专利名称：一种精子蛋白单克隆抗体及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程、细胞工程和肿瘤的免疫诊断领域，更具体而言，本发明涉及一种单克隆抗体，该抗体能特异识别一种肿瘤相关抗原，该抗原是一种正常情况下在睾丸和精子中表达、但在某些恶性肿瘤组织中异常出现的精子蛋白；本发明还涉及该蛋白特异性单克隆抗体的制备方法及该单克隆抗体在制备恶性肿瘤诊断试剂中的应用。
背景技术：
与正常组织相比，肿瘤细胞经常发生基因的异常表达，产生肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原。这些抗原可以作为诊断肿瘤分子标志物，或可以用作肿瘤生物治疗的靶分子。为人熟知的肿瘤相关抗原如甲胎蛋白。近年在各种恶性肿瘤组织中发现多种正常睾丸蛋白的表达[1]，并将这些蛋白归属为一类新的肿瘤相关抗原，统称为癌瘤-睾丸(cancer-testis，CT)抗原。CT抗原具有如下特征(1)在男性成熟生殖细胞中高水平表达；(2)在正常体细胞中很少表达；(3)在多种类型的肿瘤中异常表达。已知的CT抗原包括黑色素瘤抗原(MAGE，BAGE，GAGE)，食管癌抗原(NY-ESO-1)和肾癌抗原(SCP-1)等。
精子蛋白17(sperm protein 17，Sp17)是一种高度保守的、在人和动物成熟生殖细胞中高水平表达的一种蛋白质，其功能主要是参与精子与卵子的结合，促进受精过程[2]。人和其他哺乳动物Sp17有很高的同源性，人与狒狒Sp17的同源性为97％，与鼠、兔的同源性为61％。人Sp17分子由151个氨基酸组成，在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的表观分子质量为24.5kDa[3]。已有的研究表明，Sp17在人和动物的正常组织中限制性表达[4-5]，是一种局限在睾丸组织和精子细胞的特异性蛋白，很少出现在其他正常组织和外周血中。测定的组织包括骨髓、脑、结肠、心、肾、肝、肺、胰腺、前列腺、骨骼肌、脾和睾丸，结果在正常睾丸组织中检测到很强的Sp17表达信号，在前列腺中微弱表达，其他组织无表达。在正常人睾丸中，精母细胞、早期和晚期精细胞、以及成熟精子Sp17强阳性，而精原细胞、支持细胞和间质细胞则阴性[6]。
近年发现，Sp17基因在一些恶性肿瘤组织如多发性骨髓瘤、上皮性卵巢癌和子宫内膜癌中被激活并高水平异常表达，是一种新的癌瘤-睾丸(cancer-testis，CT)抗原[7～9]。Sp17在正常组织中的局限性表达和在恶性组织中的异常表达，使它成为相关肿瘤诊断的分子标志物和免疫治疗的靶点。检测肿瘤组织中Sp17蛋白分子的表达，有助于判断肿瘤类型。
因此，制备出特异性识别Sp17蛋白、且与之高亲和力结合的单克隆抗体，用于配制诊断肿瘤的试剂组合物，是目前生物医学领域亟待解决的问题。
参考文献1.Zendman AJ，Ruiter DJ，van Muijen GN.Cancer/Testis-Associated GenesIdentification，Expression Profile，and Putative Function.J Cellular Physiol.2003，194(3)272-2882.Richardson RT，YamasakiN，O’Rand MG.Sequence of a rabbit sperm zona-pellucidabinding protein and localizating during the acrosome reacting.Dev Biol，1994；165688-7013.Lea IA，Richardson RT，Widgren EE，et al.Cloning and sequencing of cDNAs encodingthe human sperm protein，Spl7.Biochim Biophys Acta.1996，1307(3)263-266.
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9.李芳秋，杨爱龙，刘群，等.精子蛋白17mRNA在卵巢癌中的表达及临床意义.医学研究生学报，2005，18(5)615-618
发明内容
本发明的目的就是为了解决上述问题，提供一种针对Sp17的单克隆抗体。
本发明的另一个目的是提供该单克隆抗体的制备方法。
本发明还有一个目的是提供该单克隆抗体在制备恶性肿瘤诊断试剂中的应用。
本发明的单克隆抗体应理解为可以是IgG或IgM，也可以是该抗体的Fab片段、F(ab’)2片段、单链抗体等。
本发明典型的杂交瘤细胞株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.1434，保藏时间为2005年8月10日，这里将分泌sp17单克隆抗体的细胞株表示为“Sp17-3D6”。
可通过实质上通用的基因重组技术，获得人或动物Sp17基因工程蛋白用于动物的免疫接种和筛选、鉴定抗体的抗原，但本发明优选表达载体pET-28a(+)，使目的基因的表达最有效，最易于纯化。
本发明的技术解决方案本发明的技术方案首先用基因工程技术制备人或动物Sp17蛋白。从人或动物睾丸组织中提取Sp17基因，对该基因进行克隆，并构建携带该基因的原核细胞表达载体，将该载体转化入大肠杆菌，诱导被转化的大肠杆菌高效表达Sp17蛋白。再用获得的该基因工程蛋白接种小鼠，待动物体内对Sp17蛋白形成免疫应答后，从该动物体内提取脾淋巴细胞，与能在体外无限增殖的小鼠骨髓瘤细胞融合，建立杂交瘤细胞系，从该细胞系中筛选出所有能产生特异性抗体的细胞株。对产生抗体的这些细胞株进行反复筛选和单克隆化培养，优选出抗体亲和力最强，特异性最高的单克隆细胞株，所产生的抗体即为本发明的单克隆抗体。
本发明采用ELISA法对分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞进行筛选，对抗体效价进行测定，采用Western印迹法、免疫组织化学法、免疫细胞化学法以及阻断试验对所制备的单克隆抗体的特异性进行了鉴定。
以下是本发明的具体技术措施一种精子蛋白单克隆抗体，该单克隆抗体是由保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏号为CGMCC No.1434的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体。
所述的单克隆抗体，其抗原结合片段保持该单克隆抗体的结合特征。
分泌上述单克隆抗体的无限增殖细胞系。所述的无限增殖细胞系为杂交瘤细胞系；该杂交瘤细胞系为保藏于CGMCC保藏号为CGMCC No.1434的杂交瘤细胞系。
所述的精子蛋白单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤a、克隆人或动物的一种精子蛋白的基因；b、将克隆的人或动物精子蛋白的基因插入表达载体，构建成重组表达载体；c、将构建的重组表达载体转化感受态大肠杆菌，经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导获得该精子蛋白的高效表达产物，再经亲和层析，得到纯化的该精子蛋白的重组蛋白；d、用纯化的该重组蛋白接种小鼠，取其脾淋巴细胞与小鼠Sp2/0骨髓瘤细胞融合，建立杂交瘤细胞系；e、从上述杂交瘤细胞系中筛选分泌该精子蛋白抗体的杂交瘤细胞株，选出最稳定、抗体活性最高的细胞株，它们所产生的抗体即为权利要求1所述的单克隆抗体。
所述的精子蛋白单克隆抗体的制备方法，其中克隆人或动物精子蛋白的基因是用逆转录PCR法从人或动物睾丸mRNA中扩增出精子蛋白Sp17的cDNA。
所述的精子蛋白单克隆抗体的制备方法，其中表达载体优选pET-28a(+)。
一种用于诊断肿瘤的试剂组合物，该组合物含有作为活性成分的有效量的上述单克隆抗体。
所述的单克隆抗体在制备肿瘤诊断试剂中的应用。
本发明的有益效果；首先，本发明提供了一种单克隆抗体，该抗体能特异性结合于人或动物睾丸组织、以及精液中精子细胞正常表达的Sp17蛋白，该抗体也能特异性结合于恶性肿瘤组织中异常产生的Sp17蛋白，包括释放到外周血中的Sp17蛋白。
本发明单克隆抗体的具有高度特异性和强亲和力，能用于诊断肿瘤的检测试剂制备。
本发明所制备的单克隆抗体可适用于检测肿瘤腹腔转移的病人的腹水癌细胞中异常表达的Sp17蛋白，以帮助判断肿瘤的来源。
本发明所制备的单克隆抗体适用于检测肿瘤组织中异常表达的Sp17蛋白，以帮助判断肿瘤的类型。
图1RT-PCR扩增Sp17DNA片段的琼脂糖凝胶电泳图其中1.100bp DNA分子量标准；2.RT-PCR产物。
图2琼脂糖凝胶电泳分析重组质粒pGEM-T/Sp17的PCR及酶切产物其中1.pGEM-T/Sp17未经限制酶处理；2.pGEM-T/Sp17经Nde I和BamH I处理；3.PCR产物；4.DNA分子量标准。
图3pET-28a(+)/Sp17在大肠杆菌BL21(DE3)中表达的SDS-PAGE分析其中1.低分子量蛋白质标准；2～6.IPTG诱导的5个阳性克隆；7.未经IPTG诱导的阳性克隆；8.pET-28a(+)/BL21经IPTG诱导。
图4镍离子亲和层析纯化重组Sp17的SDS-PAGE分析其中1.纯化的重组蛋白；2.pET-28a/Sp17质粒转化的E.coli BL21菌裂解液。
图5Western blot印迹鉴定Sp17单克隆抗体的特异性其中1.3C12株2.3D6株。
图6IsoStrip小鼠单克隆抗体亚类(型)测定结果。
图7大鼠睾丸组织免疫组织化学分析的光镜图抗Sp17单克隆抗体与大鼠睾丸中精母细胞、精细胞和成熟精子正常表达的Sp17发生特异性结合反应，细胞染成黄褐色。
图8人睾丸组织免疫组织化学分析的光镜图之一精母细胞、精细胞和成熟精子表达的Sp17与抗Sp17单克隆抗体发生特异性结合，细胞染成黄褐色。
图9人睾丸组织免疫组织化学分析的光镜图之二人睾丸组织中与抗Sp17单克隆抗体的反应被游离的Sp17蛋白所阻断，未出现黄褐色细胞。
图10人精液中的精子细胞免疫细胞化学分析的光镜图正常表达的Sp17与抗Sp17单克隆抗体发生特异性结合，精子尾部染成黄褐色。
图11卵巢癌免疫组织化学分析的光镜图癌细胞中异常表达的Sp17与抗Sp17单克隆抗体反应，癌细胞被染成黄褐色。
图12子宫内膜癌免疫组织化学分析的光镜图癌细胞中异常表达的Sp17与抗Sp17单克隆抗体反应，癌细胞被染成黄褐色。
图13用本发明单克隆抗体进行腹水中转移癌细胞的检测光镜图之一。
图14用本发明单克隆抗体进行腹水中转移癌细胞的检测光镜图之二。
具体实施例方式
以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。
实施例1人精子蛋白17基因的克隆及原核表达要制备Sp17单克隆抗体，首先要进行Sp17基因的克隆和原核表达，为制备Sp17单克隆抗体奠定基础。我们利用RT-PCR法和T/A克隆策略，从正常生育男性睾丸组织中克隆Sp17基因，经过PCR、双酶切鉴定后，进行DNA测序(SEQ ID No.1)。然后，构建重组表达载体pET-28a(+)/Sp17，经过PCR和双酶切鉴定后，转化大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导表达和SDS-PAGE检测重组Sp17，镍离子亲和层析纯化重组蛋白。
1.1实验标本人睾丸组织1.2制备Sp17双链cDNA片段1.2.1引物设计用DNAMAN分析软件设计，PCR引物序列如下上游引物(primer 1)5′-CCACGCACATATGTCGATTCCATTCTCCAAC-3′(SEQID No.2)(划线处为Nde I酶切位点)下游引物(primer 2)5′-CGGGGATCCTCACTTGTTTTCCTCTTTTTC-3′(SEQ IDNo.3)(划线处为BamH I酶切位点)。
1.2.2人睾丸组织总RNA的提取切取50mg组织块放入研钵中，立即加入适量的液氮，在组织呈冻结状态下充分研磨，使之成为粉末状，紧接着转移至含1ml Tripure RNA提取液的离心管中，颠倒混匀，室温放置15分钟。加入0.2ml氯仿，充分混匀，4℃ 12000rpm离心15分钟。转移上层无色水相至新的离心管中，加入0.5ml异丙醇，充分混匀，室温放置10分钟。4℃12000rpm离心10分钟，弃上清，加入1ml 75％乙醇，涡旋振荡，4℃ 7500rpm离心5分钟。弃上清，用50μl DEPC(焦碳酸二乙酯)处理水溶解RNA沉淀，8g/L琼脂糖凝胶电泳检测RNA提取的效果，将标本RNA溶液冻存在-70℃冰箱待用。
1.2.3逆转录反应总反应体系(20μl)组成如下10×RT-缓冲液 2μl25mmol/L MgCl24μl10mmol/L dNTP 2μlRNase抑制剂 0.5μl总RNA溶液 3μl随机引物 1μlAMV逆转录酶 0.75μl(15U)无核酸酶超纯水(无核酶水)补足反应体积至20.0μl按试剂盒说明书进行逆转录反应70℃孵育RNA溶液10分钟，立即冰浴5分钟；加入其他反应成分，振荡混匀，瞬时离心，室温孵育10分钟；42℃逆转录反应30分钟，95℃加热5分钟，灭活AMV逆转录酶，-70℃冰箱保存备用。
1.2.4PCR扩增总反应体系(25μl)组成如下10×PCR-缓冲液2.5μl25mmol/L MgCl21.5μl10mmol/L dNTP 0.5μl5μmol/L Sp17上游引物 1.0μl5μmol/L Sp17下游引物 1.0μl总cDNA单链模板1.0μl灭菌蒸馏水16.5μlTaq酶(0.5U/μl) 1.0μlPCR参数为94℃预变性5分钟，95℃ 30秒、57℃ 30秒、72℃ 30秒，35个循环，72℃延伸7分钟。17g/L琼脂糖凝胶电泳检测分析PCR产物，结果如图1。
1.2.5PCR产物的纯化及定量利用市售的纯化试剂盒，按照说明书对PCR产物进行纯化，用紫外分光光度计定量DNA溶液的浓度。
1.3重组克隆载体pGEM-T/nSp17的构建及鉴定
1.3.1连接反应总反应体系(10μl)组成如下10×连接酶缓冲液1.0μlSp17双链cDNA2.0μl(27ng/μl)pGEM-T载体 1.0μl(50ng/μl)T4DNA连接酶 1.0μl无核酸酶水 5.0μl振荡混匀反应体系，4℃连接反应过夜。反应结束后，65℃保温10分钟，灭活T4DNA连接酶。
1.3.2重组质粒转化大肠杆菌JM109感受态细胞将10μl连接反应液加入到100μl JM109感受态细胞中，轻轻拍动管壁数次，充分混匀内容物，置于冰浴30分钟。将离心管置于42℃水浴中90秒，立即转至冰浴，静置2分钟。缓慢加入LB培养基0.5ml，37℃ 100rpm振摇培养45分钟，将菌液涂布在含氨苄青霉素(0.1g/L)、5’-溴-4-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(0.3g/L)及异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(0.3g/L)的LB平板上，37℃培养过夜。
1.3.3筛选和扩增培养阳性克隆随机挑取5个白色单菌落，分别接种于5只培养试管(含0.1g/L氨苄青霉素的LB培养基)中，37℃ 250rpm振摇培养过夜。
1.3.4DNA测序鉴定重组质粒将经过PCR和酶切鉴定的重组质粒，送上海博亚生物公司，用通用引物进行DNA测序，将测序结果与Genbank及其他文献报道中的序列进行比对分析，结果如图2。
1.4构建重组表达载体pET-28a(+)/Sp171.4.1割胶纯化酶切后的Sp17 DNA片段1.4.2试剂盒提取质粒pET-28a(+)1.4.3Nde I、BamH I双酶切质粒pET-28a(+)总反应体系(100μl)组成如下灭菌蒸馏水50.0μl10×K缓冲液 10.0μl
质粒pET-28a(+)(0.16mg/ml)30.0μlNde I(10U/μl) 5.0μlBamH I(10U/μl) 5.0μl振荡混匀反应体系，37℃孵育1h，加入10μl 10×Loading缓冲液终止酶切反应，10g/L琼脂糖凝胶电泳分析酶切产物。
1.4.5割胶纯化线性化质粒pET-28a(+)。
1.4.6连接反应(反应体系组成如下)10×连接酶缓冲液 1.0μl纯化后Sp17 DNA 2.0μl(43μg/ml)纯化后线性化质粒pET-28a(+) 1.0μl(177μg/ml)T4DNA连接酶 1.0μl无核酸酶水 5.0μl振荡混匀反应体系，4℃连接反应过夜。反应结束后，65℃保温10分钟，灭活T4DNA连接酶。
1.4.7重组质粒转化大肠杆菌感受态BL21(DE)将菌液涂布在含卡那霉素(0.1g/L)的LB平板上，倒扣平皿放置在37℃温箱中培养过夜。
1.4.8筛选、扩增培养阳性克隆随机挑取5个单菌落，分别接种于5只培养试管(含0.1g/L卡那霉素的LB培养基)中，37℃ 250rpm振摇培养过夜。
1.5重组质粒pET-28a(+)/Sp17的诱导表达挑取经过PCR和双酶切鉴定的阳性克隆，接种于含卡那霉素(0.1g/L)的LB培养基，37℃ 250rpm培养过夜。次日，以1∶50稀释转种于含卡那霉素(0.1g/L)的LB培养基，37℃ 300rpm剧烈振荡培养。当菌液OD600≈0.6时，取出1ml菌液不加诱导剂作为阴性对照，在菌液中加入诱导剂异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG，终浓度为1mmol/L)，37℃诱导培养3h小时。同时，用含空载质粒pET-28a(+)的和不含质粒的BL21菌作为空白对照。取1ml诱导菌液，7500rpm离5分钟，弃上清，50μl 1×SDS凝胶上样缓冲液充分重悬细菌沉淀，隔水煮沸5分钟，12000rpm离心5分钟，取10μl上清进行SDS-PAGE(浓缩胶50g/，分离胶150g/L)检测和分析表达产物，结果如图3。
1.6镍离子亲和层析纯化重组Sp17缓冲液A浸泡平衡2g Ni-NTA His-Bind树脂1h，树脂自然沉淀后弃上清，混匀裂解离心上清和平衡树脂，4℃轻轻振荡1h。转移悬液至层析柱中，让柱床中的液体自然流干，10个柱床体积的缓冲液B(50mmol/L Tris-HCl，300mmol/L NaCl，20mmol/L咪唑，pH 8.0)充分洗涤树脂。最后，用4ml咪唑洗脱缓冲液(50mmol/L Tris-HCl，300mmol/L NaCl，250mmol/L咪唑，pH 8.0)洗脱目的蛋白。在4℃冰箱中，PBS透析洗脱液48h，其间换液8次。裂解离心上清和纯化产物同时进行SDS-PAGE(浓缩胶50g/L，分离胶150g/L)，对比分析纯化效果，见图4。考马斯亮蓝G-250法测定重组蛋白的浓度。
实施例2 抗Sp17单克隆抗体的制备1.用Sp17蛋白免疫接种BALB/c小鼠初次免疫时，取纯化的重组Sp17(1.7g/L)0.5ml与等量福氏完全佐剂混合，在研钵中充分研磨至完全乳化(即油包水状态)后，注射到小鼠腹腔内(0.1ml/只)。间隔2周后进行第2次加强免疫，改用福氏不完全佐剂充分乳化抗原，注射剂量和部位同前。间隔2周后进行第3次加强免疫，直接使用抗原溶液，注射剂量和部位同前。间隔10天后测定免疫小鼠血清中的抗体效价。在细胞融合前3天，取一只抗体阳性最强的小鼠进行第4次加强免疫，注射剂量和部位同前。
2.间接酶联免疫吸附试验(ELISA)测定小鼠血清中抗体的效价第3次加强免疫10天后，采集抗原免疫的和未免疫的小鼠血，作为ELISA的待测标本和阴性对照，分离血清，4℃保存待测。用抗原包被液稀释重组Sp17至终浓度为1μg/ml，包被聚苯乙烯板微孔(100μl/孔)，4℃包被过夜。次日，PBS-T洗板3次，按200μl/孔加入50g/L脱脂奶粉封闭，37℃孵育2小时h，PBS-T洗板3次。PBS稀释待测血清和阴性对照血清(1∶1000)，以PBS为空白对照，按100μl/孔加入微孔，37℃孵育1小时h。PBS-T洗板3次，按100μl/孔加入HRP-羊抗鼠IgG(1∶3000稀释)，37℃孵育1小时。PBS-T洗板3次，每孔加入底物、显色剂各1滴，37℃孵育10分钟。加2滴1mol/L H2SO4终止反应，在波长450nm用酶联免疫检测仪比色并记录结果。
3.小鼠脾细胞的制备第4次加强免疫3天后，摘除免疫小鼠眼睛放血，留取血清作为ELISA的阳性对照，4℃保存备用。拉颈处死小鼠，75％酒精浸泡5分钟。在小鼠腹部剪一小口，撕开皮肤，剪开腹膜，镊取小鼠脾脏，剪下小鼠脾脏，除去脂肪和结缔组织，用RPMI 1640不完全培养基洗涤小鼠脾脏。将小鼠脾脏剪成4块，在不锈钢筛网(100目/cm2)上，用玻璃注射器针芯充分研磨小鼠脾脏，轻轻挤压出脾细胞。将研磨液经过不锈钢筛网(200目/cm2)过滤后，转移至离心管，1000rpm离心5分钟。弃上清，RPMI 1640不完全培养基洗涤细胞一次，再用RPMI 1640不完全培养基充分重悬细胞，进行细胞计数并算出细胞浓度为2×1010个/L，置于孵育箱(37℃、5％CO2)中待用。
4.细胞融合充分混匀免疫脾细胞(108个)和SP2/0细胞(107个)悬液，1000rpm离心5分钟。弃上清，尽可能除去残留液体，手指轻弹离心管使细胞沉淀较为松动。将离心管置于37℃水浴中，30秒内加完1ml 50％ PEG 4000，边加边适度搅拌，加完后继续搅拌15秒，静置90秒。加入RPMI1640不完全培养液，加液速度由慢到快，具体方案连续每2分钟内分别加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和10ml，终止融合作用。800rpm离心5分钟，弃上清，用RPMI1640不完全培养液轻轻重悬、洗涤细胞1次。加入50ml HAT完全培养基，轻轻重悬细胞，按100μl/孔加入到含饲养细胞的96孔培养板，置于细胞孵育箱(37℃、5％CO2)中培养。
5.抗体的检测用重组Sp17作为包被抗原，取待测微孔中培养上清0.1ml用于测定，以免疫小鼠外周血清作为阳性对照，以SP2/0细胞的培养上清作为阴性对照，用HRP-羊抗鼠(1∶3000稀释)作为二抗。
6.杂交瘤细胞的克隆化培养取100个细胞，加入10ml HT培养基并充分混匀，按0.1ml/孔加入到含饲养细胞的96孔培养板中。10天后检测抗体，筛选出抗体阳性最强的2个单克隆细胞株，分别为3C12和3D6。然后，改用RPMI 1640完全培养基(含20％新生小牛血清)，多次进行亚克隆培养，直到所有含细胞克隆的均为抗体阳性为止。如此获得3C12和3D6细胞株。
7.杂交瘤细胞系的建立将抗体阳性的3C12和3D6单克隆细胞扩大培养，建立杂交瘤细胞系，每隔一周进行一次抗体检测。当杂交瘤细胞系达到一定的数量时，冻存细胞，留取上清用于测定其单克隆抗体的效价。杂交瘤细胞株体外连续培养1个月后液氮冻存，复苏后仍能稳定分泌Sp17单克隆抗体。
8.腹水单克隆抗体的制备将液体石蜡(0.5ml/只)注射到小鼠腹腔中，14天后将抗体阳性的杂交瘤细胞(0.5ml/只)注入小鼠腹腔中。当小鼠腹部明显膨大，用8号针头抽取小鼠腹水，每隔4天同法抽取，直至小鼠死亡。3000rpm离心腹水10分钟，弃上层油脂和不溶物以及下层各种细胞和不溶物，吸取淡黄色上清，加入等体积的甘油(含20g/L的Na2HPO4)，分装后-20℃冰箱保存。
实施例3 抗Sp17单克隆抗体的效价测定采用ELISA法。用Sp17蛋白(1mg/L)包被聚苯乙烯板微孔(100μl/孔)，4℃过夜。次日，PBS-T洗板3次，按200μl/孔加入50g/L脱脂奶粉封闭37℃ 2小时，PBS-T洗板3次。加入待测样本(杂交瘤细胞株的培养上清，或系列稀释的小鼠腹水单克隆抗体)，37℃孵育1小时。PBS-T洗板3次，加入HRP-羊抗鼠IgG(1∶3000稀释)，37℃孵育1小时。PBS-T洗板3次，每孔加入TMB-H2O2溶液，37℃孵育10分钟。加2滴1mol/L H2SO4终止反应，在波长450nm用酶联免疫检测仪比色。结果杂交瘤细胞株3C12和3D6的培养上清抗体效价分别为1∶64和1∶32；腹水的抗体效价分别为1∶105和1∶5×104。
实施例4 Western blot印迹试验将表达重组Sp17大肠杆菌总蛋白印迹到硝酸纤维素滤膜上。含50g/L脱脂奶粉的PBS-T封闭过夜，PBS-T漂洗3次，分别加入2种单克隆抗体(1∶1000稀释)孵育1小时，PBS-T漂洗3次，加入HRP-羊抗鼠IgG(1∶2000)孵育1小时，PBS-T漂洗3次。最后，加入DAB显色液进行显色反应。显色反应后，仅在重组蛋白条带位置上出现棕黄色条带，其他菌体蛋白条带未见显色(见图5)。
实施例5 单克隆抗体亚型的测定用IsoStrip小鼠单克隆抗体亚类(型)测定试剂盒测试。留取杂交瘤细胞株3C12或3D6的培养上清，用PBS(pH 7.4)将其进行10倍稀释，将150μl稀释液滴加到测试试管中，稍加涡旋试管使蓝色胶乳完全重悬，将抗体亚型测定试纸条的黑色一端插入到试管内底部，待蓝色的阳性控制线条出现时，取出测试条，2分钟后读取结果。结果判断在测试条上抗体亚型反应区出现蓝色直线条带，即为阳性结果，正确读取对应的亚型。结果杂交瘤细胞株3C12和3D6的抗体亚型分别为IgG1和IgM，轻链均为κ型。如图6所示。
实施例6 免疫组化试验鉴定单克隆抗体与天然Sp17的特异性反应a.解剖大鼠取睾丸，甲醛固定，石蜡包埋，连续切片。石蜡切片脱蜡，0.03％甲醇-H2O2孵育30分钟，微波炉中煮沸1分钟。10％羊血清封闭30分钟，PBS-T洗3次，一抗为本发明单克隆抗体Sp17 mAb(1∶1000)，未免疫小鼠血清为阴性对照，4℃孵育过夜，漂洗3次，加HRP-羊抗鼠IgG(1∶3000)，37℃孵育1小时，漂洗3次，DAB底物溶液显色10分钟，苏木素复染1分钟，脱水，透明，封片，在光学显微镜下观察并照像，观察单克隆抗体与组织中各类细胞的反应性(图7)。
b.取前列腺癌患者去势治疗手术切除的正常老年睾丸作组织切片，同样进行免疫组化分析，观察单克隆抗体与与组织中各类细胞的反应性(图8)。
c.阻断试验为了进一步鉴定本发明单克隆抗体的特异性，进行了阻断试验，即向单克隆抗体溶液中加入纯化的Sp17蛋白(100mg/L)，于37℃孵育30min后，再用该单克隆抗体溶液进行免疫组化染色，结果显示，本发明单克隆抗体与睾丸、精液标本及卵巢癌组织的阳性反应均可被阻断(图9)，从而证明本发明单克隆抗体所结合的组织中的蛋白是Sp17蛋白。
d.留取行常规精液检查的人精液标本，液化后1000rpm离心5分钟，PBS-T洗3次，将精子浓度调整到5×106/ml，涂片，自然干燥，酒精灯上过火3次固定。10％羊血清封闭30分钟，洗3次，加抗Sp17单克隆抗体(1∶400)，未免疫小鼠血清为阴性对照，37℃孵育2小时，漂洗3次，加HRP-羊抗鼠IgG(1∶300)，37℃孵育1小时，漂洗3次，DAB溶液显色10分钟，苏木素复染，封片，在高倍镜下观察并拍摄照片(图10)。
免疫组化和细胞免疫化学染色分析结果显示，抗Sp17单克隆抗体能与人和大鼠睾丸中精母细胞、精细胞和成熟精子以及人精液中的精子细胞表达的Sp17发生特异性结合反应，细胞染成黄褐色(见图7、8、10)。
实施例7用本发明单克隆抗体进行肿瘤的免疫组化分析用10％中性甲醛固定卵巢原发上皮性癌、子宫内膜癌，4℃固定过夜。梯度酒精(25％、50％、75％和100％)脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，修块，做连续切片，铺片。石蜡切片脱蜡至水，0.03％甲醇-H2O2孵育30分钟，微波炉中煮沸1分钟。10％羊血清封闭30分钟，PBS-T洗3次，滴加本发明抗Sp17单克隆抗体(1∶1000稀释)，以未免疫小鼠血清为阴性对照，4℃孵育过夜。PBS-T漂洗3次，加HRP-羊抗鼠IgG(1∶3000稀释)，37℃孵育1小时。PBS-T漂洗3次，DAB显色10分钟，水洗终止反应。苏木素复染1分钟，脱水，透明，DPX封片。用光学显微镜观察并照像(见图11、12)。结果表明本发明单克隆抗体可用于检测卵巢癌和子宫内膜癌组织中Sp17的异常表达，效果良好。
实施例8用本发明单克隆抗体进行腹水中转移癌细胞的检测将病人腹水细胞收集固定在载玻片上，10％羊血清封闭30分钟，PBS-T洗3次，滴加本发明抗Sp17单克隆抗体(1∶1000稀释)，以未免疫小鼠血清为阴性对照，4℃孵育过夜。PBS-T漂洗3次，加HRP-羊抗鼠IgG(1∶3000稀释)，37℃孵育1小时小时。PBS-T漂洗3次，DAB显色10分钟，水洗终止反应。苏木素复染1分钟，DPX封片。用光学显微镜观察并照像(见图13、14)，图中细胞质被染色为黄褐色者为癌细胞，表明本发明单克隆抗体可有效检测腹水癌细胞中异常表达的Sp17蛋白。
序列表<110>中国人民解放军南京军区南京总医院<120>一种精子蛋白单克隆抗体及其制备方法与用途<160>3<210>1<211>456<212>DNA<213>sp17天然序列<400>1atgtcgattc cattctccaa cacccactac cgaattccac aaggatttgg gaatcttctt 60gaagggctga cacgcgagat tctgagagag caaccggaca atataccagc ttttgcagca 120gcctattttg agagccttct agagaaaaga gagaaaacca actttgatcc agcagaatgg 180gggagtaagg tagaagaccg cttctataac aatcatgcat tcgaggagca agaaccacct 240gagaaaagtg atcctaaaca agaagagtct cagatatctg ggaaggagga agagacatca 300gtcaccatct tagactcttc tgaggaagat aaggaaaaag aagaggttgc tgctgtcaaa 360atccaagctg ccttccgggg acacatagcc agagaggagg caaagaaaat gaaaacaaat 420agtcttcaaa atgaggaaaa agaggaaaac aagtga 456<210>2<211>31<212>DNA<213>上游引物人工序列<400>2ccacgcacat atgtcgattc cattctccaa c 31
<210>3<211>30<212>DNA<213>下游引物人工序列<400>3cggggatcct cacttgtttt cctctttttc 30
权利要求
1.一种精子蛋白单克隆抗体，该单克隆抗体是由保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏号为CGMCC No.1434的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其抗原结合片段保持该单克隆抗体的结合特征。
3.分泌权利要求1所述单克隆抗体的无限增殖细胞系。
4.根据权利要求3所述的无限增殖细胞系，为杂交瘤细胞系。
5.根据权利要求4所述的无限增殖细胞系，其中杂交瘤细胞系为保藏于CGMCC保藏号为CGMCC No.1434的杂交瘤细胞系。
6.如权利要求1所述的单克隆抗体的制备方法，其特征在于包括以下步骤a、克隆人或动物的一种精子蛋白的基因；b、将克隆的人或动物精子蛋白的基因插入表达载体，构建成重组表达载体；c、将构建的重组表达载体转化感受态大肠杆菌，经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导获得该精子蛋白的高效表达产物，再经亲和层析，得到纯化的该精子蛋白的重组蛋白；d、用纯化的该重组蛋白接种小鼠，取其脾淋巴细胞与小鼠Sp2/0骨髓瘤细胞融合，建立杂交瘤细胞系；e、从上述杂交瘤细胞系中筛选分泌该精子蛋白抗体的杂交瘤细胞株，选出最稳定、抗体活性最高的细胞株，它们所产生的抗体即为权利要求1所述的单克隆抗体。
7.根据权利要求6所述的单克隆抗体的制备方法，其特征在于所述克隆人或动物精子蛋白的基因是用逆转录PCR法从人或动物睾丸mRNA中扩增出精子蛋白Sp17的cDNA。
8.根据权利要求6所述的单克隆抗体的制备方法，其特征在于所述表达载体优选pET-28a(+)。
9.一种用于诊断肿瘤的试剂组合物，该组合物含有作为活性成分的有效量的权利要求1所述的单克隆抗体。
10.权利要求1所述的单克隆抗体在制备肿瘤诊断试剂中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种精子蛋白单克隆抗体及其制备方法和用途。该单克隆抗体是由保藏号为CGMCC No.1434的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体；该制备方法通过克隆人或动物精子蛋白的基因；将克隆的基因插入表达载体，构建重组表达载体；用重组表达载体转化感受态大肠杆菌，诱导表达，亲和层析，得到纯化的该精子蛋白的重组蛋白；用该重组蛋白接种小鼠，取其脾淋巴细胞与小鼠Sp2/0骨髓瘤细胞融合，建立杂交瘤细胞系，从中筛选出分泌该精子蛋白抗体最稳定、抗体活性最高的杂交瘤细胞株，它们所产生的抗体即为所需的单克隆抗体；该单克隆抗体可制备肿瘤诊断试剂。该单克隆抗体的具有高度特异性和强亲和力，制备方法简单高效。
文档编号C12N15/12GK1781944SQ200510094178
公开日2006年6月7日 申请日期2005年9月1日 优先权日2005年9月1日
发明者李芳秋, 杨爱龙 申请人:中国人民解放军南京军区南京总医院