抗mbl单克隆抗体及其应用的制作方法

专利名称：抗mbl单克隆抗体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于单克隆抗体及其应用，具体地说涉及抗人MBL的特异性单克隆抗体，产生所述单克隆抗体的杂交瘤，以及所述单克隆抗体在检测人MBL中应用。
背景技术：
甘露(聚)糖结合凝集素(mannose-binding lectin or mannan-bindinglectin)缩写为MBL，它是由肝脏合成，分泌至血的一种多糖结合蛋白，属C型凝集素家族成员。MBL组成了机体先天免疫的第一道防线，在病原微生物感染早期、特异性抗体形成之前MBL就已经通过其“糖基识别域”结合主要包括细菌、病毒、原生动物和真菌在内的病原微生物，继而与丝氨酸蛋白酶结合，形成MBL相关的丝氨酸蛋白酶(MASP)激活补体或直接介导调理吞噬作用杀灭病原。研究表明MBL的缺损与许多自身免疫病的发生以及出现易受感染状态相关。进一步的阐明MBL与疾病的关系，将MBL应用于疾病的治疗与预防，是免疫研究的新热点。因此，制备MBL的特异性单克隆抗体就成为必不可少的研究基础。目前，检测MBL浓度的方法主要为ELISA法，固相可以是甘露糖，捕获抗原MBL后，加标记的抗体反应，其特异性和灵敏度较差。固相为MBL抗体的国外方法，检测范围小，操作时间长。

发明内容
为了克服已有技术的不足，本发明的目的在于提供一种特异性抗MBL的单克隆抗体。
本发明的另一目的是提供一种产生特异性抗MBL的单克隆抗体的杂交瘤细胞系。
本发明的另一目的是提供一种测定MBL的、有较好特异性和灵敏度及检测范围广和操作简便的方法。
本发明的另一目的是提供一种特异性检测MBL的试剂盒。
本发明人经过大量的研究探索，研究出一种免疫球蛋白，它是可特异性与MBL结合的单克隆抗体，利用该单克隆抗体与MBL的特异性结合，可以有效检测MBL。本发明选用了两不同结合位点的单抗建立检测方法，选用HRP标记抗体，该方法特异性和灵敏度好，且检测范围广、操作时间短。
本发明提供一种免疫球蛋白，它是特异性抗MBL的单克隆抗体。
本发明提供一种产生特异性抗MBL的单克隆抗体的杂交瘤细胞系。
本发明的单克隆抗体识别MBL作为抗原，可通过本发明的杂交瘤产生。
本发明的杂交瘤产生识别MBL作为抗原的单克隆抗体，可通过经MBL免疫的动物的脾细胞或淋巴结细胞与骨髓瘤细胞融合获得。
本发明的杂交瘤可以用本领域常规或已知的细胞融合技术产生。可以用MBL作为免疫原，免疫除了人以外的动物，将该动物的脾细胞或淋巴结细胞与骨髓瘤细胞融合，产生杂交瘤，从其中选出产生识别MBL的单克隆抗体的杂交瘤，即可得到本发明的杂交瘤。
所述免疫原可以是MBL或任何含有MBL的免疫原，例如含有人MBL的血液、肝脏组织或从含有人MBL的血液、肝脏组织中提取纯化的MBL，也可以是通过基因重组技术合成的MBL。
所述的免疫可用本领域已知或常规的任何方法来免疫。所述动物可以是山羊，绵羊，豚鼠、小鼠、大鼠和家兔，优选小鼠。
所述脾细胞或淋巴结细胞的分离可以按照已知或常规的方法进行。所述的融合可以是本领域已知或常规的细胞融合技术。杂交瘤的筛选可以按照已知或常规的方法进行。
本发明杂交瘤细胞也可以按照以下方法得到将小鼠，用含有MBL的免疫原，在三脚掌和皮下常规免疫，3至4周后重复免疫，2周后尾静脉加强免疫一次，3至4天后取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按常规方法融合杂交瘤细胞以有限稀释法克隆化；挑选出高滴度杂交瘤细胞。
本发明的单克隆抗体可通过本发明的杂交瘤产生。从本发明的杂交瘤产生本发明的单克隆抗体的方法可以是本领域常规或已知的方法，例如可以从培养本发明的杂交瘤的组织培养液中获得，也可以通过接种到小鼠体内繁殖、从收集的腹水或血清中分离获得。所述培养本发明的杂交瘤可以按照本领域常规或已知的方法进行。所述接种、收集腹水或血清、从腹水或血清中分离本发明的单克隆抗体的方法可以是本领域常规或已知的方法。
本发明提供的检测MBL的方法是免疫测定法，其使用本发明的单克隆抗体，通过本发明单克隆抗体特异性地与MBL结合，来检测MBL。
本发明的免疫测定法包括本领域已知的免疫测定方法，例如酶免疫测定法(EIA)、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、放射免疫测定法(RIA)、荧光免疫测定法(FIA)等。
用于所述免疫酶技术中的酶可以是本领域常规或已知的酶，例如过氧化物酶、碱性磷酸酯酶、β-D-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶等。所述酶可与本发明的单克隆抗体或MBL结合形成酶标物。在所述免疫酶技术中与酶标物作用并显色的底物可以是本领域常规或已知的底物。所述放免法中的标记放射核素可以是本领域常规或已知的放射核素，例如131I、125I、14C、3H等。所述荧光免疫法中的荧光物质是本领域常规或已知的荧光物质。
单克隆的杂交瘤细胞产生抗体只针对抗原的一个表位，选择针对不同表位的单克隆抗体运用“双抗夹心法”建立定量测定抗原含量的ELISA法，是本发明优选的酶联定量检测法。
本发明提供的检测MBL的方法是免疫测定法，使用两株不同的本发明的单克隆抗体，通过本发明单克隆抗体特异性地与MBL结合，来检测MBL。所述两株不同的本发明单克隆抗体具有不同的结合表位，其中的一个用作包被抗体，一个用作酶标记的抗体。
本发明提供的检测MBL的方法是免疫测定法，包括(1)包被第一本发明单克隆抗体；(2)与待测样品反应结合；(3)加入酶标记的第二本发明单克隆抗体；(4)显色，测量；其中所述第一本发明单克隆抗体与第二本发明单克隆抗体具有不同的结合表位。所述酶优选为辣根过氧化物酶。
本发明提供一种检测MBL的试剂盒，其含有两种具有不同结合表位的本发明单克隆抗体免疫球蛋白或其活性片段。
所述试剂盒还可含有标记MBL或本发明单克隆抗体的标记物。所述标记物可含有可标记MBL或本发明单克隆抗体的酶、放射核素、荧光物质或其他物质。可以按照本领域的常规或已知方法形成含MBL或本发明单克隆抗体的标记物。所述含有MBL的标记物可与本发明的免疫球蛋白单克隆抗体特异性地结合。所述含有本发明单克隆抗体的标记物可与MBL特异性地结合。
所述试剂盒还可包括有固定MBL或本发明单克隆抗体的固相。所述固相可以是本领域通常使用的或已知的、适用于本发明方法的固相，例如聚合物，如聚苯乙烯，微量滴定板，免疫层析用滤纸等。
所述试剂盒还可包括为实施本发明的免疫测定法所需的其他常规物质和/或器具。
本发明的方法可有效检测MBL，并有很好的特异性和灵敏度。
实验证明，本发明的单抗ELISA法，与多抗法相比，具有特异性强，灵敏度高等优点。可用于产品的质量控制试验。
本发明采用两株不同的单抗，在检测方法操作时在加HRP标记抗体后不需要象已有技术那样再加HRP结合的链亲和素来放大反应，而只须加HRP显色底物就可显色读数，减少了操作步骤，节省了检测时间。已有方法的检测范围是0～40ng/ml，对于许多MBL含量高的样本须二次稀释，本方法检测范围是0～100ng/ml，只一次稀释便可涵盖绝大多数样本的MBL值。因此本发明的方法有检测范围广，操作时间短等显著优点。


图1是纯化后本发明单克隆抗体的电泳图。
图2是酶标抗体浓度的选择，横坐标是酶标抗体稀释度，纵坐标是OD值。
图3是包被抗体浓度的选择，横坐标是包被浓度，纵坐标是OD值。
图4是不同含量MBL的ELISA测定结果，横坐标是MBL的浓度(ng/ml)，纵坐标是OD值。
图5是本发明单抗ELISA方法的灵敏度和线性测定结果，横坐标是MBL的浓度(ng/ml)，纵坐标是OD值。
图6是本发明与国外试剂盒检测结果的比较，横坐标是样品编号，纵坐标是MBL的浓度(微克/ml)。
具体实施例方式
下面将通过实施例对本发明作进一步的描述，这些描述并不是要对本发明内容作进一步的限定。本领域的技术人员应理解，对本发明内容的技术特征所做的等同替换，或相应的改进，仍属于本发明的保护范围之内。
实施例1抗MBL杂交瘤细胞的建立免疫8-12周龄的雌性BALB/c小鼠，以每只20μg MBL(由张家口医学院提供，自健康中国人血浆中纯化)的量，在三脚掌和皮下常规免疫，3～4周后重复免疫，2周后尾静脉加强免疫一次。
融合从最后一次加强免疫3天后的小鼠取脾细胞，与骨髓瘤细胞(中国药品生物制品检定所细胞室提供)以5∶1的比例混合，用50％PEG液融合。在HAT培养液中37℃5％CO2培养。
杂交瘤细胞的检测与选择性培养培养3-4天后用HAT培养液半量换液，直到细胞生长至1/3-1/2孔时进行检测，包被抗原MBL，取杂交瘤上清(一抗)与抗原共同孵育，洗涤去除未结合的抗体，加酶标羊抗鼠二抗，显色反应阳性(OD值，即吸光度值，与阴性对照比大于2)为待选克隆。第一次克隆后换HT培养液，第二次克隆后换DMEM培养液培养。
杂交瘤细胞以有限稀释法克隆化将96孔板中待克隆的杂交瘤细胞用培养液洗下，计数并稀释至20个细胞/ml，每孔0.1ml接种96孔板，经3次对倍稀释即每孔含0.5个细胞，37℃5％CO2培养。3-5天后有细胞生长的孔补加培养液继续培养，肉眼可见细胞克隆时，进行抗体检测，此时克隆为100％阳性，可建株。
共挑选出2株高滴度杂交瘤细胞。
实施例2单克隆抗体的制备和纯化接种取8周龄雌性BALB/c小鼠，腹腔注射无菌石蜡油0.5ml/只，5天后分别接种2×107/ml由实施例1所得杂交瘤细胞。出现较多腹水后收集，可多次收集。
正辛酸沉淀法提纯单抗用4倍体积的醋酸缓冲液(冰醋酸1.8ml+500ml蒸馏水)稀释收集到的腹水，用0.1N NaOH调pH4.5。搅拌下，每ml稀释后的样品缓慢加入25μl正辛酸。放置30分钟后，室温10000rpm离心30分钟。过滤上清，除去细渣。加10倍浓缩的PBS(9份样品+1份10×PBS)，用5N NaOH调pH7.4。上清冷却至4℃，45％饱和硫酸铵沉淀(0.277g/ml)，搅拌30分钟，4℃，5000rpm离心1 5分钟。用少量PBS溶解沉淀，用50～100倍体积的PBS透析过夜，4℃。透析后样品加0.1％硫柳汞，4℃保存，即分别得到单克隆抗体B3和B10。
蛋白A层析柱法纯化单抗HiTrap rProtein A FF(Amersham Biosciences)装柱后用5倍以上柱体积的结合缓冲液(1.5M甘氨酸，3MNaCl，pH8.9)洗柱平衡，经辛酸沉淀提取后的单抗样品用注射器上样，10倍柱体积的结合缓冲液洗柱，流速1ml/min，5倍柱体积的洗脱液(0.1M柠檬酸盐缓冲液，pH5)洗柱，监测收集蛋白峰。SDS-PAGE鉴定纯度。
标记HRP(辣根过氧化物酶)将上述步骤所得纯化抗体8-10mg装入透析袋，用0.01M pH9.6的碳酸盐缓冲液4℃透析过夜。取HRP 4mg，溶于1ml的纯水中，缓慢加入0.1M NaIO40.1ml，室温下避光搅拌20分钟，装入透析袋，用0.001M pH4.4的醋酸盐缓冲液4℃透析过夜。向HRP中加入0.2M的Na2CO30.05ml调pH至9.6，然后与抗体混合，避光搅拌2小时。加入4mg/ml的NaBH40.1ml，4℃静置2小时，4℃PBS透析过夜。加入等体积的饱和硫酸铵，搅拌30分钟，4℃静置2小时，3000rpm离心20分钟，弃上清。所得沉淀再用50％的饱和硫酸铵重复前述操作一遍。所得沉淀溶于1ml PBS中，4℃PBS透析48小时。得酶标单克隆抗体HRP-B3和HRP-B10。
酶标抗体效价的测定已包被纯化抗原的反应板，将酶标抗体做系列稀释，37℃反应1小时后显色，判定酶标抗体效价，其结果为HRP-B3为1∶8000、HRP-B10为1∶2000。
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳配制5.5％分离胶和5％浓缩胶，灌制凝胶，另配制电泳缓冲液(25mM Tris-Cl，250mM甘氨酸，0.1％SDS)。将样品悬于SDS-PAGE加样缓冲液，煮沸5min，12000rpm离心1min后上样，上样体积为20μl/孔。电泳时，样品位于浓缩胶时电压设为70V，样品进入分离胶后电压设为100V，待溴酚兰到达分离胶底部时停止电泳。将凝胶浸泡于考马斯亮蓝R-250染液中染色2-3小时后，用含20％乙醇和10％冰醋酸的脱色液脱色直至背景无色后观察。
根据分子量标准，计算出两株单抗的分子量，通过凝胶成像分析得出单抗的纯度，结果见下表，单抗电泳图谱见图1。结果表明本发明单克隆抗体的纯度可用于制备体外诊断试剂。
表1单抗的纯度

注上样量20μg实施例3单克隆抗体的特性鉴定将人血白蛋白和经检测MBL缺失的人血清作为抗原分别与酶标单克隆抗体HRP-B3和HRP-B10进行直接反应，以从人血浆中纯化的MBL样品和Antisody shop公司的MBL为阳性对照，观察单抗与其他抗原的交叉反应。
四种抗原分别加入两种酶标记的单抗，37℃反应1小时后显色，测OD值，结果见表2。结果表明本发明的两株单抗的特异性好。
表2本发明单抗与其他的交叉反应

实施例4单克隆抗体表位测定采用阻断抑制法进行本发明单抗的表位测定。
100μl/孔包被抗原MBL(2.5μg/ml)；首先加入未标记抗体100μl/孔(1mg/ml)结合抗原，1小时后每一种未标记抗体加入两种的酶标抗体(1∶800)，竞争结合抗原，以相同的酶标抗体做阻断阳性对照；无关酶标抗体(抗人血白蛋白)做阻断阴性对照，ELISA法显色测OD值。因为加入的抗体浓度足够大，可以完全饱和结合其对应的抗原结合位点，所以如果两单抗间的抗原结合表位相同，则抗原结合位点先被未标记抗体完全封闭，加酶标抗体后不显色，反之，两单抗间的抗原结合表位不同，加酶标抗体后会显色。计算阻断抑制率(OD待检单抗—OD阻断阳性对照)/(OD阻断阴性对照—OD阻断阳性对照)结果见表3和表4，结果表明两单抗间的抗原结合表位不同。
表3

表4

实施例5单克隆抗体Ig亚类测定包被纯化的MBL抗原，加入克隆培养的细胞上清，加Ig亚类标准抗血清，加抗鼠抗体的酶标抗体，显色测OD值。OD值最高孔(＞0.8)为阳性孔。结果见下表5。结果表明本发明的两株单抗均为IgG1亚类的免疫球蛋白。
表5

实施6单抗的ELISA方法建立根据实施例4竞争结合实验结果，选择抗体表位不同的两株单抗配伍，来建立一种本发明的测定方法之一“双抗夹心”法。
酶标抗体浓度由图2可见，随MBL包被量增加OD值也增加，当酶标抗体浓度达到1∶500时，酶标抗体浓度增加而OD值基本不再增加，可认为酶标抗体浓度达到饱和，故选1∶500为酶标抗体的工作浓度。
包被抗体浓度由图3可见，当包被抗体浓度为8μg/ml时，夹心法所测OD值最高，故选包被抗体浓度为8μg/ml。
用双抗夹心ELISA法挑选抗体以浓度为10ng/ml的MBL为检测抗原，包被不同抗体和酶标抗体，选择出B10和HRP-B3配对。包被抗体8μg/ml，酶标抗体1∶500浓度。
用本发明单克隆抗B10和酶标本发明单克隆抗体HRP-B3建立了双抗夹心ELISA法。
包被液为pH9.6碳酸盐缓冲液，洗涤液为pH7.4 PBS-Tween20，酶标抗体稀释液为1％牛血清白蛋白、pH7.4 PBS-Tween20，底物溶解液为柠檬酸0.47g和磷酸氢二钠(Na2HPO4.12H2O)1.8g的100ml水溶液。底物溶液为邻苯二胺2mg溶于底物溶解液5ml并加30％过氧化氢3μl的溶液。终止液为2mol/硫酸。
(1)将包被实施2所得本发明抗体B10稀释至5μg/ml后，每孔100μl包被聚苯乙烯微量反应板，4℃过夜，洗涤液洗涤，拍干。或取包被好的反应板，用洗涤液洗涤3遍，拍干。
(2)MBL标准品稀释不同浓度作为标准曲线(取标准品用1％牛血清白蛋白—PBS溶液稀释为下列浓度100ng/ml、50ng/ml、20ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、2ng/ml、1ng/ml)，每孔100μl加入反应板；待测样品稀释100倍后也加入不同的孔中，以为1％牛血清白蛋白—PBS溶液阴性对照，37℃1小时，洗涤液洗涤3遍，拍干。
(3)各孔加实施例2所得酶标抗体HRP-B3 100μl，37℃1小时，洗涤液洗涤3遍，拍干。
(4)加入底物溶液每孔100μl，37℃显色30min，加2mol/L硫酸每孔50ul终止反应。
(5)3分钟之内490nm测OD值。
根据测得样品的OD值与标准品浓度绘制标准曲线，得出直线回归方程。代入待测样品的OD值即可得到MBL的含量。
实施7 ELISA方法及其试剂盒的性能根据前面本发明的方法制得的本发明试剂盒，由人血浆中提取的MBL免疫动物获得本发明单克隆抗体制成的包被抗体和酶标抗体及其他试剂制成，供本发明的ELISA法测定MBL含量。
按照最大结合测定本发明的ELISA方法的最佳包被和酶标抗体浓度，结果如图2和图3，由上述结果可看出，包被抗体MBL最佳浓度为8μg/ml，酶标抗体最佳稀释度1∶500。
检测范围由图4可见，随MBL浓度增加，OD值也增加，当检测MBL浓度范围在1-100ng/ml时，用建立的夹心法所测吸光度与MBL的浓度呈正比。按前述实验确定的试剂及浓度做不同含量MBL的ELISA测定，结果见图4。
从图中结果可见，当MBL含量在1-100ng/ml的范围内，浓度与OD值呈正相关(R＝0.997)，可以直接用于检测。
特异性按前述实验确定的双抗夹心法测定与几种其他血清物质的反应，观察反应特异性。包被抗体B10 7μg/ml，人血清白蛋白和牛血清白蛋白100ng/ml，MBL缺失的血清样本(1∶100稀释)5份，阳性对照MBL纯品100ng/ml，酶标抗体HRP-B3(1∶5000稀释)，显色后，判定结果，见表6。
表6

判定标准OD值与阴性对照(加PBS)比较，相差不超过阴性对照的3倍SD.为阴性，反之为阳性。
酶标抗体稀释度1∶500。阴性对照为生理盐水，以MBL做标准曲线。实验结果表明本发明的双抗夹心法有很好的特异性。
灵敏度根据前述确立的实验方法，进行参考品的检测，结果见图5。检出低限为1ng/ml，其条件满足OD值＞空白对照OD值的3倍SD且OD值＞2倍空白对照OD值。说明本发明的方法有很好的灵敏度。
重复性对一个样本重复检测，4次中同次同一板内8个结果的cv值均小于8％，不同次不同人操作4个结果平均值的cv值为1.83％，均小于10％，可见重复性良好，见表7。
表7 不同次每次8孔检测结果

由表7可见，按照本发明方法的试剂盒测定MBL重复性较好。
实施例8本发明与国外试剂盒标准比较1)标准品比较用国外丹麦AntibodyShop公司(MBL Oligomer ELISA KIT)的试剂盒的标准品按本研究的试验条件检测，其中标准曲线范围为0-50ng/ml，可见误差较小，见表8。由此证实本试验体系的结果与国外试剂盒结果具有可比性。
表8

2)实际检测样品的比较运用本发明的方法和国外试剂盒方法同时对52例健康人血清样本进行检测，两方法所得结果基本符合，但当MBL含量较高时，用本发明方法所得结果要略高于国外试剂盒方法所得结果。检测范围大也正是本发明方法的优势。结果见图6。由于国外试剂盒操作时在加生物素标记抗体后必须再加HRP结合的链亲和素来放大反应，而本方法只须加HRP标记的抗体后就可显色读数，减少了操作步骤，节省了检测时间。国外方法的检测范围是0～40ng/ml，对于许多MBL含量高的样本须二次稀释，本方法检测范围是0～100ng/ml，只一次稀释便可涵盖绝大多数样本的MBL值。因此，本发明的方法和试剂盒特异性强，灵敏度高，检测范围大。
实施例9本发明单抗法测出的MBL对本发明单抗法检测出的物质进行检测，证明本发明方法检测出的物质是MBL。
权利要求
1.一种单克隆抗体，其特异性识别甘露聚糖结合凝集素MBL作为抗原，并具有不同的结合表位。
2.一种杂交瘤细胞系，其产生权利要求1所述的单克隆抗体。
3.一种免疫测定法，其特征在于，该方法是用两种识别甘露聚糖结合凝集素MBL作为抗原的单克隆抗体进行的，所述两种单克隆抗体具有不同的结合表位。
4.根据权利要求书3所述的免疫测定法，其中所述两种单克隆抗体中的一个用作包被抗体，一个用作标记的抗体。
5.一种免疫测定法，包括(1)包被第一识别甘露聚糖结合凝集素MBL作为抗原的单克隆抗体；(2)与待测样品反应结合；(3)加入标记的第二识别甘露聚糖结合凝集素MBL作为抗原的单克隆抗体；(4)显色，测量；其中所述第一单克隆抗体与第二单克隆抗体具有不同的结合表位。
6.一种试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有两种具有不同结合表位的识别甘露聚糖结合凝集素MBL作为抗原的单克隆抗体免疫球蛋白或其活性片段。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒采用ELISA技术。
8.权利要求6所述的试剂盒在测定甘露聚糖结合凝集素MBL中的应用。
9.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于所述两种单克隆抗体中的一个用作包被抗体，一个用作标记的抗体。
全文摘要
本发明涉及一种抗甘露聚糖结合凝集素MBL的特异性单克隆抗体，产生所述单克隆抗体的杂交瘤，所述单克隆抗体在检测甘露聚糖结合凝集素MBL中应用，以及特异性检测甘露聚糖结合凝集素MBL的免疫测定法及试剂盒。所述免疫测定法及可采用ELISA技术进行。本发明具有特异性强、灵敏度高、检测范围广等优点。
文档编号C12N5/16GK1837238SQ200510056850
公开日2006年9月27日 申请日期2005年3月25日 优先权日2005年3月25日
发明者张庶民, 骆鹏, 贾天军 申请人:中国药品生物制品检定所