专利名称：基于异柠檬酸裂合酶的药物筛选细胞模型及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于医药生物技术领域，涉及一种基于异柠檬酸裂合酶的药物筛选细胞模型及其用途。
背景技术：
异柠檬酸裂合酶(isocitrate lyase，ICL，EC 4.1.3.1)催化异柠檬酸裂解成琥珀酸和乙醛酸。它和苹果酸合酶(催化乙醛酸和乙酰辅酶A缩合生成苹果酸)以及三羧酸循环中的部分反应共同组成乙醛酸循环。在乙醛酸循环中ICL位于异柠檬酸的下游，通过催化异柠檬酸生成乙醛酸和琥珀酸，改变碳源的流向，使其进入乙醛酸循环，以绕过三羧酸循环中的两个脱碳酸基步骤，生成草酰乙酸和琥珀酸，前者可利用糖异生途径形成葡萄糖并进一步生成蛋白质和核酸，后者则可补充三羧酸循环的一些中间产物。
乙醛酸循环广泛存在于微生物中，它在微生物致病过程中起着重要作用，由于哺乳动物缺乏乙醛酸循环，该循环的关键代谢酶——异柠檬酸裂合酶可作为潜在的药物靶标。检索GenBank发现细菌和真菌ICL的基因在大小上有较大的区别。细菌ICL的基因在1300bp左右，真菌ICL的基因在1600bp左右。大肠杆菌(Escherichia coli)ICL的基因aceA和苹果酸合酶基因aceB，以及乙醛酸循环的调节酶(异柠檬酸脱氢酶激酶/磷酸酶)基因aceK组成乙醛酸循环操纵子aceBAK。
在分枝杆菌中，发现有两个编码ICL的可读框(ORF)aceA和icl。后者与谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)和束红球菌(Rhodococcus fascians)ICL的基因有很高的同源性。结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)H37Rv的aceA包含有两个基因aceAa(Rv1915)和aceAb(Rv1916)，在Sanger中心的数据库中这两个基因有一个碱基是重叠的，即aceAa的3′端碱基是aceAb的5′端碱基，但是结核分枝杆菌CSU93和麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)的aceA却只含有一个基因，这种结构上的不同直接导致了基因在不同生物体中功能上的差异。研究发现在相同条件下，CSU93的aceA和icl均表达，H37Rv则只有icl表达，同时H37RvaceA重组体的高Km和低Vmax则暗示其在H37Rv中扮演了一个从属于icl的角色。
ICL在致病过程中的表达和活性变化结核分枝杆菌在侵染宿主过程中，其ICL基因的mRNA量会大幅上调；体外研究发现，结核分枝杆菌与巨噬细胞作用以后，会诱导ICL的表达。该基因的缺失突变株在感染小鼠时，刚开始还能正常生长和繁殖，细胞免疫启动后，病菌会被迅速清除。上述结果说明(1)病菌与巨噬细胞的相互作用可诱导ICL表达；(2)ICL对病菌在激活的免疫系统下的生长和繁殖至关重要；(3)ICL与结核分枝杆菌的致病联系密切。
Lorenz等用Northern印迹分析发现，白色假丝酵母(Candida albican)在被巨噬细胞吞噬后，ICL基因的表达被诱导，其ICL缺失株无法在以乙酸为唯一碳源的培养基上生长，它对小鼠的毒力明显下降。其结果和结核分枝杆菌一致，同时在植物致病菌中也发现了类似情况。这进一步证明广泛存在于微生物体内的乙醛酸循环在微生物的致病过程中起着重要的作用。但是有人在新生隐球菌(Cryptococcus neoformans)的研究中发现，其ICL基因缺失株的毒力没有任何减弱，仍然能够致病，尽管该基因在致病过程中会被诱导表达。这说明该菌还有其他基因可能代偿性互补ICL的活性。
ICL及乙醛酸循环在微生物致病中起重要作用，致病菌在感染人体的初期会被巨噬细胞吞噬形成吞噬体，后者极度缺乏葡萄糖和氨基酸等必要的营养源，加之各种各样的抗菌物质和低pH环境等一系列不利因素使得生存和繁殖成为致病菌在这一时期首先要解决的问题。然而大多数致病菌都能顺利渡过该难关，是什么物质为致病菌的生长和繁殖提供了营养？在众多物质中，脂肪酸成为唯一的可能，这正是乙醛酸循环的碳源之一。脂肪酸通过β氧化形成乙酰辅酶A进入乙醛酸循环，生成草酰乙酸和琥珀酸，前者可通过糖异生途径生成葡萄糖并进一步生成蛋白质和核酸，后者则可补充三羧酸循环的一些中间产物，这为致病微生物的生长和繁殖提供了有利条件。ICL是乙醛酸循环中的关键酶，它的缺失将直接阻断乙醛酸循环，从而导致致病微生物能量代谢途径的瘫痪，使得致病菌无法在宿主体内生存。
综上所述，在微生物致病过程中ICL会被诱导表达，该基因的缺失可导致结核分枝杆菌和白色假丝酵母毒力减弱，所以ICL与微生物致病关系密切。乙醛酸循环作为三羧酸循环的回补途径，其作用是替代三羧酸循环在微生物致病过程中为其提供能量、葡萄糖，蛋白质和核酸等物质。ICL作为乙醛酸循环中的第一个关键酶，它的表达量以及活性的高低直接影响到乙醛酸循环及其相关产物的生成，并最终影响到致病微生物对宿主的感染和致病。
传统药物主要作用于致病菌生长和繁殖过程中的某个关键酶或基因，但是对生长较缓慢或不生长的病菌效果不明显，同时病菌的耐药性日趋严重，因此寻找新的药物作用靶标，开发新的抗菌药物迫在眉睫。
发明内容
本发明的目的在于提供，1.一种基于异柠檬酸裂合酶的药物筛选细胞模型；2.一种利用异柠檬酸裂合酶的药物筛选细胞模型进行药物筛选的方法。
技术方案和发明内容实现上述目的的基本技术路线为总体技术方案是克隆包括大肠杆菌、结核分枝杆菌、白色假丝酵母、马红球菌的异柠檬酸裂合酶的编码基因，利用合适的载体和限制性内切酶片段，构建转化载体，将异柠檬酸裂合酶基因克隆到合适的宿主细胞，包括但不限于大肠杆菌、酵母、CHO细胞、昆虫细胞等。
1.基因模板提取将待克隆异柠檬酸裂合酶基因的菌株在LB培养基或YE培养基培养到合适的菌体浓度，按照本领域一般技术人员熟悉的步骤、试剂和方法提取菌体DNA，作为基因扩增的模板。
2.异柠檬酸裂合酶基因的克隆根据出发菌株的碱基特征和异柠檬酸裂合酶基因的保守序列，设计引物，按照本领域一般技术人员熟悉的步骤、试剂和方法，通过PCR扩增异柠檬酸裂合酶基因。
3.转化载体的构建、转化和转化子筛选按照本领域一般技术人员熟悉的步骤、试剂、完全可以从商业途径获得的载体、限制性内切酶和方法，将目标基因克隆到载体，转化宿主细胞，筛选转化子。
发明效果利用本技术方案涉及的方法，构建了基于异柠檬酸裂合酶的药物筛选细胞模型，并筛选到了阳性分子。
具体实施例方式
实施例1.菌株及其培养宿主菌采用E.coli JM 109，质粒采用PQE 30，异柠檬酸裂合酶基因的模板来自结核分枝杆菌。
2.载体构建和转化宿主细胞分别用限制性内切酶Bam HI和Hind III双酶切PCR克隆获得的异柠檬酸裂合酶基因和空载体PQE30。
3.转化子的异柠檬酸裂合酶活性检测原理异柠檬酸被ICL催化生成乙醛酸和琥珀酸，其中乙醛酸和盐酸苯肼形成苯腙在324nm下有吸收峰。反应体系中光吸收值的变化速率可以反应乙醛酸含量的变化，因而间接的反应ICL的活力。反应体系中加入待测样品之后，通过ICL的活力的变化筛选出对ICL活性有影响的化合物。测得酶活为16.2U/mg。
4.抑制筛选采用酶联免疫方法和酶标仪，分别设定阳性对照溴丙酮酸和阴性对照，通过酶活性检测，判定是否为异柠檬酸裂合酶的抑制剂。
权利要求
1.一种基于异柠檬酸裂合酶的药物筛选细胞模型，其特征是将相应微生物的异柠檬酸裂合酶基因的克隆到合适的宿主细胞，构建含有异柠檬酸裂合酶的基因工程细胞模型。
2.权利要求1所述的基于异柠檬酸裂合酶的药物筛选细胞模型，其特征在于异柠檬酸裂合酶包括来自细菌、真菌和放线菌的异柠檬酸裂合酶。
3.权利要求1所述的基于异柠檬酸裂合酶的药物筛选细胞模型，其特征在于异柠檬酸裂合酶是来自结核分枝杆菌、白色假丝酵母的异柠檬酸裂合酶。
4.权利要求2所述的基于异柠檬酸裂合酶的药物筛选细胞模型，其特征在于细菌包括大肠杆菌。
5.权利要求1所述的基于异柠檬酸裂合酶的药物筛选细胞模型，其特征在于宿主细胞包括但不限于细菌、真菌、哺乳动物细胞或昆虫细胞。
6.一种基于异柠檬酸裂合酶的药物筛选细胞模型的用途，该模型用于筛选异柠檬酸裂合酶的抑制剂。
全文摘要
本发明涉及一种基于异柠檬酸裂合酶的药物筛选细胞模型及其用途，其特征是将相应微生物的异柠檬酸裂合酶基因的克隆到合适的宿主细胞，构建含有异柠檬酸裂合酶的基因工程细胞模型并用模型筛选异柠檬酸裂合酶的抑制剂。尤其是利用结核分枝杆菌和假丝酵母的异柠檬酸裂合酶构建的药物筛选细胞明显及其用途。
文档编号C12Q1/02GK1821422SQ20051005745
公开日2006年8月23日 申请日期2005年12月21日 优先权日2005年12月21日
发明者胡昌华, 谢建平, 柏冰 申请人:西南大学