专利名称：一种抗病免疫和杀菌功能融合蛋白hcml基因及其蛋白质的制作方法
技术领域：
本发明“一种抗病免疫和杀菌功能融合蛋白hcm1基因及其蛋白质”属于生物技术领域，专用于通过基因工程技术研制生物农药和改善植物抗病性及其他有益生产性状。
背景技术：
hpa1基因来自水稻条斑病细菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)RS105菌株，是过敏反应和致病性(hypersensitive response and pathogenicity，hrp)基因簇成员。该菌株均为公知公用菌株。hpa1基因表达的蛋白质具有诱导抗病性和促进植物生长等有益效应。hpa1基因编码的蛋白质HarpinXooc具有Harpin蛋白家族的共同特征蛋白质亲水性，对热稳定，等电点为酸性4.5左右，与报道的Harpins蛋白家族成员HarpinEa和HarpinPss不同之处在于HaprinXooc含有一个半胱氨酸，1～3μg/ml可诱导植物产生过敏反应的一种类似细胞编程死亡(PCD)。本发明的前一个发明“一种编码植物生长调节剂的基因表达产物及其用途”(专利号ZL00135403.5)已对从植物病原黄单胞菌中获得的Harpin蛋白以及在体外直接应用进行了专利保护。
蛋白质性质的具有抑菌或/和杀菌作用的多为抗菌肽类(antimicrobial peptide)。Cecropin家族的主要成员多为37氨基酸大小的Cecropin A。线性的Cecropin A由2个α螺旋(helix)组成，可以结合在病原微生物的细胞膜上，通过形成离子通道或离子泵导致微生物的死亡。N-端的α螺旋是活性所需的最基本结构(KLFKKIEKV)。抗菌肽广泛存在于植物、动物和微生物中。
另一类抗菌肽也引起广泛关注，即蜂毒素(bee venom toxin，melittin)。Melittin也是阳离子型抗菌肽，约26个氨基酸大小，对细菌具有裂解作用，对真核细胞具有溶血性和毒性作用。也有两个α螺旋组成，C-端的α螺旋是活性所需的最基本结构(AVLKVLTTGL)。
植物基因工程是以具有明确功能的外源基因作为目的基因，通过一定的技术路线转化植物后随机整合到植物基因组中，使其在植物体内表达，来改善植物的抗病、抗虫和其他有益性状。如苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)杀虫蛋白可以作为生物制剂喷洒植物进行害虫防治，基因转化棉花后，转基因棉对棉铃虫也有抗性(A 01N63/02 CN95113498.1A)；抗菌肽(Cecropin)基因转化烟草、马铃薯和水稻后，转基因植物表现对这些植物上的细菌病害有抗性(贾士荣，1993)。通过转基因技术还可以改善作物品质如耐贮性、耐盐性、氨基酸品质和植物脂质等。
发明内容
技术问题 本发明的目的是提供作为生物农药和转基因植物目的使用的植物抗病免疫和杀菌功能融合基因hcm1，其基因产物具有诱导植物体内产生抗病免疫功能和在体外具有杀菌功能。利用该目的基因，可以通过基因工程方法定向表达融合蛋白并将其研制为生物农药在植物上进行直接使用，也可通过转基因方法获得转基因植物或通过微生物重组获得遗传重组体从而获得作为商业用途的品种、品系或作为基因资源在生产上直接使用或进行农业生物育种和转基因植物以提高作物抗病、抗虫性状和改善农作物其他生产性状等。
技术方案一种来自水稻条斑病细菌抗病激活蛋白harpin编码基因hpa1通过polylinker(DPGGGFGGKW)，与抗菌肽(Cecropin)N-端的α螺旋KLFKKIEKV连接，再通过自由环(GQGIG)与蜂毒素(Melittin)C-端的α螺旋AVLKVLTTGL连接，构建成融合蛋白编码基因hcm1(hpa1-cecropin-melittin)。
本发明一种抗病免疫和杀菌功能融合蛋白hcm1基因，其序列为SEQ ID NO.1。
hcm1基因编码的融合蛋白质，其序列为SEQ ID NO.2。
上述一种抗病免疫和杀菌功能融合蛋白hcm1基因，是由以下方法构建而成依据Cecropin A和Melittin多肽序列，将Hpa1和Cecropin A(CA)的α螺旋结构KLFKKIEKV以及Melttin(ME)的α螺旋结构AVLKVLTTGL通过polylinkerDPGGGFGGKW以及自由环GQGIG进行连接，构建为融合基因hcm1Hpa1-Cecropin-Melittin；利用引物hpa1-F1(SEQ ID NO.3)5’-CATATGAACTCTTTGAACACACAATTC-3’和hpa1-R1(SEQ ID NO.4)5’-CTTACCGCCGAACCCGCCGCCCGGATCCTGCATCGATCCGCTGTCGTTC-3’通过PCR从水稻条斑病细菌中扩增得到hpa1基因以及多联器部分polylinker；以第一轮PCR产物为模板，利用引物hpa1-F1以及引物Ca-R1(SEQ ID NO.5)5’-CAATCTTCTTAAAGAGTTTCCACTTACCGCCGAACCCGCCGCCCGGATC-3’扩增得到hpa1∷polylinker-Ca部分；以第二轮PCR产物为模板，以hpa1-F1以及Ca-R2(SEQ ID NO.6)5’-CTTAAGCACAGCGCCAATGCCTTGACCCACTTTTTCAATCTTCTTAAAGAGTTTC-3’为引物，PCR扩增得到hpa1∷polylinker∷Ca-hinge部分；以第三轮PCR产物为模板，以hpa1-F1以及Me-F1(SEQ ID NO.7)5’-CTCGAGCTAGAGACCCGTGGTGAGCACCTTAAGCACAGCGCCAATGC-3’为引物，PCR扩增得到hpa1∷polylinker∷Ca∷hinge∷Me融合基因，命名为hcm1基因。
本发明所提供的用于生物农药和转基因植物的目的基因hcm1，其特征在于1.hcm1基因的来源 将水稻条斑病细菌的Hpa1和Cecropin A(CA)的α螺旋结构(KLFKKIEKV)以及Meltin(ME)的α螺旋结构(AVLKVLTTGL)通过polylinker(DPGGGFGGKW)以及自由环(GQGIG)进行连接，构建为融合基因hcm1(Hpa1-Cecropin-Melittin)。融合蛋白质的N端为Hpa1多肽，C端为Meltin(ME)的α螺旋结构(AVLKVLTTGL)，Cecropin A(CA)的α螺旋结构(KLFKKIEKV)以及Meltin(ME)的α螺旋结构(AVLKVLTTGL)是通过GQGIG进行连接的，polylinker位于融合蛋白质的中间。
2.hcm1基因产物的理化特征 hcm1基因大小为516bp，编码171个氨基酸的蛋白质，等电点为pI5.4，对热稳定。hcm1基因构建在表达载体上获得的蛋白质可在烟草上激发产生过敏反应，对植物病原菌的生长有抑制作用，在植物上使用可促进植物生长、提高产量和诱导植物产生抗病免疫作用。融合蛋白质Hcm1制成制剂，可作为防治植物病害的生物农药进行使用。
3.hcm1转基因植物技术策略 将hcm1基因构建在双元质粒pBI121的35S启动子与标记基因uid之间的多酶切(XbaI和BamHI)克隆位点上，转化或三亲交配法转移到根癌土壤杆菌EHA105中。用胚转化法感染水稻细胞，转化的植物组织在含Km的培养基中再生植株并于光照培养箱中生长获得T1代种子。
4.hcm1转基因植物的特征 hcm1基因可用作目的基因进行转基因植物。含hcm1基因的转基因作物可获得对不同病虫害的广谱抗性和改善有益生产性状。在转基因植物中可以检测到hcm1基因的存在，并可用RT-PCR方法检测到其在转录水平上的表达。同时，用RT-PCR和Northern印迹杂交等分子生物学等方法可检测出防卫反应标志基因的表达，如GST1、PR-1a和PR-1b等。
本发明所提供的hcm1基因，其蛋白质产物具有抗病免疫和杀菌功能，可用作植物基因工程的目的基因，用于生物农药研制、转基因植物及生物技术育种等商业用途。
有益效果本发明依据Cecropin A和Melittin多肽序列，将Hpa1和Cecropin A(CA)的α螺旋结构(KLFKKIEKV)以及Meltin(ME)的α螺旋结构(AVLKVLTTGL)通过polylinker(DPGGGFGGKW)以及自由环(GQGIG)进行连接，构建为融合基因hcm1(Hpa1-Cecropin-Melittin)。该融合基因经表达后获得的融合蛋白Hcm1，可赋予植物产生抗病免疫功能，可抑制植物病原菌的生长。基因产物可以研制为生物农药用于植物病害的控制。
将融合蛋白Hcm1制剂配制成水溶液，终浓度为15-30μg/ml。生测时对植物病原菌的生长有抑制作用；注射烟草叶片有产生过敏反应的能力；在作物生长季节的苗期、分蘖期、初花期、初果期或灌浆期进行喷雾使用2-3次，可提高作物生长量10-10％，提高产量6％以上，诱导作物产生抗病性与常规化学杀菌剂相当。
作为生物农药目的基因hcm1，其基因产物具有在非寄主植物上激发过敏反应、诱导植物产生广谱抗病性和对植物病原菌具有杀菌功能，可以通过基因工程方法构建在任何能够表达基因产物的表达系统上，以基因工程的方法获取hcm1基因产物，并将其研制为生物农药，用于防治植物病害。
hcm1转基因植物是将hcm1基因构建在植物表达的Ti-质粒双元载体pBI121上。以根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的方法，转化水稻获得了转基因植株，在温室和大田鉴定转基因植株的抗病性。hcm1转基因植物对真菌、细菌和病毒病害的抗病性均有明显增强。水稻的转hcm1基因植株还表现耐弱光、耐低温、株型矮化、多分蘖等优良生产性状。
作为转基因目的基因hcm1，可以整合到植物基因中，并在植物中表达，赋于植物对病害的广谱抗性、对病原菌具有杀菌功能以及其他生产性状的改善，表达hcm1基因的转基因水稻中可以检测到hcm1基因和防卫反应相关基因GST1、PR-1a、PR-1b和EF-1a等。hcm1基因的转基因植物品系可以直接培育植物新品种或作为基因资源进行常规和生物技术育种。
四
图1、hcm1融合基因核甘酸序列和Hcm1蛋白的氨基酸序列特征1-411bp为hpa1基因，基因产物为harpinXooc蛋白质；DPGGGFGGKW为多联元件(polylinker)；KLFKKIEKV为抗菌肽(Cecropin)N端的α-螺旋结构；GQGIG为自由环(flexible hinge)；AVLKVLTTGL为蜂毒素(Melittin)C端的α-螺旋结构图2、hcm1基因作为目的基因构建转化植物的重组质粒pBI121∷hcm1的特征HHindIII；SSph I；PPst I；XXba I；BBamH I；SmSma I；SaSac I；EEcoR I五具体实施方式
实例1植物抗病免疫与杀菌功能hcm1基因的表达产物与直接使用水稻条斑病细菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)hrp基因簇由本发明所在实验室获得(accession No.AY875714)。本发明依据Cecropin A和Melittin多肽序列，将Hpa1和Cecropin A(CA)的α螺旋结构(KLFKKIEKV)以及Melttin(ME)的α螺旋结构(AVLKVLTTGL)通过polylinker(DPGGGFGGKW)以及自由环(GQGIG)进行连接，构建为融合基因hcm1(Hpa1-Cecropin-Melittin)。
利用引物hpa1-F1(SEQ ID NO.3)5’-CATATGAACTCTTTGAACACACAATTC-3’和hpa1-R1(SEQ ID NO.4)5’-CTTACCGCCGAACCCGCCGCCCGGATCCTGCATCGATCCGCTGTCGTTC-3’通过PCR从水稻条斑病细菌中扩增得到hpa1基因以及多联元件部分(polylinker)；以第一轮PCR产物为模板，利用引物hpa1-F1以及引物Ca-R1(SEQ ID NO.5)5’-CAATCTTCTTAAAGAGTTTCCACTTACCGCCGAACCCGCCGCCCGGATC-3’扩增得到hpa1∷polylinker-Ca部分；
以第二轮PCR产物为模板，以hpa1-F1以及Ca-R2(SEQ ID NO.6)5’-CTTAAGCACAGCGCCAATGCCTTGACCCACTTTTTCAATCTTCTTAAAGAGTTTC-3’为引物，PCR扩增得到hpa1∷polylinker∷Ca-hinge部分；以第三轮PCR产物为模板，以hpa1-F1以及Me-F1(SEQ ID NO.7)5’-CTCGAGCTAGAGACCCGTGGTGAGCACCTTAAGCACAGCGCCAATGC-3’为引物，PCR扩增得到hpa1∷polylinker∷Ca∷hinge∷Me融合基因，命名为hcm1基因。
PCR扩增条件为94℃/4min+(94℃/30 sec+60℃/min+72℃/2min)×35循环+72℃/7min。最终PCR产物纯化后经NdeI和XhoI酶切，连接于表达载体pET21a上，获得重组质粒为pEHCM1(pET30a∷hcm1)。
将pEHCM1转化大肠杆菌BL21(BL21/pET30a∷hcm1)得到的重组微生物BLHCM1单菌落接种于20ml的LB+Km 2获得重组微生物BLHCM10μg/ml中37℃下培养6h，将1M的IPTG加入其中使终浓度达1mM，37℃下培养3h后离心收集菌体，后于100℃下水浴10min，冷却后12000rpm离心10min，取上清注入烟草叶片叶肉细胞中，24h内产生过敏反应(hypersensitive response，HR)。取3μl上清液进行12％SDS-PAGE电泳，根据标准蛋白质的分子量推算，该表达蛋白的分子量约为17kDa，该蛋白的表达量约占总蛋白的15％。圆盘等电聚焦电泳(IEF)测定融合蛋白质的等电点pI为5.4。融合基因hcm1全长516bp，编码171个氨基酸的蛋白质。hcm1融合基因的核苷酸序列和Hcm1融合蛋白的氨基酸序列如图1所示。
将遗传重组微生物BLHCM1(BL21/pEHCM1)单菌落接种于LB+Km20μg/ml+IPTG1mM/L中于37℃下培养16～20h，通氧量为0.5L/分，转速为110转/分。离心(5,000rpm)10min收集菌体，加1/40发酵体积的20mM Tris缓冲液(pH9.0)充分悬浮，加10μl/25ml的溶菌酶(100mg/ml)，冰浴10min后，加0.5ml 25ml PMSF(20mg/ml)，超声波(20KHz)破碎菌体10min，再加0.5ml/25ml的PMSF，混匀后再超声波破碎10min。10000rpm离心10分钟，取上清于100℃水浴下10min，冷却后12,000rpm离心10min收集上清液。上清液中含蛋白质的浓度达600μg/ml。LB为培养基(1L中含5g酵母粉、10g聚蛋白胨，10gNaCl，pH7.0)。Km为卡那霉素，IPTG为异丙基硫代-β-半乳糖苷，PMSF为苯甲基磺酰氟，Tris为三羟甲基氨基甲烷。下同。
将高产融合蛋白Hcm1的菌株BLHCM1于LB+Km 20μg/ml的斜面上划线，37℃下培养过夜。单菌落BLHCM1接种于100ml LB+Km 20μg/ml中，于37℃，110转分条件下振荡培养12h。在30L发酵罐中加入20L LB+Km25μg/ml培养液，1％量接入母种，37℃，110转/分和0.5L/分通气量的条件下培养12h。在1吨发酵罐中加入700L的LB灭菌(120℃，2kg压力，30分钟)后通过微孔滤膜加入Km 40μg/ml+IPTG 1mM/L作为发酵液，1％体积接入栽培种，32℃，110转分和1L/分通气量条件下发酵培养20h，后于大离心机中4500转/分离心10分钟收集菌体，加入1/40体积20mMTris缓冲液(pH9.0)悬浮菌体，加入1/50体积的PMSF(20mg/ml)，100℃蒸汽破碎菌体10分钟，冷却后离心收集产物，加入填充料干燥制成颗粒状微胶囊，使融合蛋白的有效含量达1％(W/W)。
将融合蛋白Hcm1制剂配制成水溶液，终浓度为15-30μg/ml。生测时对植物病原菌的生长有抑制作用；注射烟草叶片有产生过敏反应的能力；在作物生长季节的苗期、分蘖期、初花期、初果期或灌浆期进行喷雾使用2-3次，可提高作物生长量10-10％，提高产量6％以上，诱导作物产生抗病性与常规化学杀菌剂相当。
水稻细条斑病菌(X.o.pv.oryzicola)为公知公用菌株。PET21a载体和大肠杆菌BL21菌株见文献Sambrook J.，Fritsch EF.，and Maniatis T.1989.Molecular CloningA LaboratoryManual.2nded.Cold Spring Harbor Laboratory Press。
实例2转基因植物表达载体pBIHCM1(pBI121∷hcm1)的构建用于构建双元转化一表达载体的质粒的是由T-DNA改造而来，其中除T-DNA 25bp重复序列(LB和RB)，胭脂碱合成酶基因的启动子(P-nos)和终止子(T-nos)外，还有在原核生物(细菌)中作为选择标记使用的nptI和在真核生物(植物)中作为选择标记使用的nptII，用于选择的抗生素均为Km和G-418。另外在pBI121中还有在真核生物表达的花椰菜花叶病毒的启动子35S(p35S)和β-葡糖醛酸酶(Gus)基因uidA。作为目的基因使用的hcm1基因插入在pBI121质粒的p35S和uid之间的多酶切克隆位点上(图2)，获得转基因植物表达载体pBIHCM1(pBI121∷hcm1)。本发明所用内切酶为XbaI和BamHI。双元载体pBI121为公知公用载体。
实例3hcm1基因在转基因植物中的表达构建的双元转化载体质粒pBI121∷hcm1，可以直接转化含vir区辅助质粒不带Km抗性的pTiBo542衍生质粒的感受态根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105中。EHA105是EHA101(C58/pTiBo542)的Km敏感衍生株。也可以用含pBI121∷hcm1的大肠杆菌DH5α，在帮助质粒pRK2013存在情况下，通过三亲交配转移到EHA105中。同时含有辅助质粒pTiBo542(Kms)和转化质粒(pBI121∷hcm1)的根癌土壤杆菌EHA105用于植物细胞的转化。重组根癌土壤杆菌转化植物细胞的方法用叶碟法、胚转化法或花粉管导入方法。外植体在含Km的植物再生培养基中筛选被转化的再生植株(T0代)。
T1代种子催芽时用Km(150μg/ml)浸泡12小时进行筛选转化植株。
对T1代植株按株系检测转化频率以及植株中hcm1基因的表达。PCR和Southern印迹杂交法可检测转化植株叶片中hcm1基因和P-35S启动子，定量RT-PCR方法可检测植株叶片中hcm1基因的RNA积累。
根癌土壤杆菌EHA105为公知公用菌株，基因转化和转化细胞的植株再生方法为转基因植物的常规方法。
实例4hcm1基因转基因水稻的表型特征
hcm1基因转基因水稻的T1代种子分别播种在温室和病害流行区隔离田块中，用人工接种和诱发行感染法测定hcm1转基因水稻株系对稻瘟病(Magnaporthe grisea)和水稻白叶枯病(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)的抗病型。人工接种法用常规喷雾(稻瘟病菌)和剪叶接种法(白叶枯病菌)。诱发行感染法是用稻瘟病菌人工喷雾接种感病品种籼优63，发病后移栽到病害鉴定圃的四周及畦间。畦面宽1.8米，株行距均为15厘米。诱发行水稻病斑上的孢子可以随风雨均匀随机扩散传播。感病株系和出发品种100％被感染发病。hcm1转基因水稻T1代单株对稻瘟病和对水稻白叶枯病均表现较强的抗性。用于转基因的亲本水稻品种有优质粳稻武育粳7号。除抗病表型有明显改善外，转基因株系还表现明显的耐弱光、耐低温和株型矮化等特点。hcm1转基因水稻品系命名为Hcm转基因抗优稻。
进行抗病性鉴定的水稻白叶枯病菌和稻瘟病菌均为公知公用。转基因亲本水稻品种武育粳7号是生产上使用的品种，公知公用。
实例5转hcm1基因水稻品系启动植物防卫反应的特征通过PCR和Southern印迹杂交方法可从水稻T1代植株中检测到hrfA基因的全长插入序列和外源p35S启动子，约占70％。hcm1转基因水稻T1代植株均不表现导致产生过敏反应的类似细胞编程死亡(PCD)的现象。用定量RT-PCR方法测定hcm1基因和抗病防卫相关基因表达，在转基因植物株系中可以检测到GST1、PR-1a、PR-1b等防卫相关基因的表达，而在亲本品系中不表达。PCR、Southern印迹杂交和RT-PCR方法是分子生物学常规研究方法。GST1，PR-1a和PR-1b是植物产生抗病性反应的标志性基因，公知和公用。
关于RS105陈功友、潘小玫、王金生，水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)化学诱变hrp基因突变体及相关性状的研究，植物病理学报，2001，31(3)199～207；关于植物基因工程分子操作Clark MS，Plant Molecular Biology，A Laboratory Manual，1997，Springer，Berlin Germany；关于基因重组分子操作Sambrook J，Russell D.W.，Molelcular cloning，A LaboratoryManual(3rded)，2001，Spring Harbor Laboratory Press关于克隆hpa1基因同源基因的PCR方法Weiguang Zhu，Mark M.Magbanua and Fran F.White identification of Two Novel hrp-Associated Genes in the hrp Gene Cluster ofXanthomonas oryzae pv.oryzae，Journal of Bacteriology，2000，182(7)1844-1853；关于双元载体pBI121Jefferson，R.A.，Kavanash，T.A.&Bevan，M.W.EMBO J.1987，6，3901-3907；关于cecropin和MelinttinMoerman L，Bosteels S，Noppe W，et al.2002.Antibacterialand antifungal properties of a-helical，cationic peptides in the venom of scorpions fromsouthern Africa.Eur.J.Biochem.269，4799-4810
序列表<110>南京农业大学<120>一种抗病免疫和杀菌功能融合蛋白hcm1基因及其蛋白质<130>说明书<140>00<141>2005-10-10<160>7<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>516<212>DNA<213>组合生物合成<220>
<221>gene<222>(1)..(516)<223>
<400>1atgaactctt tgaacacaca attcggcggc agcgcgtcca acttccaggt tgaccaaagc60cagaacgcgc aatccgattc gagccagggc agcaatggca gccagggtat ctcggaaaag120caactggacc agttgctgtg ccagctcatc caggccctgc ttcagccgaa caaaaatgct180gaggaaggta agggtcagca gggtggcgag aatggcggtg gccagggcgg caatcagcag240gccgggaagg agaatggcgc ctcgccactc acccagatgc tgatgaatat cgtcggagag300attctccagg cgcagaatgg tggtggtgcc ggtggtgccg gcggcagcag cggcggcgac360tttggtggca gtttcgccag cagcttctcg aacgacagcg gatcgatgca ggatccgggc420ggcgggttcg gcggtaagtg gaaactcttt aagaagattg aaaaagtggg tcaaggcatt480ggcgctgtgc ttaaggtgct caccacgggt ctctag 516<210>2<211>171<212>PRT<213>组合生物合成<220>
<221>PEPTIDE<222>(1)..(171)<223>
<400>2Met Asn Ser Leu Asn Thr Gln Phe Gly Gly Ser Ala Ser Asn Phe Gln1 5 10 15Val Asp Gln Ser Gln Asn Ala Gln Ser Asp Ser Ser Gln Gly Ser Asn20 25 30Gly Ser Gln Gly Ile Ser Glu Lys Gln Leu Asp Gln Leu Leu Cys Gln35 40 45Leu Ile Gln Ala Leu Leu Gln Pro Asn Lys Asn Ala Glu Glu Gly Lys50 55 60Gly Gln Gln Gly Gly Glu Asn Gly Gly Gly Gln Gly Gly Asn Gln Gln65 70 75 80Ala Gly Lys Glu Asn Gly Ala Ser Pro Leu Thr Gln Met Leu Met Asn85 90 95
Ile Val Gly Glu Ile Leu Gln Ala Gln Asn Gly Gly Gly Ala Gly Gly100 105 110Ala Gly Gly Ser Ser Gly Gly Asp Phe Gly Gly Ser Phe Ala Ser Ser115 120 125Phe Ser Asn Asp Ser Gly Ser Met Gln Asp Pro Gly Gly Gly Phe Gly130 135 140Gly Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Glu Lys Val Gly Gln Gly Ile145 150 155 160Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly Leu165 170<210>3<211>27<212>DNA<213>组合生物合成<220>
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<400>6
cttaagcaca gcgccaatgc cttgacccac tttttcaatc ttcttaaaga gtttc55<210>7<211>47<212>DNA<213>组合生物合成<220>
<221>primer<222>(1)..(47)<223>
<400>7ctcgagctag agacccgtgg tgagcacctt aagcacagcg ccaatgc 4权利要求
1.一种抗病免疫和杀菌功能融合蛋白hcml基因，其序列为SEQ ID NO.1。
2.权利要求1所述一种抗病免疫和杀菌功能融合蛋白hcml基因编码的融合蛋白质，其序列为SEQ ID NO.2。
3.根据权利要求1所述一种抗病免疫和杀菌功能融合蛋白hcml基因，其特征在于，是由以下方法构建而成依据Cecropin A和Melittin多肽序列，将Hpal和Cecropin A(CA)的α螺旋结构KLFKKIEKV以及Melttin(ME)的α螺旋结构AVLKVLTTGL通过polylinkerDPGGGFGGKW以及自由环GQGIG进行连接，构建为融合基因hcmlHpal-Cecropin-Melittin；利用引物hpal-F1(SEQ ID NO.3)5’-CATATGAACTCTTTGAACACACAATTC-3’和hpal-R1(SEQ ID NO.4)5’-CTTACCGCCGAACCCGCCGCCCGGATCCTGCATCGATCCGCTGTCGTTC-3’通过PCR从水稻条斑病细菌中扩增得到hpal基因以及多联元件部分polylinker；以第一轮PCR产物为模板，利用引物hpal-F1以及引物Ca-R1(SEQ ID NO.5)5’-CAATCTTCTTAAAGAGTTTCCACTTACCGCCGAACCCGCCGCCCGGATC-3’扩增得到hpal::polylinker-Ca部分；以第二轮PCR产物为模板，以hpal-F1以及Ca-R2(SEQ ID NO.6)5’-CTTAAGCACAGCGCCAATGCCTTGACCCACTTTTTCAATCTTCTTAAAGAGTTTC-3’为引物，PCR扩增得到hpal∷polylinker∷Ca-hinge部分；以第三轮PCR产物为模板，以hpal-F1以及Me-F1(SEQ ID NO.7)5’-CTCGAGCTAGAGACCCGTGGTGAGCACCTTAAGCACAGCGCCAATGC-3’为引物，PCR扩增得到hpal∷polylinker∷Ca∷hinge∷Me融合基因，命名为hcml基因。
全文摘要
本发明“一种抗病免疫和杀菌功能融合蛋白hcml基因及其蛋白质”属于生物技术领域，专用于通过基因工程技术研制生物农药和改善植物抗病性及其他有益生产性状。将水稻条斑病细菌的Hpal和Cecropin A(CA)的α螺旋结构以及Meltin(ME)的α螺旋结构通过polylinker以及自由环进行连接，构建为融合基因hcml。hcml基因大小为516bp，编码171个氨基酸的蛋白质，等电点为pI5.4，对热稳定。hcml基因编码的蛋白质产物具有抗病免疫和杀菌功能，可用于生物农药研制、转基因植物及农业生物技术育种等商业用途。Hcml基因转基因植物可增强植物广谱抗病能力、对病原菌有杀伤作用并改善植物其他生产性状。
文档编号C12N15/09GK1786173SQ20051009477
公开日2006年6月14日 申请日期2005年10月13日 优先权日2005年10月13日
发明者陈功友, 张兵, 邹丽芳, 李玉蓉, 王金生 申请人:南京农业大学