专利名称：一种具有内部核糖体进入位点(ires)作用的核苷酸序列的制作方法
技术领域：
本发明涉及一段对虾白斑杆状病病毒基因核苷酸序列。更具体地说，本发明涉及位于WSSV的膜蛋白基因VP28的5’非编码区的一段核苷酸序列，该序列不编码蛋白质，但能引导mRNA直接进入核糖体起始翻译。本发明还提供包含该核酸序列的双顺反子载体和Bacmid DNA，以该Bacmid DNA转染的宿主细胞，以及用所述Bacmid DNA介导的起始翻译功能的方法。
背景技术：
基因的表达分为转录和翻译两个相互独立但又紧密联系的阶段。真核生物的mRNA前体转录完成后，要经过5’端加帽的修饰过程，5’帽子结构除了能保护mRNA免遭核酸酶和磷酸酶的攻击外，在随后的翻译起始过程中核糖体小亚基通过识别5’端帽子结构来寻找蛋白质合成的起始位点，而后再与mRNA5’端结合并沿mRNA滑行至第一个AUG进行翻译(Proc Ncad SciUSA，2001，987029-7036)。在研究一些动物病毒的翻译过程中发现，除了正常的翻译起始机制外，还存在一种不依赖5’帽子结构的翻译起始机制。另外，一些微小RNA病毒家族中的5’非翻译区包含的顺式作用元件本身无启动子活性，但其却能引导mRNA直接进入核糖体开始不依赖于帽子结构的翻译，这些就是由IRES介导的翻译起始(Nat Biotechnol，1997，15961-964)。
IRES的最大特点就是它介导不依赖于5’帽子结构的翻译起始机制。不同来源的IRES其作用机制虽有所区别，但它们都需要与某些反式作用元件结合后才能介导翻译的起始。以脑炎心肌炎病毒EMCV的IRES为例，首先一种名为多聚嘧啶束结合蛋白(PTB)的反式作用元件与IRES上的特定位点结合，接着核糖体小亚基再与PTB-IRES复合物相结合从而使翻译过程开始进行(JVirol，2000，248330-8339)。IRES是5’非编码区的一段DNA序列，这些序列长度因物种不同而各异。EMCV中的IRES元件由位于5’非编码区的450个核苷酸组成，包含有一系列的茎环结构，该元件中共有6个PTB结合位点。这些位点如发生突变，就会影响到起始复合物的形成以及翻译的效率(RNA，1996，21199-1212)。
目前在脊椎动物，昆虫，酵母等的mRNA中都已发现了IRES的存在(PlantJ，2000，24583-589)。在已发现的小RNA病毒mRNAs都有发现IRES序列(Genes &Development，2001，151593-1612)。
基因诊断和治疗中常用的多基因表达方式主要是通过使用多启动子或重组表达融合蛋白，但由于多启动子之间或目的基因之间的相互影响，往往减弱甚至于丧失某些基因的表达(J Innunol，1995，1546466-6474)。鉴于由IRES连接的两个不同基因可以共同转录，各自翻译，从而使多种基因能在同一载体上获得良好表达。该元件已在基因诊断和治疗中得到了应用，为临床基因诊断和治疗以及疗效检测与随访提供了新的，更准确快速的检测手段。用EMCV的IRES，将gfp报告基因和hytk治疗基因连接，构建获得含gfp和hytk基因的双顺反子真核表达载体；lipofectin介导下转染人膀胱癌细胞株，荧光显微镜下可观察到发绿色荧光的转基因细胞，MTT法测定显示丙氧鸟苷(GCV)对EJ/hytk-IRES-gfp细胞有明显的杀伤作用，此杀伤效应呈时间和剂量依赖性；而对野生型细胞无明显毒性。
转基因动物是生物技术领域近年来一个研究热点，但传统的受精卵显微注射，精子介导法等存在的共同缺点就是整合效率不高，低于30％，而大动物甚至只有1％左右。1997年12月英国罗斯林研究所率先报道了使用脂质体介导法将带有新霉素抗性基因(neo)的FIX表达载体转染胎羊成纤维细胞，而后把具有neo抗性的细胞进行核移植得到了转基因羊“波莉”(Science，1997，2782130-2133)，但后来研究发现用该方法研制的转基因羊中存在目的基因FIX缺失及未能表达等问题。我们如果构建带有目的基因，IRES，报告基因(如GFP等)的共表达载体，并用这种载体转染长期培养的细胞，那么只要选择其中带有报告基因稳定表达的细胞进行核移植。从理论上讲，所获得的克隆动物也就是具有目的表达的转基因动物。这就有可能克服“波莉”研究中存在的上述问题。这样不仅可以提高转基因动物的制备效率，而且将有力地推动乳腺生物反应器的产业化进程。
本发明报道了对虾白斑杆状病病毒(WSSV)中的一个IRES序列。在本发明被公布之前，尚没有任何人公开过本申请中涉及的对虾白斑杆状病病毒(WSSV)的IRES序列。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种对虾白斑杆状病病毒(WSSV)中的一个IRES序列，该IRES序列位于WSSV的膜蛋白基因VP28的5’非编码区，不编码蛋白质，但能引导mRNA直接进入核糖体起始翻译。
本发明的另一个目的是提供一种具有双顺反子结构的表达载体，其特征之一在于，它含有权利要求1所述的DNA，其特征之二在于该DNA的上游是GST基因，该DNA的下游是GFP基因。这种具有双顺反子结构的表达载体可以用于其它IRES序列的研究，也可以用于疾病的诊治中，还可以有产业上的用途。
本发明的一个方面，提供了一种利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统实现DNA转座的方法。从而使Bacmid DNA通过脂质体导入宿主细胞，实现基因真核表达。
本发明的另一个发面，提供了一种收集转染过含有双顺反子质粒的BacmidDNA的细胞释放出的病毒的方法，并且收集的这些病毒可以分装后长期存放于超低温冰箱，需要时随时可以向生长状态良好的昆虫细胞接毒，这样，无需再次转染细胞随时可以得到含有目的片断的细胞，此外，通过进一步接毒可以富集含有目的片断的细胞。
本发明还包括一种用地高辛标记过的该IRES分子作为探针分子，用Nothern实验验证GST-IRES-GFP三个基因共同转录。
在本发明中，可选用本领域中已知的各种载体，如市售载体。
在本发明中，术语“宿主细胞”指Hi5粉蚊夜蛾的卵巢细胞。
附图1IRES目的片断扩增。
附图2SDS-PAGE。以未转染的昆虫细胞作为阴性对照，以GST纯化蛋白作为阳性对照。
附图3Western blot。以未转染的昆虫细胞作为阴性对照，以GST纯化蛋白作为阳性对照。
附图44.1图为转染细胞在蓝色激发光下的照片；4.2图为同一视野下细胞的白光照片
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等，分子克隆实验室手册(New YorkCold SpringHarbor Laboratory Press，2001)中所述的实验条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1 IRES序列的克隆和测定1.PCR以对虾白斑杆状综合病病毒(WSSV)基因组作为模板，用IRES的5’和3’端的PCR寡核苷酸引物进行扩增，着重指出的是5’引物上游加了终止密码子，获得IRES目的片断。
PCR程序①94℃3min②28个循环94℃45sec；55℃45sec；72℃45min③72℃5min2.将PCR产物与T载体连接后转化大肠杆菌DH5α的感受态细胞，涂布在含抗生素LB平板上。挑取已插入目的片断的菌落由上海生工测序以保证目的片断扩增后的准确性。
实施例2重组质粒的构建采用基因工程工具酶将IRES序列，GST基因，GFP基因连接到穿梭载体pFASTBACHTb中，并使GST基因位于IRES序列的上游，GFP基因位于IRES序列的下游。然后将连接混合物转化大肠杆菌DH5α的感受态细胞，涂布在含抗生素LB平板上。挑取菌落，提取质粒，用PCR、酶切和测序的方法鉴定GST，IRES，GFP三个基因已正确插入pFASTBACHTb载体中，获得重组质粒GST-IRES-GFP-pFASTBACHTb.
实施例3重组Bacmid DNA的构建应用GIBCOBPRL的Bac-to-Bac杆状病毒表达系统，将实施例2得到的GST-IRES-GFP-pFASTBACHTb重组质粒转化DH10BAC感受态细胞，分离重组BacmidDNA。
实施例4重组Bacmid DNA转染Hi5昆虫细胞1)在无菌的tube中加入5ul已经鉴定的转座了重组质粒的Bacmid+90ul培养基(不含血清)+5ul脂质体，室温放置15min以上2)Hi5昆虫细胞用培养基(不含血清)洗三次，最后加入1ml的SF培养基，然后逐滴加入脂质体混合物，混匀，覆盖细胞3)27℃培养5h以上，加入5％FBS的新鲜培养基5ml4)27℃培养72h，上清中含有重组的杆状病毒，可用于下一步的接毒。
实施例5昆虫细胞接毒传代扩增大量的Hi5昆虫细胞，除去旧的培养基，加入含有5％FBS的新鲜培养基后，再加入转染细胞上清液，27℃无CO2培养48h-72h.收集的细胞上清液为第二代重组病毒。
实施例6 IRES功能研究1 Northern用试剂盒提取转染了重组Bacmid DNA的昆虫细胞的总RNA，跑琼脂糖凝胶电泳，转膜，与用地高辛标记的IRES目的片断探针结合，曝光自显影。结果显示只有一条mRNA条带，且条带大小大于IRES片断。说明GST-IRES-GFP三个基因共同转录。
2 Western破碎接毒细胞，溶于蛋白电泳的上样缓冲液中，沸水煮5min。SDS-PAGE，将蛋白胶转膜至硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜在用TTBS溶液配成的1％脱脂奶粉中4℃封阻过夜。TTBS洗膜3次，每次5min。加入用封闭液稀释的GST一抗(IgG)，4℃轻摇2h。TTBS洗膜3次，每次5min。加入用TTBS稀释的Anti-IgG-AP二抗，室温轻摇1h。加入底物液，显色至出现颜色深度适宜的条带。结果表明GST基因有表达。
3.重组Bacmid DNA转染Hi5昆虫细胞48-72h后用倒置荧光显微镜观察细胞，受转染的细胞表达了GFP绿色荧光蛋白，在蓝色激发光下细胞呈现绿色。结果证明GFP基因有表达。
在阅读了本发明的上述讲授内容后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动和修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表IRES序列信息(1)序列特征(A)长度183bp(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(2)分子类型cDNA(3)序列描述SEQ ID No.11 TAGACCCTGG CTTACTGTAA CAGAAAAAAG AGTAAAAGGC GACAGCTCGC TTGCCAATTG61 TCCTGTTACG TACTCTGTGG TTTCACGAGG TTGTCATCAC CAAAGGTAAC CTTTTTTTTT121 GTCCTCGCCG ACAAAACGAC ATCTTAATAA CCAAGCAACG TTCGATAAAG AAAAAAACTC181 GTC
权利要求
1.一种分离出的DNA分子，位于对虾白斑杆状病病毒WSSV的膜蛋白基因VP28的5’非编码区，不编码蛋白质，但能引导mRNA直接进入核糖体起始翻译。
2.如权利要求1中所述的DNA分子，其特征在于，该序列具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
3.一种测序载体，其特征在于，它含有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列的DNA。
4.一种具有双顺反子结构的表达载体，其特征在于，它含有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列的DNA，
5.根据权利要求4的表达载体，其特征在于该DNA的上游是GST基因，该DNA的下游是GFP基因。
6.一种Bacmid DNA分子，其特征在于，它含有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列的双顺反子载体。
7.一种昆虫细胞，其特征在于，它转染了SEQ ID No.1所示的核苷酸序列的双顺反子载体的Bacmid DNA分子。
8.一种昆虫病毒粒子，其特征在于，它是由权利要求7所述的昆虫细胞释放出来的。
全文摘要
从对虾白斑杆状病病毒(WSSV)的膜蛋白基因VP28的5’非编码区(NCR)分离到一段基因序列，全长183个核苷酸，实验证明具有IRES的功能。
文档编号C12N15/63GK1880456SQ20051007846
公开日2006年12月20日 申请日期2005年6月17日 优先权日2005年6月17日
发明者章晓波, 韩芳 申请人:国家海洋局第三海洋研究所