专利名称：一种食用菌液体菌种的保存方法
技术领域：
本发明涉及一种食用菌液体菌种的保存方法。
背景技术：
食用菌液体深层发酵技术是近20多年来发展起来的，适应食用菌工厂化生产的新技术，与传统的固体菌种培养方式相比，具有周期短、效益高、接种方便且不易污染、发菌快、菌龄整齐等优点，生产出的食用菌产量高、品质好，且由于发菌快、不易受杂菌污染，用液体菌种生产食用菌很少使用化学杀菌剂，生产得到的食用菌不含有毒物质残留，是天然绿色食品。因此，应用液体菌种是食用菌生产的发展方向。由于食用菌菌种的液体培养技术对资金、设备、技术和相关专业人才的要求较高，而目前我国食用菌生产的现状难以适应这样的要求；同时，由于液体菌种营养成分丰富，容易老化失活。因此，如何在贮运过程中较长时间地保存液体菌种的活力，使菌种使用者能购买和使用到贮藏和接种方便，同时有足够活力的液体菌种是目前在食用菌工厂化生产中亟待解决的关键问题。经实验研究发现，常温条件下菌种保存时间只有24小时，超过此时间，菌种活力迅速下降，不能满足生产要求。
目前，已有的实验证明，0℃～4℃条件下，保存时间由于食用菌品种的不同而有差异，一些品种为3～7天，一些可达2～3个月。中国专利92108733.0公开了一种食用菌液体菌种的储存方法，是将液体菌种储存于一种密闭容器的内腔中，储存温度为1℃～25℃，储存时间最长可达到90天，即3个月。
以上菌种的保存温度没有突破液体菌种的相变温度(0℃)，在保存时间和保存效果上难以做到效益最大化。
MTT([3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基]四氮唑溴盐)比色技术是利用活细胞体内的琥珀酸脱氢酶(NADH)催化MTT生成蓝紫色晶体(formazan)沉淀在细胞中，再通过有机溶剂将之溶解，在570nm波长处，用722吸光光度计测量吸光度(OD值)，细胞的活度不同，相对应的OD值不同，OD值与细胞活度在一定范围内具有正相关的关系。该方法广泛应用于动物细胞的凋亡研究领域。但是，食用菌属丝状真菌，其在液体菌种中的菌球是由菌丝体紧密缠绕形成的，它具有体积大(直径1mm左右)，MTT难以进入细胞内部，形成的蓝色物质不容易析出的问题，目前还未见该技术应用于评价食用菌液体菌种活力方面的研究报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种简便、保存时间长的食用菌液体菌种的保存方法。
本发明所提供的食用菌液体菌种的方法，是将食用菌液体菌种先经过快速冷冻降温到-40℃～-20℃后，再在-40℃～-20℃温度下进行保藏，其温度下降速率为1-6℃/min。
常用的冷冻降温采用低温盐溶液水浴冷冻法，如采用饱和CaCl2溶液水浴法进行冷冻降温。经过保存的菌种在需要使用时只需要在室温条件下融化并恢复活力24h即可用于使用。
经过保存的食用菌菌种经过活化后，其活力测定方法是将经保存的食用菌菌球用MTT溶液振荡染色，然后，加入二甲基亚砜或酸化异丙醇采用超声破碎法使色素完全溶解，测定吸光度。
其中，MTT溶液的浓度为4-6mg/ml。
该测试方法包含染色和色素溶解两个部分，具体操作如下染色过程是将MTT试剂溶解于无菌的磷酸盐缓冲液PBS中，配制成5mg/ml的MTT溶液。先将一定数量菌球置于一定体积的无菌水中，加入10％(v/v)MTT染液，通过震荡等措施使菌球完全染色，染色完成后菌球呈蓝紫色，而无菌水仍为无色；色素溶解过程是将细胞内的蓝紫色晶体物质溶解在一定体积的溶解剂中，溶解剂的选择有很多种，如二甲基亚砜(DMSO)，酸化异丙醇等。经过细胞破碎处理后，形成颜色稳定均匀的溶解液，利用分光光度计在570nm处测量OD值。以正常培养出具有百分之百活力的菌球定为活力1，经过冷冻保存后的菌种活力计算公式为菌种活力＝(经冷冻保存后的OD值/正常培养菌球的OD值)×100％。
本发明利用-40℃～-20℃的低温保存菌种，经冷冻保存的液体菌种经解冻活化，接种固体培养基后能正常萌发，可用于生产食用菌。使用MTT比色法检测，经过7个月冷冻保存的菌种活力可保持在75％以上。与现有的液体菌种保存方法相比，本发明方法保存时间更长，能够快速检验检测保存后菌种的活力，适应食用菌液体菌种工厂化生产、保存和销售的需要。本发明的食用菌液体菌种的低温保存方法简便易行，采用冷藏冰柜即可满足要求，成本低、效益高，对菌种的前期培养条件没有附加要求，凡是以液体培养方式得到的食用菌菌种均可以用本发明的方法保存，在实际生产中容易推广使用。
具体实施例方式
实施例1、平菇的冷冻保存平菇液体培养基的配方为每1000毫升培养基中含玉米粉50-60g、蔗糖10g、K2HPO40.5g、MgSO4·7H2O 0.5g、维生素B10mg；装量水平为500毫升三角瓶装液体培养基125毫升，接种量为10％；接种斜面菌种后在25℃静止培养24小时，然后转入25℃水浴摇床中进行培养，摇床转速为180r/min，培养5天后将液体菌种进行低温盐水浴冷冻处理，降温速率为3℃/min，降温到-30℃后，置于-30℃条件下冷冻保存。
将菌种保存5个月后取出，室温活化24小时，无菌条件下选取8个直径1mm左右的菌球置于1ml无菌水中，加入0.1mlMTT染液(5mg/ml)，25℃、150r/min水浴摇床染色12小时，取出菌球，加入到10mlDMSO中，0.5A功率条件下超声2分钟，菌球消失，细胞完全破碎，色素溶解完全；将色素溶解液在800r/min条件下离心5分钟，后取3ml上清液，使用722分光光度计，在570nm处测量OD值，与同样处理条件下得到的正常培养的菌球的OD值相比，得菌种活力为82.8％。
接种冷冻保存过得菌种到栽培培养基上，之后的发菌条件、出菇管理与普通液体菌种相同，得出正常子实体。
实施例2、杏鲍菇的冷冻保存杏鲍菇液体培养基的配方为黄豆粉培养基每1000毫升培养基中含黄豆粉(过滤后)60g，葡萄糖30g，蛋白胨2g，KH2PO40.5g，MgSO40.5g，VB1 10mg；培养温度30℃；转速210r/min；接种量15％；装量100ml。在上述条件下培养4天后将培养好的液体菌种进行低温盐水浴冷冻处理，降温速率为1.5℃/min，降温到-25℃，后置于-25℃下进行冷冻保存，保存5个月。
将保存菌种取出，室温活化24小时，无菌条件下选取16个直径1mm左右的菌球置于1ml无菌水中，加入0.1mlMTT染液(5mg/ml)，25℃、150r/min水浴摇床染色12小时，取出菌球，加入到10mlDMSO中，0.5A功率条件下超声2分钟，菌球消失，细胞完全破碎，色素溶解完全。将色素溶解液在800r/min条件下离心5分钟，后取3ml上清液，使用722分光光度计，在570nm处测量OD值，与同样处理条件下得到的正常培养的菌球的OD值相比，得菌种活力为76.5％。
接种冷冻保存过得菌种到栽培培养基上，之后的发菌条件、出菇管理与普通液体菌种相同，得出正常子实体。
实施例3、茶树菇的冷冻保存茶树菇液体培养基的配方为每1000毫升培养基中含马铃薯200g，葡萄糖20g，KH2PO43g，MgSO41.5g，酵母粉1g，初始pH6.5；培养温度25℃；转速150r/min；接种量15％；装量100ml。在上述条件下培养5天后，将培养好的液体菌种进行低温盐水浴冷冻处理降温到-40℃，降温速率为5℃/min。后置于-40℃进行冷冻保存，保存7个月。
将保存菌种取出，室温活化24小时，无菌条件下选取12个直径1mm左右的菌球置于1ml无菌水中，加入0.1mlMTT染液，25℃，150r/min水浴摇床染色12小时，取出菌球，加入到10mlDMSO中，0.5A功率条件下超声2分钟，菌球消失，细胞完全破碎，色素溶解完全。将色素溶解液在800r/min条件下离心5分钟，后取3ml上清液，使用722分光光度计，在570nm处测量OD值，与同样处理条件下得到的正常培养的菌球的OD值相比，得菌种活力为87.5％。
接种冷冻保存过得菌种到栽培培养基上，之后的发菌条件、出菇管理与普通液体菌种相同，得出正常子实体。
权利要求
1.一种食用菌液体菌种的保存方法，是将食用菌液体菌种先经过快速冷冻降温到-40℃～-20℃后，再在-40℃～-20℃温度下进行保藏，所述降温的速率为1-6℃/min。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述冷冻降温采用低温盐溶液水浴冷冻法。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述被保存的食用菌菌种活力测定的方法，是将经保存的食用菌菌球用MTT溶液振荡染色，然后，加入二甲基亚砜或酸化异丙醇采用超声破碎法使色素完全溶解，测定吸光度。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述MTT溶液的浓度为4-6mg/ml。
全文摘要
本发明公开了一种食用菌液体菌种的保存方法。本发明所提供的食用菌液体菌种的方法，是将食用菌液体菌种先经过快速冷冻降温到－40℃～－20℃后，再在－40℃～－20℃温度下进行保藏，其温度下降速率为1－6℃/min。本发明利用－40℃～－20℃的低温保存菌种，经冷冻保存的液体菌种经解冻活化，接种固体培养基后能正常萌发，可用于生产食用菌。本发明的食用菌液体菌种的低温保存方法简便易行，采用冷藏冰柜即可满足要求，成本低、效益高，对菌种的前期培养条件没有附加要求，凡是以液体培养方式得到的食用菌菌种均可以用本发明的方法保存，在实际生产中容易推广使用。
文档编号C12N1/14GK1733899SQ20051009031
公开日2006年2月15日 申请日期2005年8月12日 优先权日2005年8月12日
发明者高振江, 吴薇, 马浩, 张世湘 申请人:中国农业大学