专利名称：西瓜抗小西葫芦黄花叶病毒基因的连锁分子标记及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种西瓜(Citrullus lanatus(Thunb)Manf.)抗小西葫芦黄花叶病毒基因的连锁分子标记，特别是一种西瓜抗小西葫芦黄花叶病毒基因的连锁的RAPD标记及由该标记转化得到的SCAR(sequence characterizied amplifiedregion)标记及该SCAR标记在检测转育后代植株中的应用。
背景技术：
目前，小西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus，ZYMV)是马铃薯Y病毒属的成员是侵染葫芦科作物的主要病毒，也被证实是危害我国西瓜的主要病毒，在许多国家和地区都有发生，严重影响西瓜的产量和品质，甚至会造成绝产。许勇等(2004年)首次发现对西瓜的3种主要病毒病(ZYMV-CH，PRSV-W，WMV)均具有抗性的西瓜野生种质PI595203，证实PI595203对ZYMV-CH的抗性由隐性单基因zym-CH控制，对WMV的抗性至少由3个以上的隐性基因控制，且这两种病毒的抗病基因相对独立(.Xu，Y.，D.Kang，Z.Shi，H.Shen，and T.Wehner.Inheritance of resistance to zucchini yellow mosaicvirus and watermelon mosaic virus in watermelon.J.Hered.2004.95498-502.)。同时本实验室还发现PI595203对PRSV-W的抗性也是由隐性单基因PRSV-W控制，可能存在微效修饰基因，而且西瓜对PRSV-W和ZYMV-CH的抗性基因呈现连锁关系，但是二者的遗传距离较大为27cM。从以上两个试验结果我们发现要转育PI595203对这3种病毒病的抗病基因，在转育后代中获得兼抗这三种病毒病的植株，就需要有很大的分离群体与较多的选育代数。这充分说明了利用传统育种技术进行西瓜抗病毒病转育工作的艰巨性与复杂性，分子标记辅助选择技术将有可能成为西瓜抗病毒病育种研究的有力武器。
发明内容
在此基础上我们开展西瓜ZYMV-CH基因连锁分子标记的研究，并成功获得了与ZYMV-CH抗病基因连锁的RAPD标记和SCAR标记，以期建立西瓜抗ZYMV-CH分子标记辅助选择技术，为西瓜抗病毒病新品种的选育和抗病基因的克隆奠定基础。
本发明的第一个目的是提供一种与西瓜抗ZYMV-CH基因紧密连锁的RAPD标记。
本发明的第二个目的是提供一种与西瓜抗ZYMV-CH基因紧密连锁的稳定的SCAR标记，以便高通量地应用于育种实践。
为了达到上述的发明目的，本发明采用以下方案西瓜抗小西葫芦黄花叶病毒基因连锁的RAPD标记AK13-644，其核苷配序列是序列表中的SEQ ID No1。
西瓜抗小西葫芦黄花叶病毒基因连锁的SCAR标记SCAK13-644，其核苷配序列是序列表中的SEQ ID No2和SEQ ID No3。
本发明的优点是本发明的RAPD和SCAR标记在西瓜抗病毒病新品种的选育中具有重要作用，本试验通过选择杂种，培育大量转育后代，及植株苗期抗病鉴定技术和RAPD、SCAR标记检测技术相结合。采用兼抗ZYMV-CH，PRSV-W，WMV三种病毒病的西瓜种质，并结合F8代转育植株进行标记验证，突破了常规育种的工作量大，选育周期长的束缚，实现了常规杂交育种与分子标记付诸育种相结合、缩短育种周期的技术路线。
图1是本发明的RAPD引物对亲本，F1，抗感池和F2单株的RAPD-PCR扩增图谱。其中，MLadder DNA；I.PI595203；2.98R；3.F1；4.抗病基因池；5.感病基因池；6-34.F2单株。
图2是本发明的RAPD引物对部分抗ZYMV-CH转育植株和Crimsonsweet，Calhoun gray，PI296341的RAPD扩增结果。其中，MLadder DNA；1.PI595203；2.98R；3.F1；4.抗病基因池；5.感病基因池；6.PI296341；7.Crimsonsweet；8.Calhoun gray；9-32.部分转育植株。
图3是西瓜品种PI595203中标记AK13-644和ZYMV-CH抗性基因的连锁图。
图4是本发明的SCAR引物对亲本，F1，抗感池和F2单株的SCAR-PCR扩增图谱。其中，MLadder DNA；I.PI595203；2.98R；3.F1；4.抗病基因池；5.感病基因池；6-34.F2单株。
具体实施例方式
实验材料抗病亲本PI595203；感病亲本98R；以PI595203×98R作为杂交组合，通过单粒传获得109个F3代株系，每个株系保证60个单株作为抗病鉴定材料。及通过对PI595203×98R杂交后代多次进行抗ZYMV-CH筛选，得到的60个抗病F8单系，作为连锁标记验证材料。
抗病性鉴定采用摩擦接种方法进行苗期抗病性鉴定，鉴定材料包括亲本，F1及109个F3株系的各60个单株，种2-3周后开始观察症状表现，根据症状表现并参照Boyhan(Boyhan G，Norton JD，Jacobsen BJ，Abrahams BR，Evaluation ofwatermelon and relates germplasm for resistance to zucchini yellow mosaic virus.Plant Dis.1992，76251-252)和勤古生(.古勤生，范在丰，李怀方.葫芦科作物病毒名录，中国西瓜甜瓜.2002(1)45-47)的分级标准制定统一的鉴定标准。每隔一周进行一次抗病统计，连续4周。
参照F3株系的抗感分离情况，推测F2代单株的抗性和基因型。根据本实验已有的研究结果已知PI595203对ZYMV-CH的抗性为隐性单基因控制，所以F3代表现纯合抗病的株系推测其F2代单株的基因型为aa；F3代表现纯合感病的株系推测其F2代单株基因型AA；F3代表现抗感分离，且基本符合1∶1分离比例的株系，可推测其F2代单株基因型为杂合型Aa。
RAPD标记的建立RAPD-PCR反应体系包括ddH2O 6.85μL；10*buffer(已含Mg2+)1.25μL；dNTP(2.5mM)1.0μL；Primer(15ng/μL)2.0μL；模板DNA(30ng/μL)2.0μL；TaqE(2.5U/μL)0.4μL，共13.5μL。
RAPD-PCR反应在DNA PTC-100(东胜创新生物技术有限公司)上进行。反应程序如下94℃预变性5min，然后94℃变性30s，37℃退火30s，72℃延伸1min，进行35个循环，在72℃下保温7min，4℃保存，整个反应程序约2.5小时。
采用集团分离分析法(Bulked segregant analysis，BSA)在F2代建立抗感基因池，以亲本，F1和抗感基因池为模板，对640条RAPD引物进行PCR扩增筛选，其中引物AK13在亲本，F1，抗感基因池和109个F2之间扩增出一条多态性片段(644bp)部分结果图1所示其中21个纯合抗病植株上全部表现有这条多态性带；在21个纯合感病植株中有4个表现有带，发生重组；67个杂合体中5个缺失这条带，表现重组。通过JoinMap3.0软件分析所得RAPD标记和ZYMV-CH抗性基因之间的遗传关系，证明了这条带与ZYMV-CH的抗性基因呈现连锁关系，遗传连锁距离为8cM，定名为AK13-644(如图2所示)，并在转育后代自交系中得到验证部分结果见图3标记AK13-644在转育植株上全部表现有带，在Crimson sweet，Calhoun gray和PI296341上表现缺失这条带，说明这个标记在PI595203上存在着与ZYMV-CH抗性基因的稳定连锁关系，可以作为抗病转育的选择标记。
SCAR标记的建立采用博大公司(BioDev，北京)的DNA快速回收纯化体系“玻璃奶法”对RAPD引物扩增的目的条带进行纯化。RAPD(PCR)产物与载体的连接采用Promega公司的PGEM-T easy Vector系统。参照《分子克隆实验指南》中的方法进行重组质粒的转化与筛选。利用碱式裂解法提取重组质粒，采用酶切与PCR进行检测。委托上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序(见序列表SEQ ID No1)及SCAR引物的合成。
SCAR扩增反应体系共25μl，包括ddH2O.6.3μl；10*buffer.2.5μl；dNTP(2.5mM)2.0μl；Primer 1(15ng/μl).1.0μl；Primer 2(15ng/μl).1.0μl；模板DNA(5ng/μl)2.0μl；TaqE(5U/μl).0.2μl。
SCAR扩增的反应程序为94℃预变性5min，94℃预变性1min，不同退火温度(50℃，55℃，60℃，65℃)退火1分钟，72℃延伸2min，35个循环，最后72℃下延伸7min，4℃保存。
根据测序结果，设计的SCA引物5’-TCCCACGAGTCCAGCAGCAAG-3’；5’-TCCCACGAGTACTTTTAGAAGT-3’，进行SCAR-PCR扩增，扩增部分结果如图4所示扩增结果条带清晰稳定，并且与其相对应的RAPD引物扩增结果完全对应，将其命名为SCAK13-644。说明RAPD标记AK13-644成功地转化成为表现扩增条带有无的SCAR标记SCAK13-644(即序列表SEQ IDNo2和SEQ ID No3)。
SCAR标记的应用本发明得到的SCAK13-644在实验过程中已经经过F8代抗ZYMV-CH转育植株的验证，充分证实了该标记与抗病基因的稳定连锁关系，可以直接用作ZYMV-CH抗病基因选择的标记，本发明建立了西瓜抗ZYMV-CH分子标记辅助选择技术系统，为西瓜抗病毒病新品种选育和抗病基因的克隆奠定坚实的基础。
序列表<110>北京市农林科学院<120>西瓜抗小西葫芦黄花叶病毒基因的连锁分子标记及应用<160>3<210>SEQ ID No1<211>644<212>DNA<213>西瓜(Citrullus lanatus(Thunb)Manf.)<400>1tcccacgagt ccagcagcaa ggacataagg caggaggctg ctagcgaaac tctatgcagt60ctcactcttg ctctcactgg acccattggt taaaaccgac gaaccgatcg gaaccgaagc120aagttggttc ggttcttgaa ccaaaaccaa tgtgcaccga ttttcaacga ttttacattt180attgtgaacc gagaacttca atttagttca taagttcagc ccaaaactgg accagaccga240accgaaccgt gcaaatccct aatcttgatt gataattaca agtgatcgta agaactttag300aagcaaacca taggttctta ataaaactct taaacatatt tttgttaaaa tcatttgttg360tcatgtttta aattatttta taatataatt tattcattca gaataatttt gaaattgtat420gaaaattgca tctaaagtat aaaggtaaac gtttaatcaa ttttaaatga aaaaatatat480tttaaaatga ttttaaaaaa caataaaata atgttaacca attcaaaaaa tactctcata540agtctttaat ccaagtttgg tgctcattac tgaaatactt caaccgtcga tccagaaaat600actggggagg taaataatta atacttctaa aagtactcgt ggga 644<210>SEQ ID No2<211>21<212>DNA
<213>西瓜(Citrullus lanatus(Thunb)Manf.)<400>2tcccacgagt ccagcagcaa g 21<210>SEQ ID No3<211>22<212>DNA<213>西瓜(Citrullus lanatus(Thunb)Manf.)<400>3tcccacgagt acttttagaa gt2权利要求
1.一种西瓜抗小西葫芦黄花叶病毒基因连锁的RAPD标记AK13-644，其核苷配序列是序列表中的SEQ ID No1。
2.一种西瓜抗小西葫芦黄花叶病毒基因连锁的SCAR标记SCAK13-644，其核苷配序列是序列表中的SEQ ID No2和SEQ ID No3。
3.权利要求1所述的RAPD标记AK13-644在检测转育后代植株中的应用。
4.权利要求1所述的SCAR标记SCAK13-644在检测转育后代植株中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种西瓜抗小西葫芦黄花叶病毒基因的连锁RAPD标记AK
文档编号C12N15/11GK1730668SQ20051005642
公开日2006年2月8日 申请日期2005年3月21日 优先权日2005年3月21日
发明者许勇, 马少芹, 张海英, 宫国义 申请人:北京市农林科学院