专利名称：利用羊肚菌发酵液培养青春双歧杆菌的配方和方法
技术领域：
本发明申请属于微生物工程领域，尤其是涉及一种利用羊肚菌发酵液培养青春双歧杆菌的配方和方法。
背景技术：
尖顶羊肚菌(Morchella conica)是有名的食用真菌，在分类系统中隶属子囊菌纲(Ascomycetes)、盘菌目(Pezizales)、羊肚菌科(Morchellaceae)。现代医学研究表明羊肚菌具有降血脂、升高白细胞和调节免疫功能等方面的作用，并可减轻患者因放疗化疗引起的恶心、头疼、少食欲副作用。羊肚菌多糖是一种生物反应修饰剂，能增强免疫功能间接抑制肿瘤生长。双歧杆菌(Bifidobacterium)是人和动物肠道中对机体有益的生理性细菌，它在婴儿出生数小时后便在其肠道内定植，直至生命终结，与人的健康长寿息息相关。双歧杆菌的生物化学屏障、抑制致病菌和腐败菌、提供营养、提高免疫力、抗肿瘤功能及其某些临床功效已被充分肯定。羊肚菌在液体发酵过程中产生大量的多糖和寡糖类物质，一些寡糖是双歧杆菌的生长因子，但多糖类物质却不被双歧杆菌分解利用，因此利用羊肚菌发酵液培养青春双歧杆菌就可以得到既含有功能性真菌多糖，又含有青春双歧杆菌的功能性产品。
发明内容
本发明的一个目的是为了提供一种优化的羊肚菌液体发酵培养基，其配方为4％的蔗糖，0.4％的胰蛋白胨，0.15％的酵母粉，0.08％的天门冬酰胺，MgSO4·7H2O 0.5g/L，KH2PO41.45g/L，Na2HPO4·2H2O 0.48g/L，VB1 25mg/L，CaCl20.013g/L，微量元素溶液1.0mL/L。
本发明的另一个目的是提供一种利用该优化的羊肚菌液体发酵培养基来发酵培养羊肚菌的方法，把羊肚菌以2％的接种量接种到该优化的羊肚菌液体发酵培养基中，进行静止、避光培养10天，培养温度为26℃，该方法产生的羊肚菌菌丝生物量可以达到12.64g/L。
本发明更进一步的目的是提供一种利用羊肚菌发酵液培养双歧杆菌的方法，包括把羊肚菌以2％的接种量接种到优化的羊肚菌液体发酵培养基中，其中该优化的羊肚菌液体发酵培养基配方为4％的蔗糖，0.4％的胰蛋白胨，0.15％的酵母粉，0.08％的天门冬酰胺，MgSO4·7H2O 0.5g/L，KH2PO41.45g/L，Na2HPO4·2H2O 0.48g/L，VB125mg/L，CaCl20.013g/L，微量元素溶液1.0mL/L，于26℃进行静止避光培养10天，培养结束后，过滤，取滤液。青春双歧杆菌菌种活化扩培后，以3％接种量接种于羊肚菌发酵液滤液中，37℃厌氧培养12h。
本发明更进一步的目的是利用羊肚菌发酵液培养双歧杆菌的方法在发酵生产多糖中的应用，及其发酵得到的多糖。
使用本发明所述的利用羊肚菌发酵液培养青春双歧杆菌的方法，青春双歧杆菌在羊肚菌发酵液中能够正常增殖，12h发酵终点时活菌数达到1.32×109cfu/mL以上，最终pH值达到4.67，发酵液中的多糖含量为1000mg/L以上。青春双歧杆菌发酵过程中，羊肚菌多糖没有减少，而且羊肚菌发酵液代谢产物没有抑制双歧杆菌增殖。
羊肚菌发酵液含有很高的蛋白质，维生素和各种微量元素，羊肚菌多糖能增强免疫功能间接抑制肿瘤生长。双歧杆菌是人肠道中对机体有益的细菌，双歧杆菌具有生物化学屏障、抑制致病菌和腐败菌、提供营养、提高免疫力、抗肿瘤等功能。因而，青春双歧杆菌在羊肚菌发酵液中继续培养，发酵液可配制成一种集营养、保健和疗效为一体的功能食品，具有广阔的市场潜力。
本发明中的羊肚菌可以是任何羊肚菌菌株，优选羊肚菌(Morchella esculenta)菌株0469，0464，0463，1209，羊肚菌(Morchellacrassipes)菌株1208和尖顶羊肚菌(Morchella conica)菌株，它们均购自中国微生物菌种保藏中心管理委员会农业微生物中心上海食用菌分中心。
本发明中的双歧杆菌可以是任何双歧杆菌，优选青春双歧杆菌(Bafidobacterium adolescent)A02-3，购自中国食品发酵工业研究所工业微生物菌种保藏中心。
图1青春双歧杆菌在YDJ和PTYG中pH值变化曲线。
图2青春双歧杆菌在YDJ培养基和PTYG培养基中的生长曲线。
图3羊肚菌发酵液、YDJ培养基、YDJ发酵液和PTYG发酵液中产多糖情况。
具体实施例方式
以下实施例中所用的培养基配方为YDJ培养基羊肚菌发酵液，过滤除去菌丝，调pH值7.0后灭菌。PTYG液体培养基大豆蛋白胨5g，胰蛋白胨5g，酵母膏10g，葡萄糖10g，吐温801mL，L-半胱氨酸0.5g，无机盐溶液40mL，蒸馏水1000mL。每升无机盐液中含CaCl20.2g，K2HPO4 1.0g，NaCl 2.0g，MgSO4·7H2O 0.48g，KH2PO41.0g，NaHCO310g。
MRS琼脂培养基蛋白陈10g，牛肉膏10g，酵母粉2g葡萄糖20g，吐温-80lmL，磷酸氢二钾2g，乙酸钠5g，柠檬酸按2g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH值为6.0～6.5，115℃高压灭菌15～20mim备用。
实施例1、羊肚菌液体发酵培养把尖顶羊肚菌，其购自中国微生物菌种保藏中心管理委员会农业微生物中心上海食用菌分中心，接种到装有优化的羊肚菌液体发酵培养基的培养瓶中，该优化的羊肚菌液体发酵培养基为4％的蔗糖，0.4％的胰蛋白胨，0.15％的酵母粉，0.08％的天门冬酰胺，MgSO4·7H2O0.5g/L，KH2PO41.45g/L，Na2HPO4·2H2O 0.48g/L，VB1 25mg/L，CaCl20.013g/L，微量元素溶液1.0mL/L，培养基的初始pH为7.0，培养基的装瓶量为50mL/250mL三角瓶。接种量为2％，培养温度为26℃，静止、避光培养10d。培养结束后，发酵液过滤除去菌丝，取滤液，调节pH为7.0，灭菌，作为YDJ培养基。
实施例2、青春双歧杆菌活化扩增培养冻干的青春双歧杆菌菌种A02-3，其购自中国食品发酵工业研究所工业微生物菌种保藏中心。
接种到MRS培养基中活化培养，挑单菌落接种于PTYG液体培养基中，传代2次。
实施例3、利用羊肚菌发酵液培养青春双歧杆菌青春双歧杆菌菌种A02-3活化扩培后，以3％接种量接种于实施例1中制备的YDJ培养基中，37℃厌氧培养12h。
实施例4、青春双歧杆菌A02-3在PTYG液体培养基和YDJ培养基中的生长特性青春双歧杆菌A02-3在YDJ培养基和PTYJ液体培养基中均正常生长，6h左右达到对数生长期，10h左右达到对数生长期末期，最终pH达4.5左右。
4.1青春双歧杆菌在YDJ培养基和PTYJ液体培养基中增殖过程中pH值变化情况青春双歧杆菌在YDJ培养基和PTYJ液体培养基中生长，产生乳酸和醋酸使培养基pH值降低，抑制自身继续繁殖，使发酵达到终点，如图1所示。从产酸程度上，青春双歧杆菌在YDJ培养基中产酸略微滞后于PTYG液体培养基。PTYG液体培养基中含有相对较多胰蛋白水解物是青春双歧杆菌的生长促进因子，半胱氨酸·HCl能够降低发酵液的氧化还原电位，这都有利于青春双歧杆菌增殖产酸。YDJ培养基经过发酵羊肚菌，氮源有所减少，不利于青春双歧杆菌增殖产酸，但羊肚菌发酵所产生的寡糖有利于双歧杆菌生长。青春双歧杆菌在两种培养基中生长，产酸力大致相当。
4.2青春双歧杆菌在YDJ培养基和PTYG液体培养基中的活菌数变化青春双歧杆菌在YDJ培养基和PTYG液体培养基中均能正常生长，分别于12h和10h达到对数生长期末期活菌数达1.32×109cfu/mL和2.1×109cfu/mL，见图2。可见羊肚菌在完全培养基中生长，所产生多糖及代谢产物未抑制青春双歧杆菌生长，所产生寡糖在某种程度上还能促进双歧杆菌增殖，使发酵过羊肚菌的YDJ培养基在增殖青春双歧杆菌时能够达到PTYG液体培养基的水平。
实施例5、羊肚菌发酵液、YDJ培养基、YDJ发酵液和PTYG发酵液中产多糖情况多糖提取取羊肚菌发酵液(过滤离心除去菌丝)、YDJ培养基(发酵液调pH后灭菌)、YDJ发酵液(即YDJ培养基加青春双歧杆菌进行发酵后得到的发酵液)和PTYG发酵液(即PTYJ液体培养基加青春双歧杆菌发酵后得到的发酵液)最终样品20mL，加无水乙醇至100mL(使乙醇浓度达80％)沉淀粗多糖，4000r/min离心10min，弃上清，沉淀加80％乙醇洗涤，重复离心。沉淀加蒸馏水移至100mL容量瓶中，定容备用。
根据宁正祥，食品成分分析手册[M].北京中国轻工业出版社，1998，9-10所述的苯酚-硫酸法，测定样品中粗多糖含量。绘制葡萄糖标准曲线，分别取上述四种样品的多糖提取液1.0mL，苯酚-硫酸法490nm处测定吸光度值，计算羊肚菌发酵液、YDJ培养基、YDJ发酵液和PTYG发酵液中的多糖百分含量。
羊肚菌在液体培养基中生长产生真菌胞外多糖，苯酚-硫酸法测定，经计算其含量为891mg/L。发酵液过滤离心除去菌丝灭菌后，胞外多糖存在于YDJ培养基中，测定多糖含量为885mg/L，可见灭菌未分解羊肚菌多糖。青春双歧杆菌在YDJ培养基和PTYG培养基中生长同时产生少量细菌胞外多糖。YDJ培养基和PTYG液体培养基发酵双歧杆菌后，发酵液中最终发酵液多糖含量分别为1020mg/L和190mg/L，见图3。YDJ发酵液中的多糖含量数值上略低于羊肚菌多糖和青春双歧杆菌多糖之和，说明青春双歧杆菌在YDJ培养基中生长对总多糖含量略有影响。因试验条件有限，未能深入测定青春双歧杆菌对发酵液中多糖的具体影响情况，有待于开展深入研究。
权利要求
1.一种羊肚菌液体发酵培养基，其由以下成分组成4％的蔗糖，0.4％的胰蛋白胨，0.15％的酵母粉，0.08％的天门冬酰胺，MgSO4·7H2O 0.5g/L，KH2PO41.45g/L，Na2HPO4·2H2O 0.48g/L，VB1 25mg/L，CaCl20.013g/L，微量元素溶液1.0mL/L。
2.一种用权利要求1的羊肚菌液体发酵培养基液体发酵羊肚菌的方法，其包括把羊肚菌以2％的接种量接种到该液体发酵培养基中，进行静止、避光培养10天，培养温度为26℃，培养结束后，过滤，取滤液。
3.一种利用权利要求2的羊肚菌发酵液培养青春双歧杆菌的方法，其特征在于青春双歧杆菌菌种活化扩培后，以3％接种量接种于权利要求2所述的羊肚菌液体发酵的发酵液滤液中，37℃厌氧培养12h。
4.权利要求3所述的方法在生产多糖中的应用。
5.权利要求3所述的方法发酵得到的多糖。
全文摘要
本发明提供一种利用羊肚菌发酵液培养青春双歧杆菌的配方和方法。首先提供一种优化的羊肚菌液体发酵培养基，其配方为4％蔗糖，0.4％胰蛋白胨，0.15％酵母粉，0.08％天门冬酰胺，MgSO
文档编号C12N1/20GK1958782SQ20051011002
公开日2007年5月9日 申请日期2005年11月3日 优先权日2005年11月3日
发明者邢增涛, 刘景圣 申请人:邢增涛, 刘景圣