专利名称：一株酵母菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及环境生物技术领域中一株酵母菌及其应用。
背景技术：
应用在纺织工业的染料通常具有复杂的合成区域和芳香环结构，使得它们在环境中非常稳定，不易降解。它们常随染料废水排放到环境中，对环境造成严重污染。为了减少这类物质的危害，除了对它们采用常规的物理和化学方法处理外，采用新的、对环境友好的生物技术处理方法越来越具有吸引力。酵母菌是一种单细胞真菌类微生物，它既具有单细胞细菌生长快、易于操作的特点，又能象丝状真菌那样抵御不良的生长环境，因此，它适合运用于环境治理。目前它在环境领域的应用包括处理味精废水、油料废水生产饲料蛋白，处理造纸废水生产燃料酒精等。然而，它在染料废水治理中的运用还非常有限，其中的一个重要原因是缺乏确实能有效对染料脱色的酵母菌株。
发明内容
本发明的目的是提供一株能对染料高效脱色的酵母菌。
本发明所提供的对染料高效脱色的酵母菌株是Pseudozyma rugulosa Y-63，该菌株已于2004年12月20日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.1274。
在显微镜下观察，该菌株的细胞为腊肠形至纺锤形，一端芽殖，大小为(4.8-7.2)×(2.4-3.6)μm。在液体培养基里，该菌形成沉淀。在固体培养基里，该菌菌落黄褐色，松脆状，表面皱褶，不反光，边缘刻蚀状，并且有真菌丝产生。其26S rRNA具有序列表中序列1的核苷酸序列，其18S rRNA与26S rRNA的间隔序列(ITS)为序列表中的序列2。
可按下述方法培养上述酵母菌株Pseudozyma rugulosa Y-63 CGMCC No.1274用接种环挑取菌体接到斜面上，在25-30℃下，斜面培养基上生长1-3天，再挑取斜面菌种接入液体培养基，在25-30℃下，培养1-3天，经离心可获得该菌株的菌体。所述培养基组成为葡萄糖2％、蛋白胨2％、酵母粉1％，pH自然，琼脂2％(液体培养基不加琼脂)，溶剂为水。
本发明的另一个目的是提供一种对染料脱色的方法。
本发明所提供的对染料脱色的方法，是利用Pseudozyma rugulosa Y-63 CGMCCNo.1274对染料进行原位脱色。
Pseudozyma rugulosa Y-63 CGMCC No.1274对染料的脱色方法为原位脱色，即酵母菌的培养与其对染料的脱色同步。
为了提高脱色效率，所述染料的浓度可为50-1000mg/L；利用Pseudozymarugulosa Y-63 CGMCC No.1274对染料进行脱色的脱色培养基包括以下成分葡萄糖1％，KH2PO40.1％，(NH4)2SO40.1％，MgSO40.05％，酵母浸粉0.02％，pH自然，溶剂为水。
培养温度为28℃，培养时间为24-48h。
上述百分比浓度均为质量百分比浓度。
该菌株能对多种类型的染料脱色，特别是对活性偶氮染料、蒽醌染料、三苯甲烷染料以及硫化染料的脱色尤其有效。
实验证明在24h内，Pseudozyma rugulosa Y-63 CGMCC No.1274对活性偶氮染料(50mg/L)如活性艳红K-2BP，酸性媒介黄GG，弱酸艳红B，活性黑KN-B和活性红M-3BE的脱色率高于90％；对三苯甲烷染料(50mg/L)如媒介漂蓝B的脱色率能达到90％；对蒽醌染料(50mg/L)如活性艳蓝X-BR和媒介红S-80的脱色率分别能达到62％和10％；对硫化染料(50mg/L)如活性翠蓝KN-G的脱色率能达到65％；对结构未发表的染料(50mg/L)-依加仑蓝FBL脱色率能达到69％。
本发明的酵母菌株Pseudozyma rugulosa Y-63 CGMCC No.1274是一株具有极高活力，对染料脱色能力极强的菌株，其培养方法简单，生长速度快，不易变异，可以用作研究酵母对染料脱色机制的模式菌株，更重要的是可以直接用于染料的脱色。该菌株具有在染料废水处理的工业化应用前景。
具体实施例方式
下属实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所有百分比浓度均为质量百分比浓度，所有培养基中的溶剂均为水。
实施例1、Pseudozyma rugulosa Y-63 CGMCC No.1247菌体的培养用接种环挑取酵母菌株Pseudozyma rugulosa Y-63 CGMCC No.1247接到斜面(葡萄糖2％、蛋白胨2％、酵母粉1％，pH自然，琼脂2％)上，在温度设置为28℃的培养箱里，培养1-3天，出现白色的菌体。然后，用接种环从斜面上挑取生长良好的菌体接到装有培养液(葡萄糖2％、蛋白胨2％、酵母粉1％，pH自然)的三角瓶中，在温度设置为28℃、转速为200rpm的摇床上培养1-3天，所得菌体离心(9000rpm)10min，菌体用无菌生理盐水(0.8％)和无菌水洗涤，再离心，反复2-3次，即可获得白色无污染的Pseudozyma rugulosa Y-63 CGMCC No.1247酵母细胞。
上述培养基和培养液均在121℃、0.1MPa下灭菌20min。
实施例2、Pseudozyma rugulosa Y-63 CGMCC No.1247对活性艳红K-2BP和活性黑KN-B的脱色活性艳红K-2BP脱色培养基葡萄糖1％，KH2PO40.1％，(NH4)2SO40.1％，MgSO40.05％，酵母粉0.02％，活性艳红K-2BP 200mg/L 50mg/L，pH自然。
活性黑KN-B的脱色培养基葡萄糖1％，KH2PO40.1％，(NH4)2SO40.1％，MgSO40.05％，酵母粉0.02％，活性黑KN-B 50mg/L，pH自然。
按照实施例1的方法，用液体培养基(葡萄糖1％，KH2PO40.1％，(NH4)2SO40.1％，MgSO40.05％，酵母粉0.02％，pH自然)将酵母菌株Pseudozyma rugulosa Y-63CGMCC No.1247培养至对数期，按10％(v/v)的接种量分别转接到活性艳红K-2BP和活性黑KN-B的脱色培养基里，在摇床上培养，每个50ml的三角瓶里装脱色液体培养基20ml，摇床转速200rpm，28℃培养24h。用移液器取4ml培养液，加入到离心管中，9000rpm离心10min，取上清液在分光光度计上测定在染料最大吸收波长处的OD值，并以不接酵母菌的染料培养基为对照，计算脱色率，以表示对染料的脱色能力。脱色率(％)＝(A-B)/A×100(A-脱色前，脱色培养基的OD值，B-脱色后，脱色培养基的OD值)。实验结果表明200mg/L活性艳红K-2BP经过与Pseudozymarugulosa Y-63 CGMCC No.1247的同步培养，脱色率为94％；50mg/L活性黑KN-B为96％。
上述培养基和培养液均在121℃、0.1MPa下灭菌20min。
活性艳红K-2BP的结构式如(式I)所示。
(式I)活性黑KN-B的结构式如(式II)所示。
(式II)
实施例3、Pseudozyma rugulosa Y-63 CGMCC No.1247对媒介漂蓝B的脱色按照实施例2的方法，将酵母菌株Pseudozyma rugulosa Y-63 CGMCC No.1247在媒介漂蓝B脱色培养基(葡萄糖1％，KH2PO40.1％，(NH4)2SO40.1％，MgSO40.05％，酵母粉0.02％，媒介漂蓝B(式III)50mg/L，pH自然)里培养24h，实验结果表明该菌株对50mg/L媒介漂蓝B的脱色率为91％。
(式III)
序列表<160>2<210>1<211>621<212>DNA<213>Pseudozyma rugulosa<220>
<221>misc feature<222>(608)..(609)<223>n＝a，c，g或t<220>
<221>misc feature<222>(611)..(612)<223>n＝a，c，g或t<220>
<221>misc feature<222>(614)..(620)<223>n＝a，c，g或t<400>1ccaacgccct aagcgtaaag gtgcccgaag gcccgctctt gcgagtacgc tgctgtcctc 60gggtctcggt cgctgtatcc agtaggaggc tataacacac cccgagaggt gccacgttcc120tcctaccctt ctccagtgcc caaaaccgac gttggcctgc aatctgggaa aaacaccaag180caaaagcaag gctgaatccc aggccgcatc tctgacctcc tacccttccc ttttggcaat240ttcacgtact gtttaactct cttttcaaag ttcttttcat ctttccatca ctgtacttgt300tcgctatcgg tctctcccca atatttagcc ttagatggca tttaccaccc attttgagct360gcattcccaa acaactcgac tcttagaaag tgtatcacaa agcttcgggc gctccaagcc420atgtacggga ttatcaccct ctatgatgcc cttttccaag ggacttaggc ttggtccgaa480
gcggaaaaca cttcttgaga ttacaatgcg gacgccgaag acgccagctt tcaatcttgg540gctcttccct cttcactcgc cgttactagg ggaatccttg ttagtttctt tttctcagct600ttattggnnt nnannnnnnn c 621<210>2<211>696<212>DNA<213>Pseudozyma rugulosa<400>2aagtgtggct cgcacctgtc taactaaatc gagctaccac attttaacac ggttgcatcg 60gttggctgtc aaacagtgcg cgcggcgatt tattttattt cgcccaccgc gctttgcgag120acggtcgaca tttaccaaaa acactgttga taccatagga tttgaacgta gatgaaactc180gactggtaat gcggtcgtct aaaatctaaa aacaactttt ggcaacggat ctcttggttc240tcccatcgat gaagaacgca gcgaattgcg ataagtaatg tgaattgcag aagtgaatca300tcgaatcttt gaacgcacct tgcgctcccg gcagatctaa tctggggagc atgcctgttt360gagggccgcg aattgtttcg aacgacagct ttcttattta gttgagaaag gtggcggatc420ggtattgagg gtcttgccat cttccacggt ggctccctcg aaatgcatta gcgcatccat480tcgataggca agacggacga aagctcgtta tttcgcccac gtctttccct gccgggtttt540gataatatca ggacttcgga gaggagaggc gcagggtcga ggagctggac gcgacgtttt600gctggttgga gtgcttctga acccgcccat gcctcccctt cttcggaaga gaggaaggat660taatttcaat tcatcggcct caattggtag gatacc 69权利要求
1.酵母菌株Pseudozyma rugulosa Y-63 CGMCC No.1247。
2.一种对染料脱色的方法，是利用Pseudozyma rugulosa Y-63 CGMCC No.1247对染料进行原位脱色。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述染料的浓度为50-1000mg/L。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于所述Pseudozyma rugulosa Y-63CGMCC No.1247对染料进行脱色的脱色培养基包括下述质量百分比浓度的成分葡萄糖1％，KH2PO40.1％，(NH4)2SO40.1％，MgSO40.05％，酵母粉0.02％，pH自然，溶剂为水。
5.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于所述Pseudozyma rugulosa Y-63CGMCC No.1247的培养温度为28℃，培养时间为24-48h。
6.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于所述染料包括活性偶氮染料，蒽醌染料，三苯甲烷染料，硫化染料以及依加仑蓝。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述活性偶氮染料为活性艳红K-2BP，酸性媒介黄GG，弱酸艳红B，活性黑KN-B和活性红M-3BE。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述三苯甲烷染料为媒介漂蓝B。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述蒽醌染料为活性艳蓝X-BR和媒介红S-80。
10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述硫化染料为活性翠蓝KN-G；所述依加仑蓝为依加仑蓝FBL。
全文摘要
本发明公开了一株酵母菌及其应用。其目的是提供一株能对染料高效脱色的酵母菌株Pseudozyma rugulosa Y－63 CGMCC No.1247，利用该菌株对染料进行脱色的方法。酵母菌株Pseudozyma rugulosa Y－63 CGMCC No.1247是一株具有极高活力，对染料脱色能力极强的菌株，其培养方法简单，生长速度快，不易变异，可以用作研究酵母对染料脱色机制的模式菌株，更重要的是可以直接用于染料的脱色。该菌株具有在染料废水处理的工业化应用前景。
文档编号C12N1/16GK1654631SQ20051005367
公开日2005年8月17日 申请日期2005年3月10日 优先权日2005年3月10日
发明者文湘华, 余志晟 申请人:清华大学