一种磁性微球分离纯化纳豆激酶的方法

文档序号:553861阅读:195来源:国知局
专利名称:一种磁性微球分离纯化纳豆激酶的方法
技术领域
本发明涉及生物活性物质分离技术领域,特别涉及一种采用磁性微球从发酵液中分离纯化纳豆激酶的方法。
背景技术
由血栓及动脉硬化引起的心血管系统疾病严重威胁着人类的生命与健康,其发病率和死亡率居各种疾病之首。溶解血栓是治疗这类疾病的主要方法。纳豆激酶由于具有高效的溶栓能力、无任何毒副、成本低及可由细菌发酵生产等优点,是一种潜在的新型口服溶栓药物。
目前,纳豆激酶的分离纯化工艺常采用传统的蛋白质纯化方法,如盐析、凝胶色谱、疏水色谱、离子交换色谱等纯化方法。Nakaniski K等(参见美国专利US 5,750,650)从发酵液中提取纳豆激酶时,采用无水乙醇沉淀、Butyl Sepharose柱层析、脱盐浓缩后过阴离子交换柱(Mono-Q),洗脱液再上疏水层析柱(AlkylSepharose)得到纳豆激酶产品。Fujita等(参见Biochemical and BiophysicalResearch Communications,1993,1971340-1347)用生理盐水从纳豆的发酵液中提取纳豆激酶粗酶,硫酸铵沉淀杂蛋白,离心除去杂质,上清液经疏水色谱柱(butyl-toyopearl)吸附,收集活性峰再次进行饱和度分别为25%和60%的硫酸铵沉淀,然后上阳离子交换柱(CM-toyopearl)和分子筛层析(Sephadex G-50)收集到活性成份并透析过夜。该工艺操作复杂,收率低,最终获得的产品很少。一种以离子交换为主要手段分离纯化纳豆激酶的方法(参见中国发明专利200410025769.5),其工艺包括硫酸氨分级沉淀、凝胶层析过滤和离子交换层析等分离过程,整个操作长达10小时。专利(参见中国发明专利02116667.6)和专利(参见中国发明专利00107589.6)采用的也是相类似的纳豆激酶分离纯化方法。传统的纳豆激酶分离纯化工艺存在步骤多,周期长,生产成本高和不适应于大规模生产等缺点。
磁性高分子微球是由磁性的内核和核外包裹的高分子两部分组成,高分子外壳的功能基团可使磁性高分子微球与特定的生物活性物质偶联,这些生物活性物质可在反应介质中进一步识别相应的目标生物分子,在外加磁场的作用下,可从复杂的体系中快速地分离。到目前为止,还没有关于采用磁性微球分离纯化纳豆激酶的报道。
本发明利用磁性微球简便、快速的分离优势,提出了一种采用磁性微球直接从发酵液中分离纯化纳豆激酶的方法。

发明内容
本发明的目的在于解决纳豆激酶分离工艺复杂、步骤繁多等问题,提供了一种操作简单、生产成本低、周期短且易于规模化生产的纳豆激酶分离纯化方法。
本发明提供的磁性微球分离纯化纳豆激酶的方法,其实施方案如下1.纳豆激酶发酵液的制备从固体培养基上挑取纳豆激酶的单菌落接入20-100mL的种子培养基中,摇床中培养12-24h,按2%-6%接种量接入发酵液体培养基中,在25-37℃下发酵罐培养24-48h。液体发酵结束后,通过离心除去菌体,得到纳豆激酶发酵液。
2.亲和配基在磁性微球上的固定化将自制的磁性高分子微球进行表面功能化修饰得到表面含有环氧功能基团的磁性微球。在50-80℃条件下,以氢氧化钠为催化剂,进行亲和配基的固定化反应,获得表面含有亲和配基的磁性微球。
3.采用磁性微球从发酵液中分离纳豆激酶将表面含有亲和配基的磁性微球加入到纳豆激酶的发酵液中,在室温下缓慢搅拌充分混合30-60分钟,使纳豆激酶特异性地吸附在磁性微球表面。采用磁铁将吸附有纳豆激酶的磁性微球从发酵液中分离出来,用缓冲溶液清洗一次去除杂质,再用解析液进行解析,收集到纳豆激酶的洗脱液,洗脱液保存在0-10℃条件下。采用纤维蛋白水解法测定分离后纳豆激酶的活力,并据此计算酶活力的回收率。纯化因子等于磁性分离后纳豆激酶的比活力同发酵液的比活力的比值。
上述发酵液体培养基中的氮源可以是大豆蛋白水解物、牛肉膏、玉米浆、酵母浸膏中的一种或几种;碳原可以是麦芽糖、葡萄糖、淀粉糖浆、木糖中的一种或几种;无机盐可以是氯化钙、硫酸镁、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾的一种或几种。
上述自制的磁性高分子微球可以是磁性聚甲基丙烯酸甲酯微球和磁性聚乙烯醇微球。
上述亲和配基可以是氨基苯甲脒和氨基苯基硼酸。
上述缓冲溶液可以是磷酸盐、Tris-HCl、甘氨酸-氢氧化钠中的一种。
上述解析液可以是甘氨酸-盐酸(pH 3.3)和醋酸氨(pH 3.0)。
本发明提供的磁性微球分离纯化纳豆激酶的方法具有以下的优点(1)操作步骤简单、周期短本分离工艺采用磁性微球从发酵液中分离纯化纳豆激酶,从吸附、清洗和解析整个过程在1-2h内完成。
(2)目标分离产物选择性好采用在磁性微球表面偶联对纳豆激酶具有特异性结合的亲和配基,能特异性地识别目标生物分子。
(3)反应条件温和、酶活回收率高本分离工艺是在室温下且在水溶液中进行,纳豆激酶能保持较高的酶活回收率。
(4)能进行连续化生产采用高梯度磁性分离装置可以实现吸附、清洗和解析连续化生产。
具体实施例方式
下面通过实施例对本发明的技术方案作进一步的描述实施例1(1)纳豆激酶发酵液的制备从固体培养基上挑取纳豆激酶的单菌落接入20mL的种子培养基中,摇床中培养12h,按2%接种量接入发酵液体培养基中,在25℃下发酵罐培养36h。液体发酵结束后,通过离心除去菌体,得到纳豆激酶发酵液。
(2)亲和配基在磁性微球上的固定化将自制的磁性聚甲基丙烯酸甲酯微球进行表面功能化修饰得到表面含有环氧功能基团的磁性微球。在60℃条件下,以氢氧化钠为催化剂,以氨基苯甲脒作为亲和配基,在磁性微球的表面进行固定化反应,获得表面含有苯甲脒的磁性微球。
(3)采用磁性微球从发酵液中分离纳豆激酶将表面含有苯甲脒的磁性微球加入到纳豆激酶的发酵液中,在室温下缓慢搅拌充分混合30分钟,使纳豆激酶特异性地吸附在磁性微球表面。采用磁铁将吸附有纳豆激酶的磁性微球从发酵液中分离出来,用Tris-HCl溶液清洗一次去除杂质,再用甘氨酸一盐酸(pH 3.3)进行解析,收集到纳豆激酶的洗脱液,洗脱液保存在10℃条件下。采用纤维蛋白水解法测定分离后纳豆激酶的活力为80%,纯化因子为6.0。
实施例2(1)纳豆激酶发酵液的制备从固体培养基上挑取纳豆激酶的单菌落接入100mL的种子培养基中,摇床中培养24h,按5%接种量接入发酵液体培养基中,在30℃下发酵罐培养48h。液体发酵结束后,通过离心除去菌体,得到纳豆激酶发酵液。
(2)亲和配基在磁性微球上的固定化将自制的磁性聚乙烯醇微球进行表面功能化修饰得到表面含有环氧功能基团的磁性微球。在70℃条件下,以氢氧化钠为催化剂,以氨基苯基硼酸作为亲和配基,在磁性微球的表面进行固定化反应,获得表面含有苯基硼酸的磁性微球。
(3)采用磁性微球从发酵液中分离纳豆激酶将表面含有苯基硼酸的磁性微球加入到纳豆激酶的发酵液中,在室温下缓慢搅拌充分混合40分钟,使纳豆激酶特定地吸附在磁性微球表面。采用磁铁将吸附有纳豆激酶的磁性微球从发酵液中分离出来,用磷酸盐溶液清洗一次去除杂质,再用醋酸氨(pH 3.0)进行解析,收集到纳豆激酶的洗脱液,洗脱液保存在4℃条件下。采用纤维蛋白水解法测定分离后纳豆激酶的活力为85%,纯化因子为6.5。
实施例3
(1)纳豆激酶发酵液的制备从固体培养基上挑取纳豆激酶的单菌落接入40mL的种子培养基中,摇床中培养16h,按4%接种量接入发酵液体培养基中,在37℃下发酵罐培养24h。液体发酵结束后,通过离心除去菌体,得到纳豆激酶发酵液。
(2)亲和配基在磁性微球上的固定化将自制的磁性聚乙烯醇微球进行表面功能化修饰得到表面含有环氧功能基团的磁性微球。在60℃条件下,以氢氧化钠为催化剂,以氨基苯甲脒作为亲和配基,在磁性微球的表面进行固定化反应,获得表面含有苯甲脒的磁性微球。
(3)采用磁性微球从发酵液中分离纳豆激酶将表面含有苯甲脒的磁性微球加入到纳豆激酶的发酵液中,在室温下缓慢搅拌充分混合50分钟,使纳豆激酶特定地吸附在磁性微球表面。采用磁铁将吸附有纳豆激酶的磁性微球从发酵液中分离出来,用磷酸盐溶液清洗一次去除杂质,再用甘氨酸一盐酸(pH 3.3)进行解析,收集到纳豆激酶的洗脱液,洗脱液保存在5℃条件下。采用纤维蛋白水解法测定分离后纳豆激酶的活力为82%,纯化因子为6.2。
实施例4(1)纳豆激酶发酵液的制备从固体培养基上挑取纳豆激酶的单菌落接入80mL的种子培养基中,摇床中培养20h,按3%接种量接入发酵液体培养基中,在30℃下发酵罐培养40h。液体发酵结束后,通过离心除去菌体,得到纳豆激酶发酵液。
(2)亲和配基在磁性微球上的固定化将自制的磁性聚甲基丙烯酸甲酯微球进行表面功能化修饰得到表面含有环氧功能基团的磁性微球。在80℃条件下,以氢氧化钠为催化剂,以氨基苯基硼酸作为亲和配基,在磁性微球的表面进行固定化反应,获得表面含有苯基硼酸的磁性微球。
(3)采用磁性微球从发酵液中分离纳豆激酶将表面含有苯基硼酸的磁性微球加入到纳豆激酶的发酵液中,在室温下缓慢搅拌充分混合40分钟,使纳豆激酶特定地吸附在磁性微球表面。采用磁铁将吸附有纳豆激酶的磁性微球从发酵液中分离出来,用磷酸盐溶液清洗一次去除杂质,再用醋酸氨(pH 3.0)进行解析,收集到纳豆激酶的洗脱液,洗脱液保存在4℃条件下。采用纤维蛋白水解法测定分离后纳豆激酶的活力为84%,纯化因子为6.7。
权利要求
1 一种磁性微球分离纯化纳豆激酶的方法,其特征在于,所述的纳豆激酶分离纯化方法包括以下几个步骤(1)纳豆激酶发酵液的制备从固体培养基上挑取纳豆激酶的单菌落接入20-100mL的种子培养基中,摇床中培养12-24h,按2%-6%接种量接入发酵液体培养基中,在25-37℃下发酵罐培养24-48h,液体发酵结束后,通过离心除去菌体,得到纳豆激酶发酵液;(2)亲和配基在磁性微球上的固定化将自制的磁性高分子微球进行表面功能化修饰得到表面含有环氧功能基团的磁性微球,在50-80℃条件下,以氢氧化钠为催化剂,进行亲和配基的固定化反应,获得表面含有亲和配基的磁性微球;(3)采用磁性微球从发酵液中分离纳豆激酶将表面含有亲和配基的磁性微球加入到纳豆激酶的发酵液中,在室温下缓慢搅拌充分混合30分钟,使纳豆激酶特定地吸附在磁性微球表面,采用磁铁将吸附有纳豆激酶的磁性微球从发酵液中分离出来,用缓冲溶液清洗一次去除杂质,再用解析液进行解析,收集到纳豆激酶的洗脱液,洗脱液保存在0-10℃条件下。
2 按权利要求1所述的磁性微球分离纯化纳豆激酶的方法,其特征在于,所述的磁性高分子微球是磁性聚甲基丙烯酸甲酯微球和磁性聚乙烯醇微球。
3 按权利要求1所述的磁性微球分离纯化纳豆激酶的方法,其特征在于,所述的亲和配基是氨基苯甲脒和氨基苯基硼酸。
4 按权利要求1所述的磁性微球分离纯化纳豆激酶的方法,其特征在于,所述的解析液是甘氨酸-盐酸溶液和醋酸氨溶液。
5 按权利要求1所述的磁性微球分离纯化纳豆激酶的方法,其特征在于,所述的磁性微球是指表面偶联有特异性亲和配基的磁性微球。
全文摘要
本发明提供了一种磁性微球分离纯化纳豆激酶的方法。将表面偶联有亲和配基的磁性微球加入到纳豆激酶的发酵液中,在室温下缓慢搅拌充分混合,使纳豆激酶特异性地吸附在磁性微球表面;采用磁铁将吸附有纳豆激酶的磁性微球从发酵液中分离出来,用缓冲溶液清洗一次去除杂质,再用解析液进行解析,收集到纳豆激酶的洗脱液;最后经过冷冻干燥得到纳豆激酶产品。分离后纳豆激酶的活力为85%,纯化因子为6.0。本发明具有周期短、操作简单、生产成本低且易于规模化生产等优点。
文档编号C12N9/12GK1876810SQ20051007505
公开日2006年12月13日 申请日期2005年6月8日 优先权日2005年6月8日
发明者阳承利, 邢建民, 官月平, 刘会洲 申请人:中国科学院过程工程研究所
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