专利名称：人高密度脂蛋白受体活性调节剂筛选模型及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种以人高密度脂蛋白受体(CLA-1)为靶点的CLA-1活性调节剂体外高通量筛选模型，本发明还涉及一种利用所述筛选模型筛选人高密度脂蛋白受体活性调节剂的方法，以及利用所述模型筛选获得的人高密度脂蛋白受体活性调节剂，尤其是人高密度脂蛋白受体激动剂和人高密度脂蛋白受体拮抗剂。
背景技术：
动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)性心血管疾病是危害人类健康的常见疾病之一。虽然许多资料表明血浆中高密度脂蛋白(HDL)水平的升高对降低胆固醇是有利的，但到目前为止仍没有选择性的针对HDL的治疗方法。
高密度脂蛋白受体确认较晚，1996年，Krieger等(Acton，S.Rigotti，A.Landschulz，KT.Xu，S.Hobbs，HH.Krieger，M.(1996).Identification of scavenger receptor SR-B I as a high densitylipoprotein receptor.Science 271(5248)518-520)发现B类I型清道夫受体(scavenger receptor class B type I，SR-B I)是当时已阐明一级结构的脂蛋白受体中唯一能真正介导细胞与高密度脂蛋白作用的膜受体，因此SR-B I又称为HDL-R。人的SR-B I也已经被克隆出来，取名为CLA-1(CD36 and LIMPII analogous-1)。
HDL受体的确立，引起了人们的极大的兴趣。Trigatti B，RayburnH，Vinals M，等人，Proc Nat Acad Sci USA.1999，96(16)9322-9327，和Braun A，Trigatti BL，Post MJ等人，CircRes.2002，90(3)244-245使用apoE单一缺陷和apoE与SR-B I双缺陷小鼠研究SR-B I对血浆胆固醇和AS的影响。实验发现在给予正常饮食的情况下与apoE单一缺陷小鼠相比，apoE与SR-B I双缺陷小鼠血浆总胆固醇明显升高，胆汁排除明显减少；喂养9周后apoE和SR-B I双缺陷小鼠全部死亡。解剖结果显示，apoE和SR-B I双缺陷小鼠主动脉窦和冠状动脉壁损伤明显，而apoE单一缺陷小鼠未观察到损伤。
把载有编码SR-B I基因的腺病毒整合到纯合子LDL-R缺陷小鼠，使之诱导SR-B I过量表达，发现SR-B I过量表达能减少粥样硬化斑块面积，预防AS的形成(Ueda Y，Royer L，Gong E，等人，J Biol Chem.1999，274(11)7165-7171)。最近的研究还发现SR-B I能参与快速清除氧化性LDL-CE(Low density lipoprotein cholesterol ester)，并继发性引起LDL中氧化脂质减少，从而也可防止AS的形成(AndersenJM，Dietschy JM.，J Biol Chem.1981，256(14)7362-7370)。
由于其抗AS的作用，SR-B I被认为是治疗心血管疾病的新的分子靶标。通过升高SR-B I的表达或提高SR-B I的活性来降低血浆胆固醇成为预防和治疗AS极有前途的方向。因此，一方面可以利用基因治疗手段在肝脏或动脉壁过量表达SR-B I，以减轻AS损伤；另一方面，可在体外构建高通量筛选模型，寻找SR-B I的活性调节剂(包括激动剂或拮抗剂)或SR-B I基因表达的上调剂或下调剂，将有可能获得可以调节HDL受体通路的活性化合物，为预防和/或逆转AS的新型的先导化合物的发现奠定基础。
为解决上述技术问题，本发明人我们用杆状病毒Bac-to-Bac表达系统转染昆虫细胞，在昆虫细胞Sf9细胞膜上成功表达了人HDL受体CLA-1，首次成功建立CLA-1激动剂的体外高通量筛选模型。利用该模型筛选了4000多个样品，成功获得了具有阳性活性的候选化合物。
发明内容
本发明的一个方面，涉及一种以高密度脂蛋白受体CLA-1为靶点的CLA-1活性调节剂高通量筛选模型，其包括1)经重组杆状病毒Bacmid-CLA-1转染可在其细胞膜上表达CLA-1的重组昆虫细胞Sf9；以及2)CLA-1荧光配基DiI-HDL，即1，1’-双十八烷基-3，3，3，3’，3’-四甲基吲哚碳翁花青高氯酸盐(1，1’-dioctadecyl-3-3-3’-3’-tetramethyllindocarbocyanine perchlorate)人高密度脂蛋白(以下缩写为DiI-HDL)。
在本发明的一个实施方案中，所述的筛选模型中的重组昆虫细胞Sf9是通过如下方法制备的在96孔板中每孔接种对数生长期的细胞5×104个于不含FBS、抗生素的Grace培养基，贴壁后按MOI为5的量接种重组杆状病毒Bacmid-CLA-1，感染后培养36-96小时，优选为感染后72小时；其中所述CLA-1配基DiI-HDL的浓度为0.25-2μg/ml，优选为1μg/ml。
在本发明中，所述高密度脂蛋白受体活性调节剂包括高密度脂蛋白受体激动剂和拮抗剂。
本发明的又一方面涉及一种利用所述筛选模型筛选以高密度脂蛋白受体CLA-1为靶点的CLA-1活性调节剂方法，包括1)在96孔板中每孔接种对数生长期的细胞5×104个于不含FBS、抗生素的Grace培养基，贴壁后按MOI为5的量接种重组杆状病毒Bacmid-CLA-1，感染后培养36-96小时，优选为感染后培养72小时，得到对照组细胞；2)用不含FBS、抗生素的Grace培养基洗涤步骤1)中所获得的表达CLA-1的对照组重组昆虫细胞Sf9；3)向步骤2)中所获得的重组昆虫细胞Sf9中加入浓度为0.25-5μg/ml荧光CLA-1配基DiI-HDL50μl，随后加入待测化合物或经适当稀释的微生物发酵产物至50μl体系中，化合物终浓度为10μg/ml；4)将步骤3)所得混合物于27℃孵育4小时，吸弃上清，用pH7.2的PBS100μl洗涤2次后，加入100μl细胞裂解液，裂解20分钟后，溶液转移至黑色荧光板中，在激发光540nm/发射光590nm下，读取样品组荧光读数。
5)所述样品组荧光读数与同样经上述步骤1)-4)处理的用Bacmid病毒感染昆虫细胞的空白组(Mock group)荧光读数相比，所得样品组荧光读数高于空白组的荧光读数20％以上的样品为激动剂，低于空白组的荧光读数20％以上的样品为拮抗剂。
本发明的又一方面涉及所述筛选模型用于筛选高密度脂蛋白受体活性调节剂的用途。
本发明再一方面还涉及利用本发明所述的方法筛选得到的高密度脂蛋白受体活性调节剂，包括高密度脂蛋白受体的激动剂和拮抗剂。
本发明所述筛选模型利用DiI-HDL为配基，以在昆虫细胞Sf9的细胞膜上成功表达的CLA-1为靶点，建立了CLA-1的活性调节剂筛选模型，其特点在于与现有的体外配基受体结合模型相比较，作为筛选靶点人高密度脂蛋白受体在昆虫细胞膜上表达，因此，受体与待测化合物的相互作用接近在人体细胞中的真实状态，同时避免了使用哺乳动物表达所述受体的种种不便，更适合于高通量筛选。
图1为表达质粒pFastBac1-CLA-1的构建示意图。
图2为重组杆状病毒Bacmid-CLA-1的构建示意图。
图3为Bacmid转座区。
图4为10×10的倒置显微镜下，Bacmid和Bacmid-CLA-1成功转染昆虫细胞72小时后与正常昆虫细胞相比，昆虫细胞病变图。其中A.Sf9；B.AcNPV感染的Sf9；C.用空白Bacmid病毒转染的Sf9；D.用Bacmid-CLA-1转染的Sf9。
图5显示经重组杆状病毒感染的昆虫细胞Sf9表达CLA-1的量与表达时间的关系之Western印迹分析结果。其中1.野生Bacmid病毒感染4天的昆虫细胞Sf9；2-6.重组Bacmid-CLA-1病毒分别感染1、2、3、4和5天的昆虫细胞Sf9。
图6显示不同DiI-AcLDL浓度对重组病毒感染的昆虫细胞Sf9结合荧光配基DiI-Ac-LDL的荧光读数的影响，其中空白组是指用Bacmid转染的细胞组成的组，对照组是指用Bacmid-CLA-1转染的细胞组成的组。
图7显示不同DiI-HDL浓度对重组病毒感染的昆虫细胞Sf9结合荧光配基DiI-HDL的荧光读数的影响，其中空白组是指用Bacmid转染的细胞组成的组，对照组是指用Bacmid-CLA-1转染的细胞组成的组。
图8显示重组病毒表达时间对重组病毒感染的昆虫细胞结合荧光配基DiI-Ac-LDL的荧光读数的影响，其中空白组是指用Bacmid转染的细胞组成的组，对照组是指用Bacmid-CLA-1转染的细胞组成的组。
图9显示荧光配基DiI-Ac-LDL与重组病毒感染的昆虫细胞Sf9的孵育时间对的荧光读数的影响，其中空白组是指用Bacmid转染的细胞组成的组，对照组是指用Bacmid-CLA-1转染的细胞组成的组。
图10显示重组杆状病毒在昆虫细胞的表达时间对荧光配基DiI-HDL结合重组昆虫细胞Sf9的荧光读数的影响，其中空白组是指用Bacmid转染的细胞组成的组，对照组是指用Bacmid-CLA-1转染的细胞组成的组。
图11显示荧光配基DiI-HDL与经重组杆状病毒感染的重组昆虫细胞的孵育时间对荧光读数的影响，其中空白组是指用Bacmid转染的细胞组成的组，对照组是指用Bacmid-CLA-1转染的细胞组成的组。
图12显示样品H20对荧光配基与人高密度脂蛋白受体CLA-1结合的拮抗作用。其中图12A显示不同浓度下的样品H20在对照组、空白组和样品组的荧光读数，图12B显示不同浓度的样品H20的荧光读数变化。其中空白组是指用Bacmid转染的细胞组成的组，对照组是指用Bacmid-CLA-1转染的细胞组成的组，样品组是指将样品加入对照组中后的组。
图13显示样品L34对荧光配基与人高密度脂蛋白受体CLA-1结合的激动作用。其中图13A显示不同浓度下的样品L34在对照组、空白组和样品组的荧光读数，图13B显示不同浓度的样品L34的荧光读数变化。其中空白组是指用Bacmid转染的细胞组成的组，对照组是指用Bacmid-CLA-1转染的细胞组成的组，样品组是指将样品加入对照组中后的组。
图14样品4776微生物发酵提取物对荧光配基与人高密度脂蛋白受体CLA-1结合的激动作用。其中图14A显示不同稀释度下的样品4776在对照组、空白组和样品组的荧光读数，图14B显示不同稀释度的样品4776的荧光读数变化。其中空白组是指用Bacmid转染的细胞组成的组，对照组是指用Bacmid-CLA-1转染的细胞组成的组，样品组是指将样品加入对照组中后的组。
图15显示样品6727微生物发酵提取物对荧光配基与人高密度脂蛋白受体CLA-1结合的激动作用。其中图15A显示不同稀释度下的样品6727在对照组、空白组和样品组的荧光读数，图15B显示不同稀释度的样品6727的荧光读数变化。其中空白组是指用Bacmid转染的细胞组成的组，对照组是指用Bacmid-CLA-1转染的细胞组成的组，样品组是指将样品加入对照组中后的组。
图16显示样品6792微生物发酵提取物对荧光配基与人高密度脂蛋白受体CLA-1结合的激动作用。其中图16A显示不同稀释度下的样品6792在对照组、空白组和样品组的荧光读数，图16B显示不同稀释度的样品6792的荧光读数变化。其中空白组是指用Bacmid转染的细胞组成的组，对照组是指用Bacmid-CLA-1转染的细胞组成的组，样品组是指将样品加入对照组中后的组。
实施例实施例1重组杆状病毒Bacmid-CLA-1的制备以及CLA-1中昆虫细胞Sf9中的成功表达1.CLA-1 cDNA的获得1)总RNA的提取使用Promega的SV总RNA试剂盒，从人肝癌BEL-7402细胞(约1×106个细胞)提取总RNA。提取方法依试剂盒推荐步骤进行。总RNA溶于100μl不含核酸酶的水中，-70℃保存。
2)RT-PCR扩增编码目的蛋白的基因以步骤1)中所得总RNA为模板、Oligo dT为引物逆转录合成cDNA。根据人的CLA-1 cDNA序列，设计扩增编码人CLA-1片段的引物。在5’和3’引物末端引入BglII酶切位点和两个保护碱基。引物序列如下P15’端引物5’-AAAGATCTAGACATGGGCTGCTCCGC-3’P23’端引物5’-CCAGATCTGACCCTACAGTTTTGCTTCC-3’以上述逆转录合成的cDNA为模板，用Pfu DNA聚合酶进行PCR反应，反应条件为94℃，5min；94℃，30sec，50℃，30sec，72℃，1min 40sec(3个循环)；94℃ 30sec，62℃，30sec，72℃，2min(30个循环)；72℃ 5min。琼脂糖回收PCR产物，其3’端加dATP，与克隆载体pGEM-T连接后转化大肠杆菌TG1感受态细胞。提取的质粒经BglII酶切鉴定后进行DNA序列分析，获得重组质粒pGEM-T-CLA-1。
DNA片段回收、连接、转化、质粒提取等均按文献Sambrook JFritsch EF，Maniatis T.分子克隆实验室手册(Molecular CloningA Laboratory Mannul)第二版，New YorkCold Spring HarborLaboratory Press，1989进行。
结果获得1.5Kb的CLA-1 cDNA片段，回收RT-PCR产物，与pGEM-T连接后，经序列测定表明，该基因序列与Calvo，D.Vega，M.A.等人(Identification，primary structure，and distribution of CLA-1，a novel member of the CD36/LIMPII gene family，J.Biol.Chem.1993，268(25)，18929-18935)的报道一致。
2.转座质粒pFastBac1-CLA-1的构建及鉴定用BglII从重组质粒pGEM-T-CLA-1上切下CLA-1 cDNA片段，经低熔点琼脂糖凝胶回收纯化后，与用BamHI酶切的pFastBac1以3∶1进行连接，转化大肠杆菌感受态细胞。质粒pFastBac1-CLA-1构建策略见图1。
选取重组子培养，提取质粒进行酶切分析。CLA-1酶切图谱分析表明，其在1050bp有个EcoRI酶切位点，在重组载体pFastBac1多克隆位点也存在一个EcoRI酶切位点，如果CLA-1正向插入多角体启动子的下游，用EcoRI酶切应产生500bp片段，反向插入应产生1000bp的片段。将所得质粒命名为pFastBac1-CLA-1。
3.重组Bacmid-CLA-1病毒的获得用上述步骤1中获得的重组转座质粒pFasBac1-CLA-1转化DH10Bac感受态细胞，在助手质粒(helper)产生的转座酶作用下，携带转座子的CLA-1基因片段转座到穿梭质粒(baculovirus shuttle vector)Bacmid的mini-attTn7位置，并导致LacZ基因插入失活。因此，在Bluo-gal和IPTG存在下，插入CLA-1的大肠杆菌菌落为白色，而未插入CLA-1的菌落为蓝色。挑选白色菌落，重新涂含Blue-gal和IPTG平板，保证仍为白色。挑选白色菌落，摇瓶培养，提取Bacmid-CLA-1(参见图2和图3)。所得重组杆状病毒直接转染培养成单层的Sf9细胞(ATCC CRL1711)，便可得到重组杆状病毒(参见图4)。
4.重组杆状病毒Bacmid-CLA-1感染昆虫细胞Sf9成功表达CLA-1利用如上述构建的第二代重组Bacmid-CLA-1病毒感染昆虫细胞，分别在1、2、3、4和5天收集细胞，进行Western blot分析，结果见图5。在70kD和85kD分别出现了2条带，而且在重组病毒感染的第4天，表达量较大。
具体的，分别用Bacmid病毒、重组的Bacmid-CLA-1病毒感染单层昆虫细胞Sf9，培养72小时，弃上清，细胞用pH7.2的PBS洗2次，加入昆虫细胞裂解液(62.5mM Tris-Cl，pH 6.8，2％SDS，0.1μg/mlAprotin，100μg/ml PMSF)100μl裂解细胞，加入2×加样缓冲液，水浴煮沸5分钟，离心上样经10％SDS-PAGE电泳，然后转移到PVDF膜，5％脱脂牛奶室温封闭1小时；用兔抗人的SR-B I/II多克隆抗体(1/5000)孵育1小时，用1×TBS洗膜3次，每次5分钟；用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔的IgG(1/30000)孵育1小时，用1×TBS洗膜3次，每次5分钟，加发光剂凝胶成像仪拍照。
上述结果表明，经过本发明所述重组杆状病毒Bacmid-CLA-1感染的昆虫细胞Sf9能够成功表达CLA-1。
实施例2经重组病毒Bacmid-CLA-1感染表达CLA-1的重组昆虫细胞Sf9结合荧光配基的分析1.荧光配基结合基本分析方法如下述96孔板接种对数生长期的Sf9，每孔细胞量在5×104，按MOI为5的量接种第二代重组病毒(对照组)，感染空载体的Sf9作为空白组(Mock group)。感染3天后，显微镜下观察Sf9刚出现病变，吸弃培养基，用不含FBS、抗生素的Grace培养基(1L含Grace’s Medium(Gibco产品)46.3g)洗细胞，然后分别加入50μl DiI-AcLDL和DiI-HDL(用不含FBS但含有0.2％BSA的Grace培养基溶解)进行试验。27℃孵育一定时间后，吸弃上清，用pH7.2的PBS洗板3次，加入100μl细胞裂解液，裂解20分钟后，溶液转移至黑色96孔荧光板中，应用BMG Polarstar Galaxy多功能分析测试仪，在激发光540nm/发射光590nm下，读取荧光读数。
1)重组病毒感染的昆虫细胞结合DiI-AcLDL分析结果DiI-AcLDL浓度对荧光读数的影响(参见图6)。从图6可以看出，对照组(感染重组Bacmid-CLA-1病毒的组)和空白组(感染Bacmid病毒组)所测荧光值随着DiI-AcLDL的浓度的升高而升高。DiI-AcLDL浓度为0.5μg/ml时，实验组和对照组相比p＜0.05，而当DiI-AcLDL浓度分别为1.0μg/ml、1.5μg/ml 2.0μg/ml、2.5μg/ml和3.0μg/ml时，对照组和空白组相比p＜0.01。
2)重组病毒感染的昆虫细胞结合DiI-HDL分析结果DiI-HDL浓度对荧光读数的影响(参见图7)。从图7可以看出，随着DiI-HDL浓度的升高，对照组与空白组的荧光值都升高，在不同浓度下两组的荧光值p＜0.01，但对照组与空白组荧光数据中DiI-HDL浓度为0.5μg/ml时最大，所以建立模型时选择DiI-HDL浓度为0.5μg/ml作为筛选时的浓度。
实施例3重组杆状病毒感染的昆虫细胞表达CLA-1的时间与所述CLA-1结合荧光配基的荧光读数的关系以DiI-AcLDL为荧光配基构建的筛选模型中，重组病毒感染昆虫细胞的时间与CLA-1表达量的实验结果参见图8。由图8可以看出，对照组和空白组相比在重组病毒感染72小时后，其结合DiI-AcLDL达到最高峰。而且两组之间荧光读数p＜0.01。感染96小时，CLA-1表达量最高，但随着感染时间的延长，细胞状态变得越来越差，有的不再贴壁，在第120小时，有的细胞出现裂解，此时昆虫细胞结合荧光配基的能力很差，所以在模型的建立时选择了感染三天作为筛选条件。
以DiI-HDL为荧光配基构建的筛选模型中，重组病毒感染昆虫细胞的时间与CLA-1表达量的实验结果参见图10。由图10可以看出，在感染72小时后，对照组与空白组的荧光读数以及两组荧光读数的比值都达到最高值，在不同浓度下两组的荧光读数p＜0.01。所以我们在模型的建立时也选择了感染72小时作为筛选条件。
实施例4荧光配基与重组昆虫细胞的孵育时间对荧光读数的影响以DiI-AcLDL为荧光配基构建的筛选模型中，我们选择DiI-AcLDL浓度为1.5μg/ml，其他条件不变，但孵育时间分别为2、4、6、8、10、12小时，结果见图9A和9B。孵育2、4小时，对照组和空白组相比p＞0.05，两组之间无明显差异。孵育6、8、10、12小时，对照组和空白组相比p＜0.01，两组之间有明显差异。孵育12小时后荧光读数增加不明显。
以DiI-HDL为荧光配基构建的筛选模型中，我们选择DiI-HDL的浓度为0.5μg/ml，随着孵育时间的延长，空白组与对照组所测荧光读数均升高，但孵育6小时和10小时，荧光读数的升高不再明显(参见图11)。而且对照组与空白组荧光读数的比值在孵育6小时时达到了最高值。在不同的孵育时间，对照组和空白组荧光读数的差别p＜0.01。所以在模型的应用时选择孵育6小时为筛选条件。
实施例5应用本发明所述筛选模型对不同来源的候选化合物和微生物发酵产物的样品的筛选结果利用上述构建的筛选模型，以DiI-HDL为荧光配基，分别对4000个不同样品进行筛选研究，其中包括3600个微生物发酵提取物，400个纯化合物。为了节约的用量，每5个样品混合来进行初筛，纯化合物的初筛浓度为4μg/ml，发酵液提取物是500倍稀释，经过初筛筛选出部分活性成分，阳性率2％。
经复筛后确定了显示阳性活性样品样品H20及L34是喹诺酮类的纯化合物，样品4776、6727和6792是微生物的发酵提取物。其中样品H20在筛选模型中能够使荧光读数降低20％以上，初步认定为受体拮抗剂。样品L34和微生物4776，6727及6792的发酵提取物使荧光读数升高20％以上，初步认定为受体激动剂。
分别对样品H20，L34，4776，6727和6792的不同浓度对荧光配基与昆虫细胞表达的高密度脂蛋白受体结合活性的影响进行了研究，观察浓度与荧光读数的关系，结果如下1.样品H20对荧光配基与人高密度脂蛋白受体CLA-1结合的拮抗作用(参见图12)由图12可以看出，样品H20可以使受体与荧光配基的结合降低，而且随着浓度的升高，其降低荧光值的作用增强。当样品浓度达到10μg/ml时，荧光读数由起始的4000下降到1500左右，降低幅度远远大于20％，可以初步认定所述样品具有受体拮抗剂的作用。
2.样品L34对荧光配基与人高密度脂蛋白受体CLA-1结合的激动作用(参见图13)由图13可以看出，样品L34可以使受体与荧光配基的结合升高，而且随着浓度的升高，其升高荧光值的作用增强。当样品浓度达到10μg/ml时，荧光读数由起始的4000左右升高到12000左右，升高幅度远远大于20％，可以初步认定所述样品具有受体激动剂的作用。
3.样品4776微生物发酵提取物对荧光配基与人高密度脂蛋白受体CLA-1结合的激动作用(参见图14)由图14可以看出，样品4776微生物发酵提取物可以使受体与荧光配基的结合升高，而且随着稀释倍数的降低(即浓度的升高)，其升高荧光值的作用增强。当样品的稀释倍数由稀释10000倍降低到仅稀释200倍时，荧光读数由起始的4000左右升高到12000左右，升高幅度远远大于20％，可以初步认定所述样品具有受体激动剂的作用。
4.样品6727微生物发酵提取物对荧光配基与人高密度脂蛋白受体CLA-1结合的激动作用(参见图15)由图15可以看出，样品6727微生物发酵提取物可以使受体与荧光配基的结合升高，而且随着稀释倍数的降低(即浓度的升高)，其升高荧光值的作用增强。当样品的稀释倍数由稀释10000倍降低到仅稀释200倍时，荧光读数由起始的4000左右升高到12000左右，升高幅度远远大于20％，可以初步认定所述样品具有受体激动剂的作用。
5.样品6792微生物发酵提取物对荧光配基与人高密度脂蛋白受体CLA-1结合的激动作用(参见图16)由图16可以看出，样品6792微生物发酵提取物是使受体与荧光配基的结合率升高，而且随着稀释倍数的降低(即浓度的升高)，其升高荧光值的作用增强。当样品的稀释倍数由稀释10000倍降低到仅稀释200倍时，荧光读数由起始的4000左右升高到16000左右，升高幅度远远大于20％，可以初步认定所述样品具有受体激动剂的作用。
发明的有益效果本发明所述筛选模型利用DiI-HDL为配基，以在昆虫细胞Sf9的细胞膜上成功表达的CLA-1为靶点，建立了CLA-1的活性调节剂筛选模型，其特点在于与现有的体外配基受体结合模型相比较，作为筛选靶点人高密度脂蛋白受体在昆虫细胞膜上表达，因此，受体与待测化合物的相互作用接近在人体细胞中的真实状态，同时避免了使用哺乳动物表达所述受体的种种不便，更适合于高通量筛选。
权利要求
1.一种以高密度脂蛋白受体CLA-1为靶点的CLA-1活性调节剂高通量筛选模型，其包括1)经重组杆状病毒Bacmid-CLA-1转染可在其细胞膜上表达CLA-1的重组昆虫细胞Sf9；以及2)CLA-1荧光配基DiI-HDL。
2.权利要求1所述的筛选模型，其中1)所述重组昆虫细胞Sf9是通过如下方法制备的在96孔板中每孔接种对数生长期的细胞5×104个于不含FBS、抗生素的Grace培养基，贴壁后按MOI为5的量接种重组杆状病毒Bacmid-CLA-1，感染后培养36-96小时，优选为感染后72小时；2)所述CLA-1荧光配基DiI-HDL的浓度为0.25-2μg/ml，优选为1μg/ml。
3.权利要求1所述的筛选模型，其中所述高密度脂蛋白受体活性调节剂包括高密度脂蛋白受体的拮抗剂和激动剂。
4.一种利用权利要求1所述筛选模型筛选以高密度脂蛋白受体CLA-1为靶点的CLA-1活性调节剂方法，包括1)在96孔板中每孔接种对数生长期的细胞5×104个于不含FBS、抗生素的Grace培养基，贴壁后按MOI为5的量接种重组杆状病毒Bacmid-CLA-1，感染后培养36-96小时，优选为感染后72小时，得到对照组细胞；2)用不含FBS、抗生素的Grace培养基洗涤步骤1)中所获得的表达CLA-1的对照组重组昆虫细胞Sf9；3)向步骤2)中所获得的重组昆虫细胞Sf9中加入浓度为0.25-5μg/ml荧光CLA-1配基DiI-HDL50μl，随后加入待测化合物或经适当稀释的微生物发酵产物至50μl体系中，化合物终浓度为10μg/ml；4)将步骤3)所得混合物于27℃孵育4小时，吸弃上清，用pH7.2的PBS100μl洗涤2次后，加入100μl细胞裂解液，裂解20分钟后，溶液转移至黑色荧光板中，在激发光540nm/发射光590nm下，读取样品组荧光读数；5)所述样品组荧光读数与同样经上述步骤1)-4)处理的用Bacmid病毒感染昆虫细胞的空白组荧光读数相比，所得荧光读数高于空白组的荧光读数20％以上的样品为激动剂，低于空白组的荧光读数20％以上的样品为拮抗剂。
5.权利要求1所述筛选模型用于筛选高密度脂蛋白受体活性调节剂的用途。
6.利用权利要求4所述的方法筛选的高密度脂蛋白受体活性调节剂。
全文摘要
本发明涉及一种以人高密度脂蛋白受体(CLA－1)为靶点的CLA－1活性调节剂体外高通量筛选模型，本发明还涉及一种利用所述筛选模型筛选人高密度脂蛋白受体活性调节剂的方法，以及利用所述模型筛选获得的人高密度脂蛋白受体活性调节剂，尤其是人高密度脂蛋白受体激动剂和人高密度脂蛋白受体拮抗剂。
文档编号C12Q1/02GK1916182SQ20051009076
公开日2007年2月21日 申请日期2005年8月16日 优先权日2005年8月16日
发明者司书毅, 洪斌, 田德峰, 张忠兵, 王娟, 张月琴, 解云英, 姜威, 王丽非, 巫晔翔 申请人:中国医学科学院医药生物技术研究所