溶藻酸弧菌外膜蛋白w基因与制备方法及其应用的制作方法

专利名称：溶藻酸弧菌外膜蛋白w基因与制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种基因，尤其是涉及一种在溶藻酸弧菌(Vibrio alginolocius)外膜上表达的外膜蛋白W(outer membrane protein W，OmpW)基因与制备方法及其用途。
背景技术：
弧菌是一类重要的海洋致病性细菌，在沿海地区是胃肠道疾病的主要致病原，同时它们也是水产养殖业中的重要致病菌，弧菌病的发生经常导致巨大的经济损失。对不同的盐度环境的适应能力是海洋病原性微生物的一种基本机能，同时这也与细菌致病能力及繁殖传播能力紧密相关，而外膜蛋白处于细菌的最外层，直接与外界环境(包括海洋环境和宿主体内环境两面)相接触，对其展开深入研究是分析细菌盐度适应机制的一个重要的方面。在海水养殖环境中，弧菌属细菌在各类细菌中占很大比重，尤以溶藻弧菌(V.alginolyticus)、鳗弧菌(V.anguillarium)和副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)占明显优势。由于它广泛存在于自然海区，作为传染病源传播流行病已成为海水养殖危害最严重的病害之一。溶藻弧菌是在1961年由Miyamoto定名，由于生物学特性有许多地方与副溶血弧菌相似，同属嗜盐性海生弧菌，故1974年《伯杰氏细菌鉴定手册》中将它列为副溶血弧菌生物II型菌{副溶血弧菌为生物I型}，后证实两菌的DNA中G+C含量不同，1984年版《伯杰氏系统细菌鉴定手册》才把它从副溶血弧菌中划出来，独立为一个种，引起了大家的关注。多年来国内外陆续报道从腹泻和食物中毒患者粪便中检出该菌。OmpW是细菌外膜蛋白中的一个重要蛋白，目前在弧菌中仅副溶血弧菌(The LacentVolume 361，Issue 9359，1 March 2003，Pages743-749 Genome sequence of Vibrio parahaemolyticusa pathogenic mechanism distinct fromthat of V cholerae)和霍乱弧菌(Nucleic Acids Res.1990 April 25；18(8)2180.Nucleotidesequence of the gene，ompW，encoding a 22kDa immunogenic outer membrane protein of Vibriocholerae.)已测出该基因的核酸序列，而对其功能还未见阐述；在大肠杆菌中也含有OmpW基因，目前认为该蛋白是一个极性蛋白(Mol Microbiol 2004 May；52(4)129-44 Proteomicscreening and identification of differentially distributed membrane proteins in Escherichia coli)，且是大肠菌素的受体或则是受体的主要成员(J Bacteriol 1999 Jun 181(11)3578-81Characterization of colicin S4 and its receptor，OmpW，a minor protein of the Escherichia coliouter membrane)。尚未见有任何公开或报道过提及的溶藻酸OmpW核苷酸序列。也未见有报道过弧菌OmpW蛋白具有耐盐功能。

发明内容
本发明的目的在于提供一种新的溶藻酸弧菌OmpW基因，它是编码具有溶藻酸弧菌OmpW蛋白质活性的多肽的核苷酸序列。
本发明的另一目的是提供一种新的溶藻酸弧菌OmpW蛋白的氨基酸序列。
本发明的第三目的是提供一种利用重组技术制备上述新的溶藻酸弧菌OmpW基因的方法。
本发明还提供了这种溶藻酸弧菌和副溶血弧菌OmpW蛋白和编码序列的应用，即提供了该蛋白的一种新的功能，即耐盐功能。
本发明所说的溶藻酸弧菌OmpW基因是编码具有溶藻酸弧菌OmpW蛋白质活性的多肽的核苷酸序列，记为SEQ ID NO.3，即(i)序列特征(A)长度642bp(B)类型核苷酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii).分子类型核苷酸(iii).序列描述SEQ ID NO.31 ATGAAAAAAA CAATCTGCAG TCTAGCAGTG GTTGCTGCAC TCGTGTCACC AAGTGTTTTC61 GCTCATAAAC AGGGTGACTT CGTTCTTCGT GTTGGTGCGG CGTCTGTCGT TCCAAATGAC121 AGCAGTGATA AGATTCTTGG TTCTCAAGAA GAGTTAGAAG TTGACTCAAA TACGCAGCTT181 GGTTTGACGT TTGGCTACAT GTTCACAGAC AACATCAGTT TAGAGCTTCT AGCAGCAACA241 CCATTCAGCC ATGACATTTC GACAGATTTG GTTGGTAGTG ATATCGCGAA AACCAAACAT301 TTACCACCAA CGCTAATGGT GCAGTATTAT TTTGGCGAGT CTCAAAGTAA GTTCCGTCCA361 TACGTTGGTG CAGGTCTGAA CTACACCATA TTCTTTGATG AAGATTTCAA TAGTACGGGT421 AAAGGCGCTG ACCTGTCAGA TTTGAAATTA GATGATTCAT TCGGTCTAGC AGCGAATATT481 GGTGTGGATT ACATGATCAA CGATCAATGG TTCCTCAACG CCGCTGCGTG GTACGCAAAT541 ATTGAGACAG AAGCAACTTA CAAAGCAGGT GGAGTGAAGC AAAAAACCGA CGTCAAAATT601 AACCCTTGGG TATTTATGAT CAGCGGCGGT TACAAGTTCT AA本发明所说的溶藻酸弧菌OmpW蛋白的氨基酸序列记为SEQ ID NO.4，其相关信息为(i)序列特征(A)长度213氨基酸(B)类型氨基酸(C)链性单链
(D)拓扑结构线性(ii).分子类型多肽(iii).序列描述1 MKKTICSLAV VAALVSPSVF AHKQGDFVLR VGAASVVPND SSDKILGSQE ELEVDSNTQL61 GLTFGYMFTD NISLELLAAT PFSHDISTDL VGSDIAKTKH LPPTLMVQYY FGESQSKFRP121 YVGAGLNYTI FFDEDFNSTG KGADLSDLKL DDSFGLAANI GVDYMINDQW FLNAAAWYAN181 IETEATYKAG GVKQKTDVKI NPWVFMISGG YKF-本发明所说的溶藻酸弧菌OmpW基因的制备方法，其步骤如下(1)将编码具有溶藻酸弧菌OmpW蛋白活性多肽的纯化的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成溶藻酸OmpW蛋白表达载体，所述的核苷酸序列记为SEQ ID NO.3中的核苷酸序列；(2)将步骤(1)中的表达载体转入宿主细胞，形成溶藻酸弧菌OmpW蛋白的重组细胞；(3)在适合表达溶藻酸弧菌OmpW蛋白多肽的条件下，培养步骤(2)中的重组细胞；(4)分离出具有溶藻酸弧菌OmpW蛋白活性的基本纯的多肽。
本发明与溶藻酸弧菌OmpW蛋白多肽特异性结合的抗体为多克隆抗体。
所说的“分离的”、“纯化的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下从位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随的核酸的组份分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。
在本发明中所说的载体可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。在生产本发明的溶藻酸弧菌OmpW多肽时，可以将溶藻酸弧菌OmpW编码序列可操作地连于表达调控序列，从而形成溶藻酸弧菌OmpW蛋白表达载体。
所说的“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。
所说的“宿主细胞”为原核细胞。常用的原核宿主细胞为大肠杆菌(E.coli)或枯草芽孢杆菌等，优选E.coli DH5α；E.coli BL21和E.coli TOP10等。
还可以用溶藻酸弧菌OmpW特异抗体的Western印迹分析来分析溶藻酸弧菌OmpW基因产物的表达，并证实其在生物样本中的表达。
此外，根据本发明的溶藻酸弧菌OmpW核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上，筛选溶藻酸弧菌OmpW同源基因或同源蛋白。
另外，根据本发明的溶藻酸弧菌OmpW蛋白的耐盐功能及分子量，可以在不同盐度下筛选溶藻酸弧菌OmpW同源基因或同源蛋白。
本发明的溶藻酸弧菌OmpW核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或文库筛选法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列来设计引物，并用溶藻酸弧菌做为模板，扩增而得有关序列。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工化学合成的方法来合成有关序列。在本申请之前，现有技术已完全可以通过先合成多个多核苷酸小片段，然后再进行连接而获得编码本发明溶藻酸OmpW蛋白的核酸序列。然后，可将该核酸序列引入本领域中各种现有的DNA分子(如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。


图1为不同盐度条件下溶藻弧菌外膜蛋白SDS-PAGE图谱比较。在图1中，1-4分别表示盐度为1％，2％，3％，4％，M表示mark，KDa表示分子量的大小。
图2为在不同盐度条件(0.85％与3.5％)下，副溶血弧菌外膜蛋白双向电泳图谱比较。
图3为PET-OmpW克隆子在E.coli BL21中的诱导表达。在图3中，1为所克隆的基因的表达条带；2为空载体的条带。
图4为PLLP-OmpA-OmpW克隆子的双酶切鉴定。在图4中，1-3分别表示对照，目的基因双切，mark，单位为Kb。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆实验室手册(2001 by Cold Spring Harbor Laboratory Press)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1 溶藻酸弧菌OmpW基因的克隆1.细菌培养溶藻酸弧菌来源于本实验室保存菌株，挑取单菌落于LB培养基培养过夜后，加30％甘油-70℃保存。
2.基因的全长克隆(Cloning of full-length DNA)从以副溶血弧菌基因组数据为检索对象可以对溶藻弧菌OmpW成功进行鉴定，但从结果的显著性并不高这一点来看，在这两种菌间，OmpW在序列上应该是有差异但是相似性仍然很高。由此，可根据副溶血弧菌OmpW序列的5′端和3′端并加上酶切位点和两个保护碱基设计引物，R15′-GGGGATCCATGAAAAAAACAATCTG-3′(记为SEQ ID NO.1)为正向引物，寡核苷酸R25′-CCGAATTCTTAGAACTTGTAACCGC-3′(记为SEQ ID NO.2)为反向引物，以溶藻酸弧菌为模板，对溶藻酸弧菌OmpW蛋白进行PCR扩增，R1/R2的PCR条件为94℃5分钟，随之以94℃1分钟、55℃1分钟和72℃90秒进行35个循环，最后以72℃延伸5分钟。电泳检测PCR扩增产物，获得扩增片段长度为642bp。然后按常规方法以PCR扩增产物进行克隆、测序，获得SEQ ID NO.3所示的序列。
上述SEQ ID NO.1与SEQ IDNO.2分别为SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)长度25bp(B)类型核苷酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii).分子类型寡核苷酸(iii).序列描述GGGGATCCATGAAAAAAACAATCTGSEQ ID NO.2的信息(i)序列特征(A)长度25bp(B)类型核苷酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii).分子类型寡核苷酸(iii).序列描述CCGAATTCTTAGAACTTGTAACCGC实施例2 溶藻酸弧菌OmpW基因的序列信息与同源性分析本发明新的溶藻酸弧菌OmpW基因全长为642 bp，详细序列见SEQ ID NO.3。根据DNA全长推导出溶藻酸弧菌OmpW的氨基酸序列，共213个氨基酸残基，分子量22Kd，详细序列记为SEQ ID NO.4，其相关信息为(i)序列特征(A)长度213氨基酸(B)类型氨基酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii).分子类型多肽(iii).序列描述
1 MKKTICSLAV VAALVSPSVF AHKQGDFVLR VGAASVVPND SSDKILGSQE ELEVDSNTQL61 GLTFGYMFTD NISLELLAAT PFSHDISTDL VGSDIAKTKH LPPTLMVQYY FGESQSKFRP121 YVGAGLNYTI FFDEDFNSTG KGADLSDLKL DDSFGLAANI GVDYMINDQW FLNAAAWYAN181 IETEATYKAG GVKQKTDVKI NPWVFMISGG YKF-将OmpW的基因序列全长及基编码蛋白质用BLAST程序在NCBI数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现它与副溶血弧菌OmpW基因存在很高的同源性。在核苷酸水平上，它与副溶血弧菌OmpW基因的全编码序列(GenBank Accession No.BA000032)中的11-645序列具有88％的相同性(见表1)表1Percent Identity88％in nt overlapQuery11 caatctgcagtctagcagtggttgctgcactcgtgtcaccaagtgttttcgctcataaac 70||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct11 caatctgcagtctagcagtggttgctgcactcgtgtcaccaagtgttttcgctcataaac 70Query71 agggtgacttcgttcttcgtgttggtgcggcgtctgtcgttccaaatgacagcagtgata 130| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||Sbjct71 aaggtgacttcgttcttcgtgttggtgcggcgtctgtcgttccaaatgacagcagcgata 130Query131 agattcttggttctcaagaagagttagaagttgactcaaatacgcagcttggtttgacgt 190|||||||||||||||||||||| || |||| || |||||||||||||||||||||||||Sbjct131 agattcttggttctcaagaagaattgaaagtggattcaaatacgcagcttggtttgacgt 190Query191 ttggctacatgttcacagacaacatcagtttagagcttctagcagcaacaccattcagcc 250|||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct191 ttggctacatgttcacagacaacatcagcctagagcttctagcagcaacaccattcagcc 250Query251 atgacatttcgacagatttggttgg---tagtgatatcgcgaaaaccaaacatttaccac 307|||| ||||| ||||| ||| | || | ||||||||||| | |||||||| | ||||Sbjct251 atgatatttcaacagacttgttaggtcttggtgatatcgcggacaccaaacaccttccac 310Query308 caacgctaatggtgcagtattattttggcgagtctcaaagtaagttccgtccatacgttg 367||||||| ||||| ||||| || ||||||||| | |||||||||||||||||||||||||Sbjct311 caacgcttatggttcagtactactttggcgagccacaaagtaagttccgtccatacgttg 370Query368 gtgcaggtctgaactacaccatattctttgatgaagatttcaatagtacgggtaaaggcg 427|||||||||| ||||||||||| || |||||||||| || || | | | ||| ||Sbjct371 gtgcaggtctcaactacaccatcttttttgatgaaggctttaacaacaaagcgaaaaacg 430Query428 ctgacctgtcagatttgaaattagatgattcattcggtctagcagcgaatattggtgtgg 487| | | | ||| | || |||| |||||||| ||| ||||||| || | || ||||Sbjct431 tgggcttaactgatcttaagctagacgattcatttggtttagcagcaaacgtaggcgtgg 490
Query488 attacatgatcaacgatcaatggttcctcaacgccgctgcgtggtacgcaaatattgaga 547| |||||||||||||||||||||||||| ||||| |||||||||| ||||| |||||Sbjct491 actacatgatcaacgatcaatggttccttaacgcatctgcgtggtatgcaaacattgaaa 550Query548 cagaagcaacttacaaagcaggtggagtgaagcaaaaaaccgacgtcaaaattaaccctt 607|||||||||| |||||| ||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct551 cagaagcaacatacaaatttggtggagcgaagcaaaaaaccgacgtcaaaattaaccctt 610Query608 gggtatttatgatcagcggcggttacaagttctaa 642|||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct611 gggtatttatgatcagcggcggttacaagttctaa 645上列溶藻酸OmpW蛋白的核酸序列下列副溶血弧菌OmpW蛋白的核酸序列(GenBank Accession No.BA000032)在氨基酸水平上，它与副溶血弧菌OmpW蛋白(GenPeptAccession No.BAC61439)的氨基酸残基有着极高的相同性和相似性(见表2)。表2为本发明的溶藻酸OmpW蛋白与副溶血弧菌OmpW蛋白的氨基酸序列(GenPept Accession No.BAC61439)的同源比较(FASTA)图。其中，相同的氨基酸在两个序列之间用氨基酸单字符标出，相似的氨基酸用“+”标出。
表2Identities＝181/214(84％)，Positives＝187/214(86％)，Gaps＝1/214(0％)Query1 MKKTICXXXXXXXXXXXXXXXHKQGDFVLRVGAASVVPNDSSDKILGSQEELEVDSNTQL 60MKKTIC HKQGDFVLRVGAASVVPNDSSDKILGSQEEL+VDSNTQLSbjct1 MKKTICSLAVVAALVSPSVFAHKQGDFVLRVGAASVVPNDSSDKILGSQEELKVDSNTQL 60Query61 GLTFGYMFTDNISLELLAATPFSHDISTDLVG-SDIAKTKHLPPTLMVQYYFGESQSKFR 119GLTFGYMFTDNISLELLAATPFSHDISTDL+G DIA TKHLPPTLMVQYYFGE QSKFRSbjct61 GLTFGYMFTDNISLELLAATPFSHDISTDLLGLGDIADTKHLPPTLMVQYYFGEPQSKFR 120Query120 PYVGAGLNYTIFFDEDFNSTGKGADLSDLKLDDSFGLAANIGVDYMINDQWFLNAAAWYA 179PYVGAGLNYTIFFDE FN+ K L+DLKLDDSFGLAAN+GVDYMINDQWFLNA+AWYASbjct121 PYVGAGLNYTIFFDEGFNNKAKNVGLTDLKLDDSFGLAANVGVDYMINDQWFLNASAWYA 180Query180 NIETEATYKAGGVKQKTDVKINPWVFMISGGYKF 213NIETEATYK GG KQKTDVKINPWVFMISGGYKFSbjct181 NIETEATYKFGGAKQKTDVKINPWVFMISGGYKF 214上列溶藻酸OmpW蛋白的氨基酸序列下列副溶血弧菌OmpW蛋白的氨基酸序列(GenPept Accession No.BAC61439)由上可见，溶藻酸弧菌OmpW基因与副溶血弧菌OmpW基因无论从核酸还是蛋白水平上都存在较高的同源性，可以认为两者在功能上也有很高相似性。
实施例3 溶藻酸弧菌OmpW蛋白的结构和功能研究以下给出不同盐浓度条件下溶藻弧菌OmpW的变化在提取了溶藻弧菌在1％、2％、3％及4％这四种盐浓度培养条件下的外膜蛋白以后，首先通过SDS-PAGE对它们外膜蛋白图谱进行比较分析，结果如图1所示。从图1中可以清楚地看到，随着盐度的逐渐上升，有一个蛋白条带也相应表现出在量上的逐渐上升，这表明这条蛋白条带与溶藻弧菌的盐适应性具有紧密相关性。结合对溶藻弧菌外膜蛋白的鉴定结果可以知道，这个条带为OmpW。
以下给出不同盐浓度条件下副溶血弧菌OmpW的变化与对溶藻弧菌的研究相类似，对副溶血弧菌在不同盐度条件下外膜蛋白的表达进行了比较分析。提取不同盐度条件下(0.85％与3.5％)培养的副溶血弧菌的外膜蛋白，对它们进行了双向电泳图谱分析，结果如图2所示。
在对两种盐度外膜蛋白表达差异的分析中，可发现有一个差异表达点(如图2所标出)，其鉴定结果也是OmpW，与溶藻弧菌中的情况相符合。从图2中可以看出，OmpW随着盐度的上升表达量也提高，这与溶藻弧菌中的情况也是一致的。这进一步表明在弧菌中OmpW蛋白与盐适应能力之间的相关性。
同时从图2中也可以看出，副溶血弧菌中OmpW在高盐度情况下的表达量远低于在溶藻酸弧菌的表达量，如果说两种蛋白与盐适应性紧密相关，那么在其表达量不同可能会影响到细菌对盐度耐受能力的不同。
以下给出三种弧菌对盐耐受度能力的比较除了以上的溶藻弧菌和副溶血弧菌，可加入一个很有意义的菌种一创伤弧菌一同进行分析。之所以说创伤弧菌有意义，是因为对创伤弧菌的基因组进行分析后，发现它不存在OmpW基因，把它与前两种菌一起进行盐耐受能力比较，可以更加清楚地看出OmpW的作用。
在1％，2％直至13％盐浓度的LB平板上同时接入了这三种弧菌，根据在不同盐度平板上细菌是否能够生长来判断它们盐耐受度的差异，表3是在接种18小时后观察的结果。
表3

注+表示有菌落；-表示不生长从表3中的结果可以看出，在盐耐受能力上，溶藻酸弧菌＞副溶血弧菌＞创伤弧菌，这种情况与在这三种弧菌是否表达OmpW蛋白及表达量的不同正好相互对应，这进一步表明OmpW与弧菌盐耐受能力的相关性。以下进一步论证OmpW蛋白与盐耐受能力间的相互关系。
溶藻酸弧菌OmpW蛋白的克隆及诱导表达后对菌体盐耐受能力的影响按实施例1中的方法对溶藻酸弧菌OmpW蛋白进行PCR扩增后，分别连接到PETHIS及PLLP-OmpA中并最终分别转入E.coli BL21和Top10中。图3是对E.coli BL21 OmpW转化子经IPTG诱导表达后的SDS-PAGE图谱。从图3中可以清楚地看到OmpW蛋白的表达。对此经诱导表达的菌株以及同样经过诱导的E.coli Top10+PLLP-OmpA-OmpW进行了盐耐受能力的分析，表4为在各盐度平板接种24小时后的生长观察结果。
表4

从表4中可以看出，E.coli Top10+PLLP-OmpA-Omp比对照株E.coli Top10+PLLP-OmpA盐的耐受力上高了两个盐度，这明显表明了溶藻酸弧菌OmpW与盐耐受能力的直接相关性。
同时，可以看到E.coli BL21+PET-OmpW与其对照株E.coli BL21+PET-OmpW在盐耐受度上基本相同，没有表现出OmpW导入后对其耐盐能力的提升。其原因主要是，OmpW在E.coli BL21+PET-OmpW中表达后仍然存在于胞内，很难到达外膜部位，从而无法发挥其在盐耐受能力方面的作用。而在使用PLLP-OmpA载体后，由于载体上所带的OmpA信号肽的作用，使诱导表达的OmpW蛋白可以分泌到胞外，在通过某种方式插入外膜后OmpW蛋白就表现出其在提升盐耐受能力上的作用。使用这两种载体得出的不同结果进一步表明了，OmpW表达导致盐耐受度的提升是OmpW蛋白自身的作用，而不是其诱导表达后导致细胞其它变化而产生。
实施例4 溶藻酸弧菌OmpW多肽的制备和提纯将全长的溶藻酸弧菌OmpW编码序列或片段构建入大肠杆菌蛋白质原核表达载体之中，以达到表达和提纯目的蛋白。
大肠杆菌DH5α克隆载体的构建，以及转化DH5α感受态细胞根据以上设计好的引物，分别对应于编码序列5′和3′端的约20个核苷酸，并在正反引物上分别引入限制性内酶位点(这根据选用的大肠杆菌表达质粒PET-HIS而定)，以便构建克隆和表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，将溶藻酸弧菌OmpW基因克隆至E.coli表达质粒PET-HIS.用合适的内切酶将质粒线性化。用琼脂糖胶电泳来确定质粒的纯度和浓度。将线性化的克隆质粒，用化学热激法转化到克隆载体E.coliDH5α感受态中。全部涂于LB+Amp平板上，37℃培养12～16小时。
克隆进溶藻酸菌OmpW蛋白的DH5α阳性克隆的筛选、鉴定随机挑取LB+Amp平板上的大肠杆菌菌落，接种于LB+Amp液体培养基上，同时接种含有空PET-HIS质粒的DH5α，过夜培养，用碱裂解法分别提取质粒，并对所提取出的质粒分别进行双酶切验证，得到双酶切图谱如图4所示。
大肠杆菌BL21表达载体的构建，以及转化BL21感受态细胞将以上检测出含有溶藻酸弧菌OmpW蛋白基因的质粒用同样的化学热激法转化进BL21感受态。全部涂于LB+Amp平板上，37℃培养10-16小时。
表达溶藻酸弧菌OMPW蛋白的BL21阳性克隆的筛选、鉴定随机挑取LB+Amp平板上的大肠杆菌BL21菌落，接种于LB+Amp液体培养基上，同时接种未转化的BL21和含有PET-HIS空质粒的BL21，于30℃中度轻摇至OD值为0.6，加入IPTG100g/ml 35℃诱导两个小时，离心收集菌体，SDS-PAGE检测表达产物，结果如图2所示。
利用Western blot检测OmpW蛋白在转基因E.coli中的表达1、蛋白的获取按上述方法表达溶藻酸弧菌OmpW蛋白。
2、SDS-PAGE分离蛋白SDS-PAGE的制备参考《分子克隆》(Sambrook等，2001)；a)加样前，将样品置于LSB加样缓冲液(2*加样缓冲液甘油2.4g，1M Tris-HCl pH6.8 1ml；溴酚兰0.01％，H2O定容至20ml)，煮沸3～5分钟；b)4℃ 80V电压下聚丙烯酰胺凝胶电泳，直到指示剂(溴酚兰)前沿达到凝胶底部。
3、蛋白质向硝酸纤维膜上转移a)转移之前，用转移缓冲液(39mmol甘氨酸，48mmolTris Base，0.037％SDS，20％甲醇)平衡凝胶和硝酸纤维膜30分钟；b)4℃下用DYY-7B电转仪50V转移2小时，凝胶两侧各垫3层Whatman滤纸。
4、膜上蛋白的检测a)将硝酸纤维膜浸在封闭液中，室温缓慢摇动、封闭60分钟(封闭液取5g脱脂奶粉溶于100ml TNT；b)再将膜浸泡在洗涤缓冲液中，室温洗涤三次，每次10分钟；c)加入第一抗体(抗溶藻酸弧菌OmpW的抗体)，室温反应60分钟；同步骤b)，洗涤三次；d)加入第二抗体(辣根过氧化酶兔抗鼠二抗)，室温反应60分钟；同步骤b)，洗涤三次；e)加入底物DAB显色观察蛋白条带。
权利要求
1.溶藻酸弧菌外膜蛋白W基因，其特征在于是编码具有溶藻酸弧菌OmpW蛋白质活性的多肽的核苷酸序列，记为SEQ ID NO.3，即(i)序列特征(A)长度642bp(B)类型核苷酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii).分子类型核苷酸(iii).序列描述SEQ ID NO.31 ATGAAAAAAA CAATCTGCAG TCTAGCAGTG GTTGCTGCAC TCGTGTCACC AAGTGTTTTC61 GCTCATAAAC AGGGTGACTT CGTTCTTCGT GTTGGTGCGG CGTCTGTCGT TCCAAATGAC121 AGCAGTGATA AGATTCTTGG TTCTCAAGAA GAGTTAGAAG TTGACTCAAA TACGCAGCTT181 GGTTTGACGT TTGGCTACAT GTTCACAGAC AACATCAGTT TAGAGCTTCT AGCAGCAACA241 CCATTCAGCC ATGACATTTC GACAGATTTG GTTGGTAGTG ATATCGCGAA AACCAAACAT301 TTACCACCAA CGCTAATGGT GCAGTATTAT TTTGGCGAGT CTCAAAGTAA GTTCCGTCCA361 TACGTTGGTG CAGGTCTGAA CTACACCATA TTCTTTGATG AAGATTTCAA TAGTACGGGT421 AAAGGCGCTG ACCTGTCAGA TTTGAAATTA GATGATTCAT TCGGTCTAGC AGCGAATATT481 GGTGTGGATT ACATGATCAA CGATCAATGG TTCCTCAACG CCGCTGCGTG GTACGCAAAT541 ATTGAGACAG AAGCAACTTA CAAAGCAGGT GGAGTGAAGC AAAAAACCGA CGTCAAAATT601 AACCCTTGGG TATTTATGAT CAGCGGCGGT TACAAGTTCT AA。
2.溶藻酸弧菌OmpW蛋白的氨基酸序列，其特征在于记为SEQ ID NO.4，其相关信息为(i)序列特征(A)长度213氨基酸(B)类型氨基酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii).分子类型多肽(iii).序列描述1 MKKTICSLAV VAALVSPSVF AHKQGDFVLR VGAASVVPND SSDKILGSQE ELEVDSNTQL61 GLTFGYMFTD NISLELLAAT PFSHDISTDL VGSDIAKTKH LPPTLMVQYY FGESQSKFRP121 YVGAGLNYTI FFDEDFNSTG KGADLSDLKL DDSFGLAANI GVDYMINDQW FLNAAAWYAN181 IETEATYKAG GVKQKTDVKI NPWVFMISGG YKF-。
3.溶藻酸弧菌OmpW基因的制备方法，其特征在于其步骤如下(1)将编码具有溶藻酸弧菌OmpW蛋白活性多肽的纯化的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成溶藻酸OmpW蛋白表达载体，所述的核苷酸序列记为SEQ ID NO.3中的核苷酸序列；(2)将步骤(1)中的表达载体转入宿主细胞，形成溶藻酸弧菌OmpW蛋白的重组细胞；(3)在适合表达溶藻酸弧菌OmpW蛋白多肽的条件下，培养步骤(2)中的重组细胞；(4)分离出具有溶藻酸弧菌OmpW蛋白活性的基本纯的多肽；所说的核苷酸序列记为SEQ ID NO.3，即(i)序列特征(A)长度642bp(B)类型核苷酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii).分子类型核苷酸(iii).序列描述SEQ ID NO.31 ATGAAAAAAA CAATCTGCAG TCTAGCAGTG GTTGCTGCAC TCGTGTCACC AAGTGTTTTC61 GCTCATAAAC AGGGTGACTT CGTTCTTCGT GTTGGTGCGG CGTCTGTCGT TCCAAATGAC121 AGCAGTGATA AGATTCTTGG TTCTCAAGAA GAGTTAGAAG TTGACTCAAA TACGCAGCTT181 GGTTTGACGT TTGGCTACAT GTTCACAGAC AACATCAGTT TAGAGCTTCT AGCAGCAACA241 CCATTCAGCC ATGACATTTC GACAGATTTG GTTGGTAGTG ATATCGCGAA AACCAAACAT301 TTACCACCAA CGCTAATGGT GCAGTATTAT TTTGGCGAGT CTCAAAGTAA GTTCCGTCCA361 TACGTTGGTG CAGGTCTGAA CTACACCATA TTCTTTGATG AAGATTTCAA TAGTACGGGT421 AAAGGCGCTG ACCTGTCAGA TTTGAAATTA GATGATTCAT TCGGTCTAGC AGCGAATATT481 GGTGTGGATT ACATGATCAA CGATCAATGG TTCCTCAACG CCGCTGCGTG GTACGCAAAT541 ATTGAGACAG AAGCAACTTA CAAAGCAGGT GGAGTGAAGC AAAAAACCGA CGTCAAAATT601 AACCCTTGGG TATTTATGAT CAGCGGCGGT TACAAGTTCT AA。
4.如权利要求3所述的溶藻酸弧菌OmpW基因的制备方法，其特征在于所说的“分离的”、“纯化的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下从位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随的核酸的组份分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。
5.如权利要求3所述的溶藻酸弧菌OmpW基因的制备方法，其特征在于所说的载体优选质粒或粘粒载体。
6.如权利要求3所述的溶藻酸弧菌OmpW基因的制备方法，其特征在于在步骤(1)中，将溶藻酸弧菌OmpW编码序列可操作地连于表达调控序列，从而形成溶藻酸弧菌OmpW蛋白表达载体。
7.如权利要求3所述的溶藻酸弧菌OmpW基因的制备方法，其特征在于在步骤(1)中，所说的可操作地连于指线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。
8.如权利要求3所述的溶藻酸弧菌OmpW基因的制备方法，其特征在于在步骤(2)中，所说的宿主细胞为原核细胞。
9.如权利要求8所述的溶藻酸弧菌OmpW基因的制备方法，其特征在于所说的原核细胞为大肠杆菌或枯草芽孢杆菌，优选大肠杆菌DH5α，大肠杆菌BL21或大肠杆菌TOP10。
10.溶藻酸弧菌和副溶血弧菌OmpW蛋白和编码序列应用于耐盐产品。
全文摘要
溶藻酸弧菌外膜蛋白W基因与制备方法及其应用，涉及一种基因，尤其是涉及一种在溶藻酸弧菌外膜上表达的外膜蛋白W基因与制备方法及其用途。提供一种新的溶藻酸弧菌OmpW基因，它是编码具有溶藻酸弧菌OmpW蛋白质活性的多肽的核苷酸序列和溶藻酸弧菌OmpW蛋白的氨基酸序列及其利用重组技术制备溶藻酸弧菌OmpW基因的方法。提供溶藻酸弧菌和副溶血弧菌OmpW蛋白和编码序列的应用。其步骤为将编码具有溶藻酸弧菌OmpW蛋白活性多肽的纯化的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成溶藻酸OmpW蛋白表达载体，将表达载体转入宿主细胞，形成溶藻酸弧菌OmpW蛋白的重组细胞；培养重组细胞；分离。
文档编号C12N15/31GK1699573SQ20051005322
公开日2005年11月23日 申请日期2005年2月17日 优先权日2005年2月17日
发明者彭宣宪, 吴丽娜, 徐常新, 王三英 申请人:厦门大学