发酵工艺进行分批发酵，每升发酵液可得到20～30克的干菌体。
(4)本发明是国内首次对大团囊虫草菌的发酵工艺进行研究，对于该菌以后的实验研究和工业化生产均有很大的指导意义。
具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步详细描述本发明。
实施例1种子培养基的制备称取蔗糖40克、酵母粉(膏)20克、蛋白胨30克、MgSO4·7H2O 0.2克、KH2PO40.2克，将各组分混合溶解，加水定容至1000毫升，灭菌后即得。
实施例2蛋白水解液的制备方法一取新鲜原料黄豆粉、虾粉、蚕蛹粉等，于60℃烘箱中干燥6个小时，然后放于80℃烘箱中干燥17个小时，称取干粉100克，加入生石灰6克，水640毫升，在0.15Mpa下加压水解2个小时，过滤，取滤液即得。
方法二取新鲜原料黄豆粉、虾粉、蚕蛹粉等，于60℃烘箱中干燥6个小时，然后放于80℃烘箱中干燥17个小时，称取干粉100克，加入6mol/l的盐酸600毫升，在沸水浴中水解30分钟，过滤后收集滤液。
实施例3液体深层通气发酵培养基的制备称取蔗糖50克、酵母粉(膏)20克、按实施例2制备的蛋白水解液40毫升、MgSO4·7H2O 0.5克、KH2PO40.5克。将上述成分混合加水至1000毫升，另外加0.6毫升泡敌作消泡剂，用盐酸调pH到5.6，灭菌后即为发酵培养基。
实施例4斜面培养基的制备称取马铃薯200克、蔗糖或葡萄糖20克、琼脂20克，将各组分混合溶解，加水定容至1000毫升，用盐酸调pH到5.6，灭菌后即为斜面培养基。实施例5液体深层培养方法一(1)取适量按实施例4配制的新鲜斜面培养基，挑取保藏菌种的菌丝体采用涂布或划线的方法接种到斜面培养基上，于25℃培养200小时。
(2)选菌体繁茂的斜面培养菌种，从上挑取1立方厘米菌丝体或挖取1立方厘米菌苔接种于装有按实施例1制备的液体种子培养基的摇瓶中，在温度25℃，转速200rpm条件下培养70小时。
(3)取处于对数生长中后期的种子培养物，以8％(V/V)的接种量转接入装有按实施例3制备的发酵培养基的发酵罐中，保持罐温25℃、罐压0.5kg/cm，搅拌速率150rpm，通气量1∶0.6，发酵培养时间100小时。待发酵液变的粘稠，镜检观察菌丝体开始衰老时，停止发酵、放罐，分别收集菌丝体和发酵液，每升发酵液可获得20g以上的干燥菌丝体。
实施例6液体深层培养方法二(1)取适量按实施例4配制的新鲜斜面培养基，挑取保藏菌种的菌丝体采用涂布或划线的方法接种到斜面培养基上，于20℃培养240小时。
(2)选菌体繁茂的斜面培养菌种，从上挑取1立方厘米菌丝体或挖取1立方厘米菌苔接种于装有按实施例1制备的液体种子培养基的摇瓶中，在温度30℃，转速150rpm条件下培养60小时。
(3)取处于对数生长中后期的种子培养物，以5％(V/V)的接种量转接入装有按实施例3制备的发酵培养基的发酵罐中，保持罐温30℃、罐压0.4kg/cm，搅拌速率250rpm，通气量1∶0.3，发酵培养时间110小时。待发酵液变的粘稠，镜检观察菌丝体开始衰老时，停止发酵、放罐，分别收集菌丝体和发酵液，每升发酵液可获得20g以上的干燥菌丝体。
实施例7液体深层培养方法三(1)取适量按实施例4配制的新鲜斜面培养基，挑取保藏菌种的菌丝体采用涂布或划线的方法接种到斜面培养基上，于30℃培养220小时。
(2)选菌体繁茂的斜面培养菌种，从上挑取1立方厘米菌丝体或挖取1立方厘米菌苔接种于装有按实施例1制备的液体种子培养基的摇瓶中，在温度20℃，转速180rpm条件下培养72小时。
(3)取处于对数生长中后期的种子培养物，以15％(V/V)的接种量转接入装有按实施例3制备的发酵培养基的发酵罐中，保持罐温20℃、罐压0.8kg/cm，搅拌速率100rpm，通气量1∶1.2，发酵培养85小时左右。待发酵液变的粘稠，镜检观察菌丝体开始衰老时，停止发酵、放罐，分别收集菌丝体和发酵液，每升发酵液可获得20g以上的干燥菌丝体。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。
本发明可用其他的不违背本发明的精神和主要特征的具体形式来概述。因此，无论从哪一点来看，本发明的上述实施方案都只能认为是对本发明的说明而不能限制本发明，权利要求书指出了本发明的范围，而上述的说明并未指出本发明的范围，因此，在与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。
权利要求
1.一种液体深层发酵生产大团囊虫草菌体的方法，其特征在于，以人工分离培养到的大团囊虫草纯菌株为出发菌种，依次经固体斜面培养，摇床种子培养和发酵培养完成；所述大团囊虫草纯菌株，拉丁文学名为Cordyceps ophioglossoides，保藏号是CGMCC No.1146。
2.根据权利要求1所述液体深层发酵生产大团囊虫草菌体的方法，其特征在于，固体斜面培养的条件为，从保藏菌种接种到配制的斜面培养基上，温度20～30℃，培养200～240小时。
3.根据权利要求1所述液体深层发酵生产大团囊虫草菌体的方法，其特征在于，每1000毫升斜面培养基的主要成份为马铃薯100～300克、蔗糖或葡萄糖10～30克和琼脂15～25克，培养基的pH值调为4.8～6.5。
4.根据权利要求1所述液体深层发酵生产大团囊虫草菌体的方法，其特征在于，摇床种子培养的条件为，菌种固体斜面培养200～240小时后，挑取菌丝体接种于装有液体种子培养基的摇瓶中，在20～30℃培养，转速150～200rpm，培养60～72小时。
5.根据权利要求1所述液体深层发酵生产大团囊虫草菌体的方法，其特征在于，每1000毫升种子培养基的主要成份为蔗糖20～60克、酵母粉或酵母膏10～50克、蛋白胨10～50克、MgSO4·7H2O 0.1～0.5克和KH2PO40.1～0.5克。
6.根据权利要求1所述液体深层发酵生产大团囊虫草菌体的方法，其特征在于，发酵培养的方法是，液体种子摇床培养60～72小时后接种至装有发酵培养基的发酵罐中，接种量5～15％(V/V)、保持罐温20～30℃、罐压0.4～0.8kg/cm，搅拌速率100～250rpm，通气量1∶0.3～1∶1.2，发酵时间85～110小时。
7.根据权利要求1所述液体深层发酵生产大团囊虫草菌体的方法，其特征在于，每1000毫升发酵培养基的主要成份为蔗糖50～100克、酵母粉或酵母膏10～60克，蛋白水解液20～100毫升、MgSO4·7H2O 0.2～1克和KH2PO40.2～1克，培养基的pH值调为4.8～6.5。
8.根据权利要求1所述液体深层发酵生产大团囊虫草菌体的方法，其特征在于，发酵培养采用液体深层通气发酵培养。
全文摘要
本发明公开了一种液体深层发酵生产大团囊虫草菌体的方法，以大规模液体深层发酵培养大团囊虫草菌体(Cordyceps ophioglossoides)为目标。以人工分离培养到的大团囊虫草纯菌株为出发菌种，经斜面培养、摇瓶种子培养、最后到发酵罐培养，发酵液中的菌丝体以干重计可达2～3％的。本发明中公开的液体种子培养基和发酵培养基分别由蔗糖、酵母粉(膏)、蛋白胨、镁盐、钾盐和蔗糖、酵母粉(膏)、蛋白水解液、镁盐、钾盐组成。两种培养基分别适合液体种子阶段培养和深层液体通气培养大团囊虫草菌，合理满足了大团囊虫草菌不同发酵时期所需的营养物质，促进了菌体的生长和繁殖，提高了菌的活性。
文档编号C12N1/14GK1737110SQ20051005019
公开日2006年2月22日 申请日期2005年6月22日 优先权日2005年6月22日
发明者李永泉, 郑静 申请人:浙江大学