专利名称：高中和活性抗肿瘤坏死因子单克隆抗体的可变区基因及其制备的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医学技术领域，涉及一种单克隆抗体基因，特别涉及一种高中和活性抗肿瘤坏死因子单克隆抗体(D2 mAb)的可变区基因其制备方法。
本申请是申请人2003年11月13日的专利申请，其在先申请号为200310105919.9，名称与本申请相同的分案申请。
背景技术：
肿瘤坏死因子(TNF)是由3个分子量为17kDa的亚单位组成的同源三聚体的可溶型蛋白质，主要由单核细胞和巨噬细胞产生。体内还存在分子量为26kDa的膜结合形式的TNF。TNF通过诱导血管内皮细胞表面细胞间黏附分子-1(ICAM-1)等黏附分子的表达，增加中性粒细胞和淋巴细胞的黏附作用，刺激巨噬细胞、中性粒细胞和血管内皮细胞分泌多种细胞因子和介质，引起炎症反应，导致骨和软骨等组织的损伤。目前认为革兰氏阴性杆菌或脑膜炎球菌引起的弥漫性血管内凝血、中毒性休克主要是由于细菌内毒素刺激单核/巨噬细胞产生大量的TNF，引起发热，心脏、肾上腺严重损害，呼吸循环衰竭，甚至引起死亡。TNF又称恶液素(cachectin)，可诱发机体发生恶液质(cachexia)。恶液质主要表现为进行性体重下降，食欲减退和顽固性机体消耗，其特征是肌肉和脂肪细胞衰竭(这是由于TNF使食欲减退，脂蛋白酶合成抑制所致)等。恶液质导致肿瘤患者死亡率升高。高浓度TNF还可引起心脏血管的变化和代谢紊乱。引起人类艾滋病的人类免疫缺陷病毒(HIV)感染时，血清中TNF可升高，而且与脑部病变的严重程度相关。TNF与移植排斥有关，人骨髓移植后，如果TNF水平升高，常有合并症发生；肾移植后发生排斥的患者，血清中TNF水平常见升高。局部缺血再灌注的动物可引起TNF增加；TNF可能是急性肝坏死形成的重要因素。成人呼吸窘迫综合征可能与缺血有关，其病情与支气管肺泡液中TNF水平相关。心肌梗死和急性脑梗塞患者TNF水平升高与病情严重程度有关。TNF与多种自身免疫性疾病有关。类风湿性关节炎局部TNF升高。TNF转基因小鼠可诱发慢性炎症性多发性关节炎，此变化可被有中和活性的TNF单克隆抗体(mAb)所阻断。多发性硬化症发病过程中，TNF可能与脱髓鞘病理变化有关。银屑病局部和血清中TNF水平均见升高。节段性肠炎与TNF水平的升高有关。重症肌无力和系统红斑狼疮(SLE)患者TNF可见升高。由此可见，TNF与感染性疾病、自身免疫性疾病、病毒感染、细菌感染、寄生虫感染、肿瘤等多种疾病有关。制定多种疾病生物学治疗的策略中，TNF成为关键的靶位。
抗TNF抗体于1987年由Cerami等报导，并获得专利(EPO Patentpublication 0212489，Mar.4，1987)。这些抗体被认为在免疫诊断和治疗细菌感染性休克方面具有重要的作用。同年，Rubin等报导了抗TNF的单克隆抗体，同时报导了分泌该抗体的杂交瘤细胞系、制备该抗体的方法，以及在免疫实验中的应用，该抗体获得了专利(EPO Patent publication 028868，Apr.22，1987)。Yone等于1988年报导了可用于免疫诊断的抗体，并获得EPO专利。该抗体特别用于Kawasaki′s和细菌感染的诊断。Kawasaki′s病人的体液中TNF含量升高，与病情的发展有关。另外，还有许多针对重组TNF的单克隆抗体，其中一些具有中和活性，还有一些通过表位的筛选，构建了测定TNF的ELISA方法和纯化重组TNF的亲和层析技术。
针对TNF的中和性抗血清或单克隆抗体在动物实验中对内毒素和细菌引起的病理改变有明显的阻断作用。TNF通过与细胞表面的TNF受体结合发挥作用，目前认为TNF与受体结合存在4个位点。中和性抗体主要通过对这4个位点的遮盖而阻断TNF的作用。TNF分子有20多种结合B细胞的表位，其中部分表位与受体结合位点重叠，结合这些表位的抗体具有中和活性，发挥对TNF的阻断作用。具有中和活性鼠源性mAb以及来源于它们的片段均具有潜在的治疗价值。然而，这些鼠源性mAb在人体使用时，由于其具有免疫原性，易引起人体的免疫反应，这种免疫反应可引起对抗体的清除以及免疫复合物介导的超敏反应。为了解决上述问题，建立了对鼠源性抗体改造的多种方法，如构建嵌合抗体或人源化抗体。在嵌合抗体构建过程中，最为重要的是获得具有良好特异性和中和活性鼠源性亲本抗体，克隆其轻链和重链可变区基因，然后将这两条基因与人的抗体恒定区基因连接，构建重组抗体基因。最后，将构建好的人-鼠嵌合抗体基因导入真核细胞中表达。在临床实验中，用抗TNF嵌合抗体治疗类风湿性关节炎和节段性肠炎取得了良好的效果，很好地控制了炎性反应。美国FDA于1998年和1999年分别批准抗TNF嵌合抗体用于临床治疗节段性肠炎和类风湿性关节炎。因此，筛选出特异性及中和活性良好的鼠源单克隆抗体，从中克隆出轻、重链可变区基因，具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种高中和活性抗TNF的可变区基因及其制备方法，并获得有高中和活性小鼠抗人TNF单克隆抗体(mAb)的重链可变区基因的核苷酸序列(包括其高变区的核苷酸序列)以及该基因编码的氨基酸序列。
实现上述发明目的的技术方案是(1)制备一组小鼠抗人TNF单克隆抗体，从中筛选出具有高中和活性的抗人TNF单克隆抗体；(2)克隆该单克隆抗体重链可变区基因；(3)获得该单克隆抗体重链可变区基因序列和氨基酸序列，确认该基因序列和相应蛋白序列的惟一性。
本发明选用高中和活性D2杂交瘤细胞株，从中克隆出重链可变区基因，测序后，得到其独特的核苷酸序列，为构建具有良好药用价值的抗人TNF嵌合抗体和人源化抗体等打下了良好的基础。
图1是本发明的D2VH基因序列(包括CDR1、CDR2和CDR3)及其编码的氨基酸序列；图2是D2VH基因序列和与其同源性最高的基因序列的同源性比较；图3是D2VH氨基酸序列和与其同源性最高的氨基酸序列的同源性比较。
基因序列342 ctgcagcagtctgggactgtgctggcaaggcctgggacttccgtgL Q Q S G T V L A R P G T S V297 aagatgtcctgcaaggcttctggctacaacttcaccagctactggK M S C K A S G Y N F TS Y W252 atgcactgggtaaaacagaggcctggacagggtctagaatggattM HW V K Q R P G Q G L E W I207 ggtgctctttttcctggaaacagtgatacgacctacaaggagatgGA L F P G N S D T T Y K E M162 ttgaagggcagggccaaactgactgcagccacatccgccagtattL K G R A K L T A A T S A S I117 gcctacttggagttcagcagcctgacaaatgaggattctgcggtcA Y L E F S S L T N E D S A V72 tattactgtgcaagaggcgatttcggcgctatggactactggggcY Y C A RG D F G A M D YW G27 caagggaccacggtcaccgtctcctca 1Q G T T V T V S SCDR1agctactggatgcacS Y W M HCDR2gctctttttcctggaaacagtgatacgacctacaaggagatgttgaagggcaggA L F P G N S D T T Y K E M L K G RCDR3ggcgatttcggcgctatggactacG D F G A M D Y具体实施方式
以下结合附图对本发明作进一步的详细说明。
可变区基因的完整核苷酸序列、其功能性片段的核苷酸序列(如CDR等)以及抗体可变区的氨基酸序列等，是嵌合抗体和人源化抗体构建的基础。为此，申请人用重组人TNF免疫BALB/c小鼠，制备了一组小鼠抗人TNF单克隆抗体。并利用单抗阻断TNF诱导L929细胞凋亡的实验，单抗阻断TNF诱导ECV304细胞ICAM-1表达的实验，以及单抗阻断TNF诱导NF-κB核转位的实验等，从中筛选出高中和活性的D2杂交瘤细胞株。该株杂交瘤细胞，具有稳定分泌抗体的能力。
1.技术方案及其路线1.1小鼠抗人TNF高中和活性单克隆抗体的制备1.1.1单克隆抗体的制备、纯化按常规方法，用重组人TNF(购自第四军医大学生物技术中心)免疫BALB/c小鼠(购自第四军医大学实验动物中心)，制备一组小鼠抗人TNF单克隆抗体。从中选择高效价的D2 mAb，按常规方法制备腹水。腹水经硫酸铵沉淀后，采用蛋白A亲和层析法纯化。用SDS-PAGE鉴定纯化抗体的纯度，纯化的D2 mAb的纯度达到91％。
1.1.2TNF mAb抑制TNF诱导L929细胞凋亡的实验用10％FCS DMEM培养基培养L929细胞(购置于武汉CCTCC)，调整细胞浓度为1×105/ml，加入至96孔细胞培养板，每孔100μl，培养过夜。另取96孔板，加入TNF(购自第四军医大学生物技术中心)、放线菌素D(购自华美公司)、不同浓度D2mAb或对照抗体，37℃孵育1h后转入已铺有L929细胞的96孔细胞培养板中，每孔100μl，TNF和放线菌素D的浓度分别为20U/ml和0.35μg/ml。同时设TNF(无mAb)和空白对照(无mAb和TNF)，继续培养16h，镜检后，用结晶紫染色，用酶标仪测定570nm波长的OD值。结果显示，D2 mAb对TNF(20U/ml)诱导L929细胞凋亡的抑制作用呈剂量依赖关系，能够使50％L929细胞存活的D2 mAb的浓度为0.16μg/ml。
1.1.3 TNF mAb抑制TNF上调ECV304细胞ICAM-1表达的实验ECV304细胞(购置于武汉CCTCC)用10％FCS RPMI1640培养基培养，调整细胞浓度为5×104/ml，铺于24孔细胞培养板，培养5h，使细胞贴壁。另取96孔细胞培养板，加入TNF、不同浓度D2 mAb和对照抗体，37℃孵育1h后，转入已铺有ECV304细胞的24孔细胞培养板中，TNF浓度为200U/ml，并设TNF(无mAb)和空白(无mAb和TNF)对照。继续培养48h后，消化、洗涤，用灭活兔血清封闭后，加入FITC标记的抗人ICAM-1抗体(购置于Ancell公司)或抗小鼠IgG1对照抗体(购自Serotec公司)，洗涤后，加入固定液，采用流式细胞术分析。结果表明，浓度为1.0μg/ml的D2 mAb对TNF上调ICAM-1表达水平的抑制率为70.1％。即使D2 mAb在0.1μg/ml的低浓度条件下，抑制率仍可达到60.1％，抑制作用呈剂量依赖关系。
1.1.4 TNF mAb抑制TNF诱导ECV304细胞NF-κB核转位的实验ECV304细胞用10％FCS RPMI 1640培养基培养。调整对数生长期的ECV304细胞浓度为5×104/ml，铺于75cm2细胞培养瓶内。待细胞铺满80％培养瓶底面积时，加入预先用不同浓度D2 mAb和对照mAb孵育的TNF，同时设立TNF(无mAb)和静止细胞(无mAb和TNF)对照。细胞培养液中TNF的浓度为200U/ml，mAb的浓度为10μg/ml或0.1μg/ml。刺激细胞1h后，弃去细胞培养液，用4℃预冷的0.15M pH7.4 PBS洗涤细胞2次，以除去残留培养液。将细胞在冰浴上刮至10ml PBS中，4℃ 1200rpm离心6min后弃上清，并于细胞沉淀中加入400μl 4℃预冷的缓冲液A(10mM pH7.9 HEPES、10mM KCl、0.1mM EDTA、1mM DTT和0.5mM PMSF)。冰浴放置15min后，加入25μl 10％NP-40，涡旋振荡15s。4℃13000rpm离心30min后弃上清，并用缓冲液A洗涤沉淀。于沉淀中加入100μl缓冲液B(20mM pH7.9 HEPES、400mM NaCl、1mM EDTA、1mM DTT和1mM PMSF)，冰浴放置15min，间以涡旋搅拌。4℃ 13000rpm离心10min后收集上清液，用Bradford法测定其蛋白含量后，置-70℃保存。凝胶迁移试剂盒和DNA 5′-端探针标记试剂盒均购自Promega公司。[γ-32P]ATP购自Amersham公司。用凝胶迁移实验鉴定mAb抑制TNF诱导ECV304细胞NF-κB核转位的作用，按试剂盒说明书所述操作。结果显示，D2 mAb在浓度为10μg/ml和0.1μg/ml的抑制率分别为94.2％和75.1％。
总之，用上述3种方法在不同水平的鉴定结果表明，D2单抗均有良好的中和活性。
1.2 D2 mAb重链可变区基因的克隆按下述方案，克隆编码重链可变区基因。
1.2.1 D2杂交瘤细胞的培养按常规方法复苏D2细胞，用含10％FCS的RPMI 1640培养基于37℃，5％CO2孵箱培养。
1.2.2总RNA的提取和cDNA第一链的合成用TRIZOL Reagent(购自GIBCO公司)，按说明书提取总RNA。cDNA第一链合成试剂盒购自GIBCO公司，按产品说明书进行反转录合成cDNA第一链。
1.2.3 PCR法扩增D2VH基因PCR扩增试剂盒购自TakaRa公司，以VHFOR和VHBACK引物，以反转录合成的cDNA第一链为模板进行PCR。反应体积50μl，反应条件为95℃ 30s，58℃1min，72℃1min，循环35次。引物序列为VHFOR Tga gga gac ggt gac cgt ggt ccc ttg gcc cca gVHBACKAgg tsm arc tgc ags agt cwg g1.2.4 PCR扩增产物的克隆和筛选PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳，用小量胶回收试剂盒(购自上海华舜生物工程有限公司)回收所需的片段，用DNA连接试剂盒(购自TakaRa公司)将该片段按说明书插入pGEM-T Easy载体(购自Promega公司)中。连接物转化E.coli XL-10(购自北京CGMCC)，用EcoR I限制酶(购自TakaRa公司)消化法筛选重组阳性克隆。用双脱氧核酸末端终止法测定基因序列(由上海生物工程技术服务有限公司完成)，测定结果参见附图1。
1.3 D2 mAb重链可变区基因的同源性分析确定测序无误后，按下述技术方案，鉴定基因的同源性。
1.3.1在GenBank+EMBL+DDBJ+PDB数据库中，进行核苷酸序列同源性分析(Blastn)分析结果表明，D2 mAb重链可变区基因与人Ig的V区基因的同源性最高，同源性为339/350(96％)(见附图2)。
1.3.2将可变区基因翻译成氨基酸序列，在non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+PIR+PRF蛋白质数据库中，进行氨基酸序列同源性分析(Blastp)。分析结果表明，D2 mAb重链氨基酸序列与编号为gi/886288/gb/AAA69494.1/的序列的同源性最高，同源性为104/114(95％)(见附图3)。
2.技术效果本发明采用重组人TNF免疫BALB/c小鼠，制备出一组小鼠抗人TNF mAbs。根据TNF参与炎症性病理损伤的主要机制，通过体外阻断实验，筛选出高中和活性的D2 mAb。在20U/mlTNF诱导L929细胞凋亡的实验中，能保护50％L929细胞存活的D2 mAb的浓度为0.16μg/ml。在200U/ml TNF上调ECV304细胞ICAM-1表达的实验中，浓度为的1.0μg/ml的D2mAb对诱导性ICAM-1表达的抑制率为70.1％。在200U/ml TNF诱导ECV304细胞NF-κB核转位的实验中，浓度为的10μg/ml的D2mAb对NF-κB的抑制率为94.2％。编码D2 mAb可变区的基因序列在构建对炎症、自身免疫性疾病等有治疗作用的嵌合抗体和人源化抗体等方面有巨大的潜在价值。
另外，编码D2 mAb的重链可变区基因的核苷酸序列和氨基酸序列同源性分析，未发现与本发明相同的基因序列，因此本发明具有惟一性和自主的知识产权。
3.最佳实施方式(1)人-鼠抗TNF嵌合抗体的构建
将本发明的D2 mAb重链可变区基因可插入通用型嵌合抗体的表达载体中，获得的嵌合基因转染真核细胞，用于制备对类风湿性关节炎和节段性肠炎等疾病有治疗作用的嵌合抗体。
(2)人源化抗体的构建将本发明的D2 mAb重链可变区基因的CDR区移植到人源可变区的FR中，形成CDR移植抗体(CDR-grafted antibody)也称重构抗体(reshapingantibody)或人源化抗体(humanized antibody)。利用CDR移植技术改造抗体，可以获得保持鼠源性亲本mAb的特异性，而又更加接近人抗体的新型抗体，用于制备对类风湿性关节炎和节段性肠炎等疾病有治疗作用的人源化抗体。
(3)可能根据本发明的基因序列及其编码的氨基酸序列，制备针对人TNF功能表位的其它生物制品(如单链抗体等)。
基因序列和和氨基酸序列342 ctgcagcagtctgggactgtgctggcaaggcctgggacttccgtgL Q Q S G T V L A R P G T S V297 aaga tgtcctgcaaggcttctggctacaacttcaccagctactggK M S C K A S G Y N F TS Y W252 atgcactgggtaaaacagaggcctggacagggtctagaatggattM HW V K Q R P G Q G L E W I207 ggtgctctttttcctggaaacagtgatacgacctacaaggagatgGA L F P G N S D T T Y K E M162 ttgaagggcagggccaaactgactgcagccacatccgccagtattL K G RA K L T A A T S A S I117 gcctacttggagttcagcagcctgacaaatgaggattctgcggtcA Y L E F S S L T N E D S A V72 tattactgtgcaagaggcgatttcggcgctatggactactggggcY Y C A RG D F G A M D YW G27 caagggaccacggtcaccgtctcctca 1Q G T T V T V S SCDR1agctactggatgcacS Y W M HCDR2gctctttttcctggaaacagtgatacgacctacaaggagatgttgaagggcaggA L F P G N S D T T Y K E M L K G RCDR3ggcgatttcggcgctatggactacG D F G A M D Y
权利要求
1.一种高中和活性抗肿瘤坏死因子单克隆抗体的可变区基因，其特征在于，基因序列和氨基酸序列如下342 ctgcagcagtctgggactgtgctggcaaggcctgggacttccgtgL Q Q S G T V L A R P G T S V297 aagatgtcctgcaaggcttctggctacaacttcaccagctactggK M S C K A S G Y N F TS Y W252 atgcactgggtaaaacagaggcctggacagggtctagaatggattM HW V K Q R P G Q G L E W I207 ggtgctctttttcctggaaacagtgatacgacctacaaggagatgGA L F P G N S D T T Y K E M162 ttgaagggcagggccaaactgactgcagccacatccgccagtattL K G RA K L T A A T S A S I117 gcctacttggagttcagcagcctgacaaatgaggattctgcggtcA Y L E F S S L T N E D S A V72 tattactgtgcaagaggcgatttcggcgctat ggactactggggcY Y C A RG D F G A M D YW G27 caagggaccacggtcaccgtctcctca 1Q G T T V T V S S
2.一种高中和活性抗肿瘤坏死因子单克隆抗体的可变区基因的制备方法，其特征在于，按以下步骤进行1)TNF单克隆抗体的制备、纯化和筛选用重组人TNF免疫BALB/c小鼠，制备一组小鼠抗人TNF单克隆抗体mAbs，按常规方法制备腹水；腹水经硫酸铵沉淀后，采用蛋白A亲和层析法纯化D2mAb，用SDS-PAGE鉴定抗体纯度；用mAbs抑制TNF诱导L929细胞凋亡的实验，mAbs抑制TNF上调ECV304细胞ICAM-1表达的实验，以及mAbs抑制TNF诱导ECV304细胞NF-κB核转位的实验，从中筛选出中和活性最高的D2单克隆抗体；2)D2mAb重链可变区基因的克隆按下述步骤克隆编码重链可变区基因①D2杂交瘤细胞的培养按常规方法复苏D2细胞，用含10％FCS的RPMI 1640培养基于37℃，5％CO2孵箱培养；②总RNA的提取和cDNA第一链的合成用TRIZOL Reagent提取总RNA，反转录合成cDNA第一链；③PCR法扩增D2VL和D2VH基因用VHFOR和VHBACK引物，以反转录合成的cDNA第一链为模板进行PCR；反应体积50μl，反应条件为95℃、30s；58℃、1min；72℃、1min；循环35次，得到扩增产物；引物序列为VHFOR Tga gga gac ggt gac cgt ggt ccc ttg gcc cca gVHBACKAgg tsm arc tgc ags agt cwg g④PCR扩增产物的克隆和筛选PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳，回收所需的片段，并将该片段插入pGEM-T Easy载体中，连接物转化E.coli XL-10，用限制酶消化法筛选重组阳性克隆，用双脱氧核酸末端终止法测定基因序列；3)D2 mAb重链可变区基因的同源性分析确定测序无误后，在GenBank+EMBL+DDBJ+PDB数据库中，进行核苷酸序列同源性分析，并将可变区基因翻译成氨基酸序列，在non-redundantGenBank CDS translations+PDB+SwissProt+PIR+PRF蛋白质数据库中，进行氨基酸序列同源性分析，鉴定基因的同源性。
全文摘要
本发明公开了一种高中和活性抗肿瘤坏死因子(TNF)单克隆抗体(D2 mAb)的可变区基因的制备方法。用重组人TNF免疫BALB/c小鼠，制备一组小鼠抗人TNF单克隆抗体。通过体外阻断实验，从中筛选出具有高中和活性的抗人TNF单克隆抗体。克隆该单克隆抗体重链可变区基因，获得该单克隆抗体重链可变区基因序列和氨基酸序列，确认该基因序列和蛋白序列的惟一性。本发明选用高中和活性D2杂交瘤细胞株，成功的从其中克隆出重链可变区基因，测序后，得到其独特的核苷酸序列，编码该可变区的基因序列在构建对炎症、自身免疫性疾病等有治疗作用的嵌合抗体和人源化抗体等方面有巨大的潜在价值。
文档编号C12N5/18GK1778921SQ200510106658
公开日2006年5月31日 申请日期2003年11月13日 优先权日2003年11月13日
发明者金伯泉, 刘雪松, 杨琨, 朱参胜 申请人:中国人民解放军第四军医大学