专利名称：聚3－羟基丁酸羟基己酸酯的一种新用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及聚3-羟基丁酸羟基己酸酯的一种新用途。
背景技术：
聚羟基脂肪酸酯(PHA)是很多细菌在特定条件下合成的一种细菌胞内高分子聚酯(Chen GQ，Wu Q，Zhao K，Yu HP&Chan A.Chinese J of Polymer Science 18(2000)389-396)，是新发现的细菌的生物能量来源之一，具有非常优良的性质，其生物可降解性、生物可相容性等特性已引起了学术界，特别是生物医学界的浓厚兴趣(Deng Y，Zhao K，Zhang XF，Hu P，Chen GQ.Biomaterials 23(20)(2002)4049-4056；Zheng Z，Deng Y，Lin XS，Zhang LX，Chen GQ.J Biomater Sci.PolymerEdn 14(2003)615-624)。其在药物缓释材料、可植入人体生物材料等高附加值方面的应用开发正在全球范围内展开，在人工器官，整形外科，创伤愈合上的应用前景尤其广阔(王常勇，袁晓辉，刘爽.中华外科杂志38(2000)269-271；Rivard CH，Chaput C，Rhalmis.Ann Chir 50(1996)651-658；颜晓慧，洪华容.北京生物医学工程19(2000)123-128；Knowles JC.J Med Engin Technol 17(1993)128-137)。
PHA具有以下的基本结构(Williams SF，Martin DP，Horowitz DM，et al.Int.J.Biol.Macromol.，1999，25111-121)-[CHR-(CH2)m-COO]n-m通常为1，当R为甲基时，PHA单体为羟基丁酸(HB)；R为乙基时为羟基戊酸(HV)；R为丙基时为羟基己酸(HH)；R为戊基时为羟基辛酸(HO)；R也可为饱和或不饱和，直链或含侧链及官能团的不同链长的烷基。少数情况下，m可为2或3。
3-羟基丁酸和3-羟基己酸的共聚物(3-羟基丁酸与3-羟基己酸共聚酯，聚3-羟基丁酸羟基己酸酯，PHBHHx)是PHA中的一种。PHBHHx具有良好的机械性能，是一种理想的可降解的“塑料”(Lageveen RG，Huisman GW，Preusting H，et al.Appl.Environ.Microbiol.，1988，542924-2932)。前期研究工作中发现，聚羟基丁酸羟基己酸PHBHHx以及PHB/PHBHHx共混物对细胞具有良好的亲和性，具有作为组织工程材料的应用潜力(Deng Y，Lin XS，Zheng Z，Deng JG，Chen JC，Ma H，ChenGQ.Biomaterials 24(2003)4273-4281；Wang YW，Chen GQ，Wu Q.Biomaterials24(2003)4621-4629)。并且发现，PHBHHx对成纤维细胞、成骨细胞、软骨细胞、神经细胞等具有比PHB和聚乳酸PLA有更好的生物相容性(Yang XS，Zhao K，ChenGQ.Biomaterials 23(5)(2002)1391-1397；Zheng Z，Deng Y，Lin XS，Zhang LX，Chen GQ.J Biomater Sci.Polymer Edn 14(2003)615-624)。
发明内容
本发明的目的是提供聚3-羟基丁酸羟基己酸酯(PHBHHx)的一种新用途。
本发明所提供的聚3-羟基丁酸羟基己酸酯(PHBHHx)的新用途是其在促进动物组织细胞生长中的应用。
所述的聚3-羟基丁酸羟基己酸酯是由下述结构式I和II表示的结构单元，以55-955-45的摩尔比组成的重均分子量为50,000到1,200,000的线型无规共聚物； 所述聚3-羟基丁酸羟基己酸酯可以是单一立体结构的化合物，如R型，或S型，也可以是内消旋化合物，还可为外消旋结构的化合物，其中，优选为R型，即聚(R)-3-羟基丁酸羟基己酸酯。
所述聚3-羟基丁酸羟基己酸酯颗粒直径为5nm-180μm，如5nm、10nm、65nm、500nm、5μm、75μm或180μm等。
所述聚3-羟基丁酸羟基己酸酯的使用浓度为0.001-0.1g/L培养基，优选为0.01g/L或0.02g/L培养基。
所述的组织细胞选自下述细胞中的任意一种成纤维细胞、成骨细胞、软骨细胞、神经细胞、皮肤细胞、血管上皮细胞、造血干细胞、肝细胞、淋巴细胞、角膜上皮细胞和肾细胞。
所述的组织细胞可为体外培养细胞、组织或器官中所用的细胞。
所述组织或器官包括成纤维组织、腺体、肺、卵巢、神经、骨组织、脑组织、血管、肝和肾。
在促进动物组织细胞生长的应用中，聚3-羟基丁酸羟基己酸酯(PHBHHx)可单独使用，也可与辅料制成组合物。
上述聚3-羟基丁酸羟基己酸酯的颗粒粒径范围为5nm-180μm，颗粒悬浊液可以通过聚3-羟基丁酸羟基己酸酯有机溶液与水混合后挥发去除有机溶剂的方法来获得。可用动态光散射方法(R.H.Marchessault，F.G.Morin，S.Wong et al.Can.J.Microbilo.41(Suppl.1)(1995)138-142.)检测聚3-羟基丁酸羟基己酸酯颗粒的粒径。
实验证明，添加了本发明的聚3-羟基丁酸羟基己酸酯后，细胞的生长量明显增加。聚3-羟基丁酸羟基己酸酯颗粒在一定范围内随着浓度的升高，细胞的生长量也在提高，但过高的浓度并不能使细胞的生长量持续增加，而且具有成本低的优点，可广泛应用于动物细胞工程和组织工程以及真核细胞和组织器官的体外培养。
图1a为粒径为180μm的聚-(R)-3-羟基丁酸羟基己酸酯颗粒悬浊液不同浓度对纤维细胞L929生长的影响柱状图(x±S.D.(n＝8)，显著性差异*p＜0.05，**p＜0.01)。
图1b为粒径为75μm的聚-(R)-3-羟基丁酸羟基己酸酯颗粒悬浊液不同浓度对纤维细胞L929生长的影响柱状图(x±S.D.(n＝8)，显著性差异*p＜0.05，**p＜0.01)。
图1c为粒径为5μm的聚-(R)-3-羟基丁酸羟基己酸酯颗粒悬浊液不同浓度对纤维细胞L929生长的影响柱状图(x±S.D.(n＝8)，显著性差异*p＜0.05，**p＜0.01)。
图2a为粒径为500nm的聚-(R)-3-羟基丁酸羟基己酸酯颗粒悬浊液不同浓度对纤维细胞L929生长的影响柱状图(x±S.D.(n＝8)，显著性差异*p＜0.05，**p＜0.01)。
图2b为粒径为65nm的聚-(R)-3-羟基丁酸羟基己酸酯颗粒悬浊液不同浓度对纤维细胞L929生长的影响柱状图(x±S.D.(n＝8)，显著性差异*p＜0.05，**p＜0.01)。
图2c粒径为10nm的聚-(R)-3-羟基丁酸羟基己酸酯颗粒悬浊液不同浓度对纤维细胞L929生长的影响柱状图(x±S.D.(n＝8)，显著性差异*p＜0.05，**p＜0.01)。
图3a为结构式I和II表示的结构单元的摩尔比为95∶5的PHBHHx颗粒不同浓度下对L929细胞增殖影响的柱状图(x±S.D.(n＝8)，显著性差异**p＜0.01)。
图3b为结构式I和II表示的结构单元的摩尔比为55∶45的PHBHHx颗粒不同浓度下对L929细胞增殖影响的柱状图(x±S.D.(n＝8)，显著性差异**p＜0.01)。
图4为不同分子量聚-(R)-3-羟基丁酸羟基己酸酯颗粒悬浊液对L929细胞生长的影响柱状图(x±S.D.(n＝8)，显著性差异**p＜0.01)。
图5a为不同浓度的75μm聚-(R)-3-羟基丁酸羟基己酸酯颗粒悬浊液对肝细胞HepG2生长的影响柱状图(x±S.D.(n＝8)，显著性差异*p＜0.05，**p＜0.01)。
图5b为不同浓度的65nm聚-(R)-3-羟基丁酸羟基己酸酯颗粒悬浊液对肝细胞HepG2生长的影响柱状图(x±S.D.(n＝8)，显著性差异*p＜0.05，**p＜0.01)。
图6a为不同浓度的75μm聚-(R)-3-羟基丁酸羟基己酸酯颗粒悬浊液对乳兔膝关节软骨细胞增殖的影响柱状图(x±S.D.(n＝8)，显著性差异*p＜0.05)。
图6b为不同浓度的65nm聚-(R)-3-羟基丁酸羟基己酸酯颗粒悬浊液对乳兔膝关节软骨细胞增殖的影响柱状图(x±S.D.(n＝8)，显著性差异*p＜0.05，**p＜0.01)。
图7a为不同浓度的75μm聚-(R)-3-羟基丁酸羟基己酸酯颗粒悬浊液对人脐静脉血管内皮细胞增殖的影响柱状图(x±S.D.(n＝8)，显著性差异*p＜0.05，**p＜0.01)。
图7b为不同浓度的65nm聚-(R)3-羟基丁酸羟基己酸酯颗粒悬浊液对人脐静脉血管内皮细胞增殖的影响柱状图(x±S.D.(n＝8)，显著性差异*p＜0.05)。
图8为流式细胞法检测不同浓度的75μm聚-(R)-3-羟基丁酸羟基己酸酯颗粒悬浊液对成纤维细胞L929细胞周期变化的影响柱状图。
图9为流式细胞法检测不同浓度的75μm聚-(R)-3-羟基丁酸羟基己酸酯颗粒悬浊液对神经细胞系PC12细胞周期变化的影响柱状图。
具体实施例方式
下面将参考附图详细描述本发明，所述实施例仅是意图举例说明本发明，而不是意图限制本发明的范围。
下述实施例中所述的方法，如无特别说明，均为常规方法。
下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。
实施例1、不同粒径的聚3-羟基丁酸羟基己酸酯(PHBHHx)颗粒对小鼠成纤维细胞L929增殖的影响一、不同粒径聚3-羟基丁酸羟基己酸酯颗粒悬浊液的制备聚3-羟基丁酸羟基己酸酯颗粒的制备方法参见(R.H.Marchessault，F.G.Morin，S.Wong et al.Can.J.Microbilo.41(Suppl.1)(1995)138-142.)该步骤中所用的PHBHHx是聚-(R)-3-羟基丁酸羟基己酸酯(重均分子量为500,000；结构式I和II表示的结构单元的摩尔比为88∶12；购自汕头联亿公司)。
将0.4g上述PHBHHx溶于400ml丙酮(分析纯)，60℃水浴回流加热20min，加入100ml无菌磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.2，购自北京鼎国生物技术有限责任公司)，剧烈搅拌混匀。用旋转蒸发仪将丙酮除去，形成稳定的浓度为4g/L的PHBHHx悬浊液，90℃高温蒸汽灭菌40min。经过动态光散射分析表明颗粒平均粒径(直径)为180μm，其中动态光散射分析按照文献(R.H.Marchessault，F.G.Morin，S.Wonget al.Can.J.Microbilo.41(Suppl.1)(1995)138-142)描述的方法进行。
将0.4g PHBHHx溶于400ml丙酮(分析纯)，60℃水浴回流加热20min，在功率为30W超声中缓慢加入100ml无菌磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.2，购自北京鼎国生物技术有限责任公司)，超声20min混匀。用旋转蒸发仪将丙酮除去，形成稳定的浓度为4g/L的PHBHHx悬浊液，90℃高温蒸汽灭菌40min。动态光散射分析表明颗粒平均平均粒径(直径)为75μm，其中动态光散射分析按照文献(R.H.Marchessault，F.G.Morin，S.Wong et al.Can.J.Microbilo.41(Suppl.1)(1995)138-142)描述的方法进行。
将0.4g PHBHHx溶于400ml丙酮(分析纯)，60℃水浴回流加热20min，在300W超声中缓慢加入100ml无菌磷酸盐缓冲液，超声20min混匀。用旋转蒸发仪将丙酮除去，形成稳定的浓度为4g/L的PHBHHx悬浊液，90℃高温蒸汽灭菌40min。动态光散射分析表明颗粒平均粒径为5μm。
将2mg PHBHHx溶于40ml氯仿(分析纯)，60℃水浴回流加热20min。在超声中将PHBHHx氯仿溶液缓慢滴加到800ml含5mM溴化十六烷三甲基铵(CTAB)的PBS溶液中，600W超声混匀30min后静止10min后，再600W超声混匀30min。旋转蒸发去除氯仿，得到浓度为0.25％(2.5mg/L)的PHBHHx悬浊液，1.5×104g离心10min，倒掉上清，去离子水洗涤2次除去CTAB，沉淀重悬于去离子水中，90℃高温蒸汽灭菌40min。动态光散射分析测得颗粒平均粒径为10nm。
2mg PHBHHx溶于40ml氯仿(分析纯)，60℃水浴回流加热20min。在超声中将PHBHHx氯仿溶液缓慢滴加到800ml含5mM CTAB的PBS溶液中，600W超声混匀30min。旋转蒸发去除氯仿，得到0.25％(2.5mg/L)的PHBHHx悬浊液，1.5×104g离心10min，倒掉上清，去离子水洗涤2次除去CTAB，沉淀重悬于去离子水中，90℃高温蒸汽灭菌40min。动态光散射分析测得颗粒平均粒径为65nm。
2mg PHBHHx溶于40ml氯仿(分析纯)，60℃水浴回流加热20min。在超声中将PHBHHx氯仿溶液缓慢滴加到800ml含5mM CTAB的PBS溶液中，500W超声混匀10min。旋转蒸发去除氯仿，得到0.25％(2.5mg/L)的PHBHHx悬浊液，1.5×104g离心10min，倒掉上清，去离子水洗涤2次除去CTAB，沉淀重悬于去离子水中，90℃高温蒸汽灭菌40min。动态光散射分析测得颗粒平均粒径为500nm。
逐级稀释法将以上PHBHHx颗粒悬浊液配制成0.5，1，2，4g/L PHBHHx母液，4℃保存。
二、不同微米级粒径聚3-羟基丁酸羟基己酸酯(PHBHHx)微米颗粒对小鼠成纤维细胞L929增殖的影响粒径分别为5、75、180μm的聚-(R)-3-羟基丁酸羟基己酸酯(结构式I和II表示的结构单元的摩尔比为88∶12)颗粒制备如步骤一。
细胞系成纤维细胞L929(购自中国预防医学科学院病毒研究所)。
DMEM血清培养基DMEM(GIBC0)，216mg/L L-谷氨酰胺，36mg/L L-天冬酰胺酸，4.766g/L Hepes，2g/L NaHC03，100mg/L青霉素，100mg/L链霉素，10％胎牛血清(购自武汉三利)。
DMEM无血清培养基DMEM(GIBCO)，216mg/L L-谷氨酰胺，36mg/L L-天冬酰胺酸，4.766g/L Hepes，2g/L NaHC03，100mg/L青霉素，100mg/L链霉素。
DMEM消化液DMEM(GIBCO)，216mg/L L-谷氨酰胺，36mg/L L-天冬酰胺酸，4.766g/L Hepes，2g/L NaHCO3，100mg/L青霉素，100mg/L链霉素，0.2％胰蛋白酶。
冲洗液PBS，100mg/L青霉素，100mg/L链霉素。
MTT染液5mg/ml(5mg MTT溶于1ml PBS)。
裂解液DMSO粒径为5、75、180μm的聚-(R)-3-羟基丁酸羟基己酸酯(PHBHHx)颗粒的添加浓度为0.005g/L，0.01g/L，0.02g/L，0.05g/L，0.1g/L。
培养条件37℃，5％CO2恒温培养箱。
成纤维细胞L929(购于中国预防医学科学院病毒研究所)用DMEM血清培养基培养后，将细胞消化，然后以5×103个细胞/孔接种48孔板，同时添加PHBHHx颗粒，培养72h后测定细胞的生长量。
用MTT法(李明，邢飞跃，李岩，实用医学杂志，2005(2)，1616-14)测定细胞的生长量1)染色细胞在48孔板中培养72h后，取出样品，吸去培养液，每孔加入0.25ml无菌的PBS(PH＝7.4)荡洗3次。再加入0.05ml MTT染液和0.5ml不含血清的培养基，置于培养箱中保存4h。
2)吸去上清，加入0.5ml DMSO，室温下放置30min，使颜色颗粒充分溶解。
3)取0.2ml待测液加入到96孔酶标板中，酶标仪550nm下测定吸光度值。
结果如图1a，1b，1c所示，表明在添加了粒径为180、75或5μm的聚-(R)-3-羟基丁酸羟基己酸酯的作用组中，均产生了一定的细胞生长促进作用，最佳添加浓度为0.02g/L，细胞培养72h后，对照组吸光度值分别为0.75、0.79、0.79，PHBHHx(0.02g/L)作用组吸光度值分别升高到1.09、1.16、1.07。
三、不同纳米级粒径聚3-羟基丁酸羟基己酸酯(PHBHHx)纳米级颗粒对小鼠成纤维细胞L929增殖的影响粒径为10nm、65nm、500nm的聚-(R)-3-羟基丁酸羟基己酸酯(结构式I和II表示的结构单元的摩尔比为88∶12)颗粒制备见步骤一。
细胞系成纤维细胞L929。
粒径为500nm、65nm、10nm的聚-(R)-3-羟基丁酸羟基己酸酯(PHBHHx)颗粒的添加浓度分别为0.005g/L，0.01g/L，0.02g/L，0.05g/L，0.1g/L。
成纤维细胞L929(购于中国预防医学科学院病毒研究所)用DMEM血清培养基培养后，将细胞消化，然后以5×103个细胞/孔接种48孔板，同时添加PHBHHx颗粒，培养72h后测定细胞的生长量。
培养基配制、培养条件、MTT测定方法同步骤二。
粒径为500nm、65nm、10nm的聚-(R)-3-羟基丁酸羟基己酸酯对细胞生长影响的实验结果如图2a，2b，2c所示，表明在添加了粒径为500nm、65nm、10nm的聚-(R)-3-羟基丁酸羟基己酸酯的作用组中，均产生一定的细胞生长促进作用，最佳添加浓度均为0.01g/L，细胞培养72h后，对照组吸光度值分别为1.04、0.89、0.78，PHBHHx(0.01g/L)作用组吸光度值升高到1.50、1.01、0.97。
实施例2、结构式II表示的结构单元不同含量的聚3-羟基丁酸羟基己酸酯(PHBHHx)颗粒对小鼠成纤维细胞L929增殖的影响一、结构式II表示的结构单元不同含量的聚3-羟基丁酸羟基己酸酯(PHBHHx)颗粒的制备聚3-羟基丁酸羟基己酸酯颗粒的制备方法参见(R.H.Marchessault，F.G.Morin，S.Wong et al.Can.J.Microbilo.41(Suppl.1)(1995)138-142.)聚-(R)-3-羟基丁酸羟基己酸酯(重均分子量为500,000；结构式I和II表示的结构单元的摩尔比为95∶5或55∶45；购自汕头联亿公司)。
2mg PHBHHx(结构式I和II表示的结构单元的摩尔比为95∶5)溶于40ml氯仿，60℃水浴回流加热20min。在超声中将PHBHHx氯仿溶液缓慢滴加到800ml含5mMCTAB的PBS溶液中，600W超声混匀30min。旋转蒸发去除氯仿，得到0.25％(2.5mg/L)的PHBHHx悬浊液，1.5×104g离心10min，倒掉上清，去离子水洗涤2次除去CTAB，沉淀重悬于去离子水中，90℃高温蒸汽灭菌40min。动态光散射分析测得颗粒平均粒径为67nm。
2mg PHBHHx(结构式I和II表示的结构单元的摩尔比为55∶45)溶于40ml氯仿，60℃水浴回流加热20min。在超声中将PHBHHx氯仿溶液缓慢滴加到800ml含5mMCTAB的PBS溶液中，600W超声混匀1h。旋转蒸发去除氯仿，得到0.25％(2.5mg/L)的PHBHHx悬浊液，1.5×104g离心10min，倒掉上清，去离子水洗涤2次除去CTAB，沉淀重悬于去离子水中，90℃高温蒸汽灭菌40min。动态光散射分析测得颗粒平均粒径为89nm。
逐级稀释法将以上PHBHHx纳米颗粒悬浊液配制成0.5，1，2，4g/LPHBHHx母液，4℃保存。
二、结构式II表示的结构单元不同含量的的聚3-羟基丁酸羟基己酸酯(PHBHHx)颗粒对小鼠成纤维细胞L929增殖的影响实验细胞系成纤维细胞L929。
结构式I和II表示的结构单元的摩尔比为95∶5或55∶45的聚-(R)-3-羟基丁酸羟基己酸酯(PHBHHx)颗粒的添加浓度为0.005g/L，0.01g/L，0.02g/L，0.05g/L，0.1g/L。
培养基配制、培养条件、MTT测定方法同实施例1。
成纤维细胞L929(购于中国预防医学科学院病毒研究所)用DMEM血清培养基培养后，将细胞消化，然后以5×103个细胞/孔接种48孔板，同时添加PHBHHx颗粒，培养72h后测定细胞的生长量。
结果如图3a，3b所示，表明在添加了结构式I和II表示的结构单元的摩尔比为95∶5或55∶45的聚-(R)-3-羟基丁酸羟基己酸酯的作用组中，均产生一定的细胞生长促进作用，最佳添加浓度均为0.01g/L，细胞培养72h后，对照组吸光度值分别为0.67、0.79，PHBHHx(0.01g/L)作用组吸光度值升高到0.89、1.10。
实施例3、不同分子量聚3-羟基丁酸羟基己酸酯(PHBHHx)制备的颗粒对小鼠成纤维细胞L929增殖的影响一、不同分子量的聚3-羟基丁酸羟基己酸酯颗粒的制备聚3-羟基丁酸羟基己酸酯颗粒的制备方法参见(R.H.Marchessault，F.G.Morin，S.Wong et al.Can.J.Microbi lo.41(Suppl.1)(1995)138-142.)聚-(R)-3-羟基丁酸羟基己酸酯(重均分子量为50,000、500,000、1,200,000；结构式I和II表示的结构单元的摩尔比为88∶12；由汕头联亿公司提供)。
2mg PHBHHx(重均分子量为50,000或500,000)溶于40ml氯仿，60℃水浴回流加热20min。在超声中将PHBHHx氯仿溶液缓慢滴加到800ml含5mM CTAB的PBS溶液中，600W超声混匀30min。旋转蒸发去除氯仿，得到0.25％(2.5mg/L)的PHBHHx悬浊液，1.5×104g离心10min，倒掉上清，去离子水洗涤2次除去CTAB，沉淀重悬于去离子水中，90℃高温蒸汽灭菌40min。动态光散射分析结果表明重均分子量为50,000的PHBHHx制备的颗粒平均粒径为55nm，重均分子量为500,000的PHBHHx制备的颗粒平均粒径为69nm。
将0.4g PHBHHx(重均分子量为1,200,000)溶于400ml丙酮，60℃水浴回流加热20min，在300W超声中缓慢加入100ml无菌磷酸盐缓冲液，超声20min混匀。用旋转蒸发仪将丙酮除去，形成稳定的PHBHHx悬浊液(4g/L)，90℃高温蒸汽灭菌40min。动态光散射分析颗粒平均粒径为90μm。
二、不同分子量的聚3-羟基丁酸羟基己酸酯颗粒对小鼠成纤维细胞L929增殖的影响实验细胞系成纤维细胞L929。
PHBHHx重均分子量分别为50,000、500,000、1,200,000的聚-(R)-3-羟基丁酸羟基己酸酯(PHBHHx)颗粒的添加浓度为0.02g/L。
成纤维细胞L929(购于中国预防医学科学院病毒研究所)用DMEM血清培养基培养后，将细胞消化，然后以5×103个细胞/孔接种48孔板，同时添加PHBHHx颗粒，培养72h后测定细胞的生长量。
培养基配制、培养条件、MTT测定方法同实施例1的步骤二。
结果如图4所示，表明在添加了不同分子量的聚-(R)-3-羟基丁酸羟基己酸酯的作用组中，均产生-定的细胞生长促进作用，分子量为50,000和500,000的聚-(R)-3-羟基丁酸羟基己酸酯制备的颗粒对细胞的生长促进作用大于分子量为1,200,000的聚-(R)-3-羟基丁酸羟基己酸酯颗粒，但并没有显著性差异，所以PHBHHx促进细胞增殖的作用与分子量大小无关。图4中，control为未添加PHBHHx的对照。
实施例4、聚3-羟基丁酸羟基己酸酯(PHBHHx)颗粒悬浊液对肝细胞HepG2增殖的影响结构式I和II表示的结构单元的摩尔比为88∶12的聚-(R)-3-羟基丁酸羟基己酸酯粒径为75μm和65nm的颗粒制备如实施例1的步骤一。
细胞系肝细胞HepG2(购于中国预防医学科学院病毒研究所)。
1640血清培养基1640(GIBCO)，100mg/L青霉素，100mg/L链霉素，5％胎牛血清(武汉三利)。
1640无血清培养基1640(GIBCO)，100mg/L青霉素，100mg/L链霉素1640消化液1640(GIBCO)，100mg/L青霉素，100mg/L链霉素，0.2％胰蛋白酶冲洗液PBS，100mg/L青霉素，100mg/L链霉素。
MTT染液5mg/ml(5mg MTT溶于1ml PBS)。
裂解液DMSO粒径为75μm和65nm聚-(R)-3-羟基丁酸羟基己酸酯颗粒的添加浓度为0.005g/L，0.01g/L，0.02g/L，0.05g/L，0.1g/L。
肝细胞HepG2用1640血清培养基培养后，将细胞消化，然后以5×103个细胞/孔接种48孔板，同时添加PHBHHx颗粒，培养72h后测定细胞的生长量。
MTT检测方法同实施例1的步骤二。实验结果如图5a、5b，表明在添加了粒径为75μm和65nm的聚-(R)-3-羟基丁酸羟基己酸酯颗粒的作用组中，产生一定的细胞生长促进作用，最佳的添加浓度分别为0.02g/L，0.01g/L，培养72h后对细胞的吸光度值分别从0.67，0.59增加到了1.35，0.85。
实施例5、聚3-羟基丁酸羟基己酸酯(PHBHHx)颗粒悬浊液对乳兔膝关节软骨细胞增殖的影响传代细胞乳兔膝关节软骨细胞酒精浸泡处死并消毒3-5天龄的NewZealand乳兔(北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXX(京)2002-0003)，裸露关节股骨与胫骨面，游离关节表面的软骨组织，将软骨组织收集于PBS内，切成小块。用0.2％的II型胶原酶溶液消化关节软骨碎片，获得软骨细胞悬液。
DMEM血清培养基DMEM(GIBCO)，216mg/L L-谷氨酰胺，36mg/L L-天冬酰氨酸，4.766g/L Hepes，2g/L NaHCO3，100mg/L青霉素，100mg/L链霉素，10％胎牛血清(武汉三利)DMEM无血清培养基DMEM(GIBCO)，216mg/L L-谷氨酰胺，36mg/L L-a天冬酰氨酸，4.766g/L Hepes，2g/L NaHCO3，100mg/L青霉素，100mg/L链霉素消化液DMEM(GIBCO)，0.125％胰蛋白酶，0.02％EDTA，100mg/L青霉素，100mg/L链霉素冲洗液PBS，100mg/L青霉素，100mg/L链霉素培养条件37℃，5％CO2恒温培养箱，接种量为1×104个/孔(48孔板)培养72hr。
MTT染液5mg/ml(5mg MTT溶于1ml PBS)裂解液DMSO结构式I和II表示的结构单元的摩尔比为88∶12的聚-(R)-3-羟基丁酸羟基己酸酯粒径为75μm和65nm的颗粒制备如实施例1的步骤一。
获得的传代乳兔膝关节软骨细胞用DMEM血清培养基培养约2-3天，待铺满整个培养瓶(25cm2细胞培养瓶，Coster，USA)后，将细胞消化，以1×104接种量接种48孔细胞培养板(Coster)，同时添加PHBHHx颗粒，培养72h后，MTT法测细胞生长量。详细步骤见实施例1的步骤二，MTT染液为5mg/ml(5mg MTT溶于1ml PBS)，裂解液为DMSO。
聚-(R)-3-羟基丁酸羟基己酸酯(PHBHHx)悬浊液的添加浓度为0.005g/L，0.01g/L，0.02g/L，0.05g/L，0.1g/L。MTT检测方法同实施例1的步骤二。
实验结果如图6a、6b，表明在添加了粒径为75μm和65nm的聚-(R)-3-羟基丁酸羟基己酸酯颗粒的作用组中，产生一定的细胞生长促进作用，最佳的添加浓度分别为0.02g/L，0.01g/L，培养72h后对细胞的吸光度值分别从0.349，0.512增加到了0.547，0.693。
实施例6、聚-(R)-3-羟基丁酸羟基己酸酯(PHBHHx)颗粒对人脐静脉血管内皮细胞增殖的影响传代细胞人脐静脉血管内皮细胞人脐带由北京市海淀妇产医院提供。足月、平产、健康新鲜新生儿脐带，长度不小于20cm，无菌条件下挤出残血，0.1％的I型胶原酶37℃处理10min，获得人脐静脉血管内皮细胞悬液。
原代培养基M199(GIBCO)，2.3g/L NaHCO3，15mmol/L HEPES，2mg/L ECGF，5mg/L肝素，2mmol/L L-Gin，1mmol/L丙酮酸钠，100mg/L青霉素，100mg/L链霉素，20％胎牛血清(武汉三利)。
继代培养基M199(GIBCO)，2.3g/L NaHCO3，15mmol/L HEPES，2mg/L ECGF，5mg/L肝素，2mmol/L L-Gin，1mmol/L丙酮酸钠，100mg/L青霉素，100mg/L链霉素，15％胎牛血清(武汉三利)。
无血清培养基M199(GIBCO)，2.3g/L NaHCO3，15mmol/L HEPES，2mg/L ECGF，5mg/L肝素，2mmol/L L-Gin，1mmol/L丙酮酸钠，100mg/L青霉素，100mg/L链霉素。
冲洗液PBS，100mg/L青霉素，100mg/L链霉素消化液PBS，0.125％胰蛋白酶，0.02％EDTA，100mg/L青霉素，100mg/L链霉素终止液PBS，5％胎牛血清(武汉三利)培养条件37℃，5％CO2恒温培养箱；人脐静脉血管内皮细胞在原代培养基中培养24h后，换用继代培养基培养，每两天换液一次。在48孔板中接种量为1×104个/孔，同时添加PHBHHx颗粒，培养72h后MTT方法检测，详细步骤见实施例1的步骤二，MTT染液为5mg/ml(5mg MTT溶于1ml PBS)，裂解液为DMSO。
结构式I和II表示的结构单元的摩尔比为88∶12的聚-(R)-3-羟基丁酸羟基己酸酯粒径为75μm和65nm的颗粒制备如实施例1的步骤一。
聚-(R)-3-羟基丁酸羟基己酸酯(PHBHHx)悬浊液的添加浓度为0.005g/L，0.01g/L，0.02g/L，0.05g/L，0.1g/L。MTT法同实施例1的步骤二。径为75μm和65nm的聚-(R)-3-羟基丁酸羟基己酸酯颗粒对人脐静脉血管内皮细胞增殖的影响实验结果如图7a、7b表明，在添加了粒径为75μm和65nm的聚-(R)-3-羟基丁酸羟基己酸酯颗粒的作用组中，产生一定的细胞生长促进作用，最佳的添加浓度分别为0.02g/L，0.01g/L，培养72h后对细胞的吸光度值分别从0.631，0.456增加到了0.960，0.664。
实施例7、聚3-羟基丁酸羟基己酸酯(PHBHHx)颗粒对小鼠成纤维细胞系L929细胞周期的影响结构式I和II表示的结构单元的摩尔比为88∶12、粒径为75μm聚-(R)-3-羟基丁酸羟基己酸酯颗粒制备如实施例1的步骤一。
细胞系成纤维细胞L929。培养条件同实施例1的步骤二。
用流式细胞法分析细胞周期的变化1)细胞培养在6孔培养板中接种5×104/ml细胞，在2ml培养液体系中形成不同浓度的聚-(R)-3-羟基丁酸羟基己酸酯悬浊液(0.005，0.01，0.02，0.05，0.1g/L)，培养72h。
2)将细胞消化，置于1.5ml eppendorf管中1500rpm离心5min，弃上清，加入1ml PBS洗去残留的培养液。
3)加入1ml 75％乙醇(无水乙醇∶PBS＝3∶1)4℃固定过夜。
4)加入0.25ml 0.2mg/ml RNase，37℃水浴30min除去RNA。
5)冰浴终止反应，加入0.25ml 0.04mg/ml碘化丙啶(Sigma)冰浴30min。
6)流式细胞仪检测细胞在G0/G1，S，G2/M几个周期细胞数目的分布。所得的数据由软件Cellquest software(Becton Dickinson，San Jose，CA)处理。
结果如图8所示，0.005-0.02g/L浓度范围聚-(R)-3-羟基丁酸羟基己酸酯作用的各组，随着聚-(R)-3-羟基丁酸羟基己酸酯浓度的升高处于S期的细胞比例增大，在0.02g/L浓度出现S期的细胞比例峰值；而处于G0/G1期的细胞比例逐渐减小，在0.02g/L浓度出现G0/G1期的细胞比例最低值。聚-(R)-3-羟基丁酸羟基己酸酯浓度更高的各组(0.05-0.1g/L)，随着聚-(R)-3-羟基丁酸羟基己酸酯浓度的升高处于S期的细胞比例减少，而处于G0/G1期的细胞比例逐渐增多。
以上结果表明，低浓度聚-(R)-3-羟基丁酸羟基己酸酯颗粒(0.005-0.02g/L)对鼠成纤维细胞L929的DNA合成促进作用与浓度成正相关，低浓度聚-(R)-3-羟基丁酸羟基己酸酯颗粒有助于细胞通过阻滞点，促进细胞增殖。而进一步提高浓度对细胞DNA合成无明显促进作用。
实施例8、聚3-羟基丁酸羟基己酸酯(PHBHHx)颗粒对神经细胞PC12细胞周期的影响细胞系神经细胞PC12(购于中国预防医学科学院病毒研究所)。
1640培养基1640(GIBCO)，100mg/L青霉素，100mg/L链霉素，10％胎牛血清(武汉三利)，10％马血清(Hyclone)1640无血清培养基1640(GIBCO)，100mg/L青霉素，100mg/L链霉素1640消化液1640(GIBCO)，100mg/L青霉素，100mg/L链霉素，0.2％胰蛋白酶冲洗液PBS，100mg/L青霉素，100mg/L链霉素。
结构式I和II表示的结构单元的摩尔比为88∶12、粒径为75μm聚-(R)-3-羟基丁酸羟基己酸酯颗粒制备如实施例1的步骤一。
神经细胞PC12在6孔培养板中接种1×105/ml细胞，在2ml培养液体系中形成不同浓度的聚-(R)-3-羟基丁酸羟基己酸酯悬浊液(0.005，0.01，0.02，0.05，0.1g/L)，培养72h。
培养条件同实施例3。
用流式细胞法分析细胞周期变化的方法同实施例7。
结果如图9所示，低浓度聚-(R)-3-羟基丁酸羟基己酸酯(0.005-0.02g/L)对神经细胞PC12的DNA合成具有促进作用，最好的作用浓度为0.02g/L。而进一步提高浓度对细胞DNA合成无明显促进作用。
权利要求
1.聚3-羟基丁酸羟基己酸酯在促进动物组织细胞生长中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述聚3-羟基丁酸羟基己酸酯是由下述结构式I和II表示的结构单元，以55-95∶5-45的摩尔比组成的重均分子量为50,000到1,200,000的线型无规共聚物；
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述聚3-羟基丁酸羟基己酸酯为R型，或S型，或内消旋化合物，或外消旋结构的化合物。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述聚3-羟基丁酸羟基己酸酯为R型。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的应用，其特征在于所述聚3-羟基丁酸羟基己酸的酯颗粒直径为5nm-180μm。
6.根据权利要求5中所述的应用，其特征在于所述聚3-羟基丁酸羟基己酸的酯颗粒直径为5nm、10nm、65nm、500nm、5μm、75μm或180μm。
7.根据权利要求1-4中任一项所述的应用，其特征在于所述聚3-羟基丁酸羟基己酸酯颗粒的使用浓度为0.001-0.1g/L培养基。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述聚3-羟基丁酸羟基己酸酯颗粒的使用浓度为0.01g/L或0.02g/L培养基。
9.根据权利要求1-4中任一项所述的应用，其特征在于所述的组织细胞选自下述细胞中的任意一种成纤维细胞、成骨细胞、软骨细胞、神经细胞、皮肤细胞、血管上皮细胞、造血干细胞、肝细胞、淋巴细胞、角膜上皮细胞和肾细胞。
10.根据权利要求1-4中任一项所述的应用，其特征在于所述组织或器官包括成纤维组织、腺体、肺、卵巢、神经、骨组织、脑组织、血管、肝和肾。
全文摘要
本发明公开了聚3－羟基丁酸羟基己酸酯的一种新用途。该新用途是聚3－羟基丁酸羟基己酸酯在促进动物组织细胞生长中的应用。本发明的聚3－羟基丁酸羟基己酸酯可使细胞的生长量明显增加，而且具有成本低的优点，可广泛应用于动物细胞工程和组织工程以及真核细胞和组织器官的体外培养。
文档编号C12N5/06GK1778904SQ20051010929
公开日2006年5月31日 申请日期2005年10月20日 优先权日2005年10月20日
发明者陈国强, 程杉, 赵艳, 吴琼 申请人:清华大学