水稻叶片外卷基因及其应用的制作方法

专利名称：水稻叶片外卷基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物学领域。更特别的，本发明涉及新的水稻叶片外卷基因RG及其应用。本发明还涉及使水稻叶片发生外卷从而提高水稻产量的方法。本发明还涉及一种改良植物的方法。本发明的外卷基因还可作为基因转化植株后代的追踪标记和杂交制种过程中真杂种的指示标记。
背景技术：
水稻是我国的主要粮食作物，全国有60％以上的人口以稻米为主食。为确保粮食安全，我国于1996年启动了超级稻发展计划。要获得高产，前提是增加籽粒的数量和重量。由于叶片是水稻进行光合作用的主要器官，其形状和角度直接影响到个体和群体的光合作用效率，对提高产量和改善品质有着重要的作用。
卷叶是有用的农艺性状，是理想株形的重要组成部分，卷叶对叶片的挺直有直接作用。直立的叶片，除正面受光外，背面还吸收散射光和其他叶片的反射光，在光强和叶面积相同条件下，直立叶片有利于提高光合效率；而且，通过改善群体的通风透光性，还可减少发病机会，因此，通过选择卷叶性状，来增强叶片直立，改善群体透光性，在育种上已经广泛受到重视。
最新的高产株形研究成果关于叶片特点的描述提出叶片卷曲的观点叶片上举、卷曲、直立、比叶重大，叶绿素含量高。有研究表明，叶片卷曲具有使叶片挺直、叶基角较小、叶绿素含量增加、叶面积指数增大、消光系数降低等有利于充分利用光能的效应。因此，这一性状受到许多水稻遗传育种工作者的关注，并广泛地开展了工作，希望将此性状引入水稻品种中，构建出理想的株形，实现水稻产量新的突破。
因此，目前迫切需要开发研究一种理想的水稻卷叶植株，以改善水稻的光合效率，从而提高水稻的产量。

发明内容
本发明的目的在于提供一种新的水稻叶片外卷基因。
在本发明的第一方面，提供一种分离的RG蛋白，该蛋白选自下组(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)将SEQ ID NO2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有叶片外卷功能的由(a)衍生的多肽。
在本发明的第二方面，提供一种分离的多核苷酸，该多核苷酸选自下组(i)编码所述的RG蛋白的多核苷酸；(ii)与(i)中的多核苷酸互补的多核苷酸。
在本发明的一个优选例中，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。
在另一优选例中，所述的多核苷酸还包括驱动该基因表达的上游启动子区序列。
在另一优选例中，该多核苷酸选自下组(1)SEQ ID NO1中1-909位所示的核苷酸序列；(2)SEQ ID NO1中173-520位所示的核苷酸序列；或(3)SEQ ID NO8中1-1021位所示的核苷酸序列。
在本发明的第三方面，提供一种载体，它含有本发明上述的多核苷酸。
在本发明的第四方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，它含有本发明上述的载体，或基因组中整合有所述的多核苷酸。
在本发明的一个优选例中，所述的宿主细胞是植物细胞，如水稻细胞。
在本发明的第五方面，提供一种使水稻叶片发生外卷的方法，该方法包括增加所述水稻中RG基因或其同源基因的表达。
在本发明的一个优选例中，通过插入T-DNA序列或用强启动子驱动从而增强该RG基因或其同源基因的表达。
在本发明的第六方面，提供一种改良水稻的方法，它包括步骤(a)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有本发明上述的RG蛋白的DNA编码序列(包括cDNA序列或基因组序列)；(b)将水稻细胞或组织或器官与步骤(a)中的农杆菌接触，从而使该RG蛋白DNA编码序列转入水稻细胞，并且整合到水稻细胞的染色体上；(c)选择出转入所述RG蛋白DNA编码序列的水稻细胞或组织；(d)将步骤(c)中的植物细胞或组织再生成水稻植株。
在本发明的第七方面，提供一种DNA分子的用途，所述的DNA分子编码序列如SEQ ID NO2所示的蛋白，所述的DNA分子用于制备促进叶片外卷的水稻。


图1显示了外卷突变体(BY240)和中花11叶片照片。
图2显示了外卷突变体(BY240)的Southern杂交。以Ds片段为探针与HindIII酶切后的中花11、BY240叶片总DNA和pDsBar1300质粒DNA进行Southern杂交，BY240和pDsBar1300质粒存在杂交条带，中花11无杂交条带。
图3显示了外卷突变体(BY240)T-DNA插入的染色体位置，其中，箭头表示T-DNA插入位点。
图4显示了RG基因的表达。其中，泳道1ZH11成熟叶；泳道2ZH11成熟叶鞘；泳道3ZH11幼穗；泳道4ZH11成熟茎；泳道5BY240成熟叶；泳道6BY240成熟叶鞘泳道7BY240幼穗；泳道8BY240成熟茎。
图5显示了RG基因的相关工程质粒pUN-RGCO。其中，LB和RB为T-DNA左边界和右边界，Hyg为抗潮霉素抗性基因，35S和Ubi为35S和Ubi启动子，RGcDNA为RG基因的cDNA，Nos polyA为Nos终止子。
图6显示了RG基因的转基因植株照片。
具体实施例方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首先发现了由T-DNA插入导致叶片发生向外翻卷的水稻突变植株；克隆了与叶片发生外卷相关的基因(RG)。试验证实，RG基因的高表达可使水稻叶片发生外卷。因而，RG基因可作为在水稻的分子育种中促进叶片的外卷。在此基础上完成了本发明。
具体地，本发明人通过T-DNA标签的方法，在T-DNA插入的转基因后代群体中发现了一个叶片发生向外卷的突变体；通过外卷纯合突变体与原品种中花11号杂交的F2群体分析，发现外卷突变与插入的T-DNA(含抗除草剂基因)存在着共分离；外卷突变体的Southern杂交分析证明，该突变体的T-DNA插入为单拷贝插入；利用PCR技术，获得了T-DNA插入位点左右端旁邻序列，并通过插入位点旁邻序列的Blast分析，确定该T-DNA插入在水稻4号染色体上一个基因(本发明中命名为RG基因，中文全称为水稻叶外卷基因，英文全称为Revolute Gene)的转录起始位点上游位置；RG基因的基因组序列全长为1021bp，其中1-147为第一外显子，148-259为第一内含子，260-1021为第二外显子。
RG基因的全长cDNA为909bp(SEQ ID NO1)，其中ORF位于173-520位，编码一个116个氨基酸的蛋白质。
本发明人还利用RT-PCR技术，比较了RG基因的表达，发现突变体的RG基因与中花11的RG基因相比在表达上存在极大上调的现象；通过构建RG基因的相关工程质粒和根癌农杆菌介导的转基因方法，在中花11号的转基因后代中，获得了具有叶片外卷的转基因植株；经PCR鉴定，外卷植株都存在RG基因工程质粒的相关片段，在种植的部分T2后代中，观察到存在外卷叶和正常叶植株的分离。这些试验证明，RG基因的表达可使水稻叶片发生外卷。
如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
如本文所用，“分离的RG蛋白或多肽”是指RG蛋白基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化RG蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。
本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括RG蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然RG蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
在本发明中，术语“RG蛋白”指具有RG蛋白活性的SEQ ID NO2序列的多肽。该术语还包括具有与RG蛋白相同功能的、SEQ ID NO2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括RG蛋白的活性片段和活性衍生物。
多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与RG蛋白DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗RG蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含RG蛋白或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了RG蛋白的可溶性片段。通常，该片段具有RG蛋白序列的至少约20个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
发明还提供RG蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然RG蛋白的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
在本发明中，“RG蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
表1


本发明还提供了编码本发明RG蛋白或其保守性变异多肽的多核苷酸序列。
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO1或SEQ IDNO8所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO2的蛋白质，但与SEQ ID NO1或SEQID NO8所示的编码区序列有差别的核酸序列。
编码SEQ ID NO2的成熟多肽的多核苷酸包括只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码RG蛋白的多聚核苷酸。
应理解，虽然本发明的RG基因优选得自水稻，但是得自其它植物的与水稻RG基因高度同源(如具有80％以上，如85％、90％、95％、甚至98％序列相同性)的其它基因也在本发明考虑的范围之内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，例如BLAST。
本发明的RG蛋白核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或RG蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
通过常规的重组DNA技术(Science，1984；2241431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的RG蛋白。一般来说有以下步骤(1).用本发明的编码RG蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中，RG蛋白多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含RG蛋白编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的卡那霉素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。
本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、水稻幼胚转化法等。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得叶片形状发生改变的植物。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
重组的RG蛋白或多肽有多方面的用途。例如用于筛选促进或对抗RG蛋白功能的抗体、多肽或其它配体。用表达的重组RG蛋白筛选多肽库可用于寻找有价值的能抑制或刺激RG蛋白功能的多肽分子。
本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析。用RG蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测RG蛋白的转录产物。
本发明还涉及一种使水稻叶片发生外卷的方法，该方法包括增加所述植物中RG基因或其同源基因的表达。增加RG基因或其同源基因表达的方法是本领域周知的。例如。可通过插入T-DNA序列或用强启动子驱动从而增强该RG基因或其同源基因的表达。或者通过增强子(如水稻waxy基因第一内含子、Actin基因第一内含子等)来增强该RG基因的表达。适用于本发明方法的强启动子包括35s启动子、水稻、玉米的Ubi启动子等。
本发明还涉及一种改良水稻的方法，它包括步骤(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有RG蛋白DNA编码序列；(2)将植物细胞或组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使该RG蛋白DNA编码序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；(3)选择出转入所述RG蛋白DNA编码序列的植物细胞或组织；和(4)将步骤(3)中的植物细胞或组织再生成植株。
其中，可采用任何适当的常规手段，包括试剂、温度、压力条件等来实施此方法。
本发明测量叶片外卷性状可用到以下指标“卷曲度LRI”、“挺直度LEI”和“披垂度DAL”，它们分别按下式计算在开花期，叶片自然卷曲(指外卷)后，测定最宽处叶缘间距离(Ln)，然后把叶片展开测量其宽度(Lw)；在开花20天后，叶片发生自然弯曲，测定叶枕到叶尖的直线距离(LNL)及叶片挺直时的长度(LEL)，同时测定叶片自然弯曲后的叶片与茎的夹角(BAL)，叶枕到叶尖的连线与茎的夹角(AL)。
叶片卷曲度(Leaf rolling index，LRI)(％)＝(Lw-Ln)/Lw×100叶片挺直度(erecting index，LEI)＝LNL/LEL×100叶披垂度(drooping angle of leaf，DAL)＝AL-BAL此外，本发明还涉及利用叶片外卷性状作为一种基因转化植株后代的追踪标记。此外，还可利用该基因的叶片外卷特性作为杂交制种过程中真杂种的指示标记。
本发明的主要优点在于
(1)首次分离得到一种新的水稻叶片外卷基因，该基因的高表达使得水稻叶片外卷，从而增加叶片的挺直度从而增加叶片受光面积、使中下层叶片能受到较多的光照。并且，在密植状态下通过使叶片外卷也可改善群体的通风透光性，减少发病机会。
(2)可利用叶片外卷性状作为一种基因转化植株后代的追踪标记。
(3)可利用本发明的基因导致的叶片外卷特性作为杂交制种过程中真杂种的指示标记。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验指南(第二版)(NewYorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1995)或植物分子生物学-实验手册(Plant Molecular Biology-A Laboratory Mannual，Melody S.Clark编，Springer-verlag Berlin Heidelberg，1997)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
I.通用的材料与方法本发明具体实施方式
中使用到以下的材料和方法。
一.材料本发明使用的是常见的粳稻“中花11”(Oryza sativa L.subsp.Japonica CVZhonghua No.11)进行研究。但应理解，也可使用其它种类进行研究。
二.水稻叶片总DNA简易抽提法1.取2cm长的水稻幼嫩叶片，于1.5ml管中，加入200μl TPS抽提液，1ml tip将叶片捣碎。
2.捣碎的叶片放入75℃水浴中温浴20min。
3.12000g×5min离心。
4.取120μl上清于0.5ml tube中加入120μl异丙醇室温5min，12000g×10min离心。
5.去上清，加入120μl-300μ1 70％乙醇洗涤，12000g×5min离心。
6.去上清，干燥沉淀，加入30μl水(TE)溶解，PCR时取0.8-1.0μl(10μl PCR体系)做模板。
试剂TPS100mM Tris-Cl(pH＝8.0)10mM EDTA(pH＝8.0)1M KCl三.TAIL-PCRTAIL-PCR依照Liu等叙述的方法(见Plant Molecμlar Biology Reporter 16175-181，1998)。T-DNA左端嵌套引物序列是T-DNA-1CAAAATCCAGTACTAAAATCCAGA；(SEQ ID NO5)T-DNA-3ATTCGGCGTTAATTCAGTACA；(SEQ ID NO6)和T-DNA-5GTGTTATTAAGTTGTCTAAGC(SEQ ID NO7)。
这三个引物分别与5个随机的简并引物ADl-AD5当中的一个配对组合进行PCR，扩增T-DNA左端的旁临序列。TAIL-PCR产物于1.5％的琼脂糖凝胶上电泳进行分析。TAIL-PCR的产物直接送测序公司进行测序。
四.冻融法将质粒(例如，pUN-RGCO质粒)导入根癌农杆菌1.根癌农杆菌YEB(成分见分子克隆实验指南)(无抗生素)固体平板挑单菌落。5ml YEB液体培养基28℃ 200rpm培养过夜。按1％接种量转入50mlYEB(500μl菌液加入)，28℃ 200rpm培养3-4小时至细菌对数期。
2.4℃ 5000g离心10min，沉淀用5ml预冷的TE(Ph7.5)洗涤一次，加入5mlYEB液体(含10～15％甘油)重新悬浮。分装成200μl一管，液氮速冻后，于-70度保存。
3.取200μl菌液+0.5-1.0ug质粒(＜10μl)混匀，依次在冰上、液氮、37℃水浴各放置5min，用YEB稀释至1ml后，于28℃振摇培养2-4hr。
4.取200μl菌液涂布于含相应抗生素的YEB培养基平板上，28℃2-3天。
5.挑单菌落，重新在相应抗生素的YEB培养基平板上划单菌落两次。
五.水稻材料的培养A.愈伤组织的诱导取授粉后12-15天的水稻未成熟种子经70％乙醇浸泡1分钟后，于2％的NaClO溶液中(加2-3滴吐温20)消毒60分钟以上，用无菌水冲洗4-5次，然后用解剖刀和摄子挑出幼胚并接种于N6D2培养基上诱导愈伤组织，在26±1℃、避光条件下培育，4天后可用于转化。
B.农杆菌的培养和悬浮从YEB平板上挑取单菌落农杆菌接种到3ml含50mg/L卡那霉素(Km)的YEB液体培养基中于28℃振摇培养过夜，第2天按1％接种量转接入50ml含Km50mg/L的AB液体培养基中，200rpm继续振摇培养至OD600为0.8左右时，将新鲜的农杆菌菌液于6000g 4℃离心5分钟，收集并重悬于1/3体积的AAM液体培养基中，此时即可用于转化水稻各种受体材料。
C.感染和共培养于6cm培养皿中将各种水稻受体材料浸泡入新鲜的AAM农杆菌菌液中并不时摇动，20分钟后将水稻材料移出，在无菌滤纸上吸去过多的菌液，随即转移到N6D2C培养基上，于26℃共培养3天。在转化材料转入前，事先在N6D2C培养基上铺一层无菌滤纸，并用少量新鲜AAM液体培养基湿润。共培养3天后，从共培养培养基上取出转化材料，用无菌滤纸吸干菌液和水分，然后转入选择培养基进行筛选培养。
D.愈伤组织的筛选、分化与移栽预培养4天的幼胚与农杆菌共培养后，切去胚芽并转入选择培养基N6D2S1进行选择培养，2周后从幼胚盾片处长出的愈伤组织分成小块转到N6D2S2选择培养基上继续筛选2代(2周/代)，6周后生长旺盛的抗性愈伤组织转移到再生培养基MSRCH上分化(12小时光照/天)；再生的小苗在1/2MSENH上生根壮苗，随后移入网室或人工气候室盆土栽培。
试剂各基础培养基大量盐份(20x)g/L

*独立溶解后加入。
各基础培养基微量盐份(100x)mg/L

1.N6D2培养基1)1X大量盐份；2)1X微量盐份3)铁盐FeSO4·7H2O 27.8mg/L；Na2-EDTA 37.3mg/L；
4)维生素甘氨酸2mg/L；维生素B1(VB1)1mg/L；维生素B6(VB6)0.5mg/L；烟酸0.5mg/L；肌醇100mg/L5)0.5g/L酪蛋白水解物(LH)，30g/L蔗糖，2mg/L 2，4-D，2.5g/L植物凝胶(phytagel，Sigma公司)，pH5.8。
2.AB液体培养基K2HPO43g/L；Na2H2PO41g/L；NH4Cl 1g/L；MgSO4·7H2O 300mg/L；KCl150mg/L；CaCl210mg/L；FeSO4·7H2O 2.5mg/L；葡萄糖5g/L，pH7.0。
3.AAM液体培养基1)1 X AA大量盐分；1 X AA微量盐分；2)氨基酸L-Gln 880mg/L；L-Asp 270mg/L；L-Arg 230mg/L；L-Gly 80mg/L3)维生素甘氨酸2mg/L；维生素B1(VB1)1mg/L；维生素B6(VB6)0.5mg/L；烟酸0.5mg/L；肌醇100mg/L4)0.5g/L酪蛋白水解物(LH)，36g/L葡萄糖，68.5g/L蔗糖，PH5.24.N6D2CN6D2，葡萄糖10g/L，乙酰丁香酮20mg/L(56℃加入)。
5.N6D2S1N6D2，25mg/L潮霉素(HYGROMYCIN)，300mg/L头孢霉素。
6.N6D2S2N6D2，50mg/L潮霉素(HYGROMYCIN)，300mg/L头孢霉素。
7.MSRCH1)1 X MS大量盐分，1 X MS微量盐分，2)铁盐FeSO4·7H2O 27.8mg/L； Na2-EDTA 37.3mg/L；
3)维生素甘氨酸2mg/L；维生素B1(VB1)1mg/L；维生素B6(VB6)0.5mg/L；烟酸0.5mg/L；肌醇100mg/L4)6-苄基氨基嘌呤(6BA)2mg/L，荼乙酸(NAA)0.2mg/L，玉米素(Zeatin)05mg/L，激动素(KT)0.5mg/L，5)蔗糖30g/L，50mg/L潮霉素(HYGROMYCIN)，phytagel(Sigma公司)2.5g/L，pH5.88.1/2MSENH1)1/2 X MS大量盐分；1/2 X MS微量盐分，2)铁盐FeSO4·7H2O 27.8mg/L； Na2-EDTA 37.3mg/L；3)维生素甘氨酸2mg/L；维生素B1(VB1)1mg/L；维生素B6(VB6)0.5mg/L；烟酸0.5mg/L；肌醇100mg/L4)多效唑(MET)1mg/l； 荼乙酸(NAA)0.5mg/l5)30g/L蔗糖，50mg/L潮霉素(HYGROMYCIN)，2.0g/LPHYTAGEL(Sigma公司)，PH5.8六.植物组织提取RNA1.先将水稻幼苗在液氮中研磨成粉。将粉末分装到离心管中，每管分装100mg左右。每管加入1ml TRIZOL试剂(Invitrigen公司)，混匀，室温放置5min。加入氯仿200μl，用力振荡15sec，室温孵育2～3min。
2.4℃下离心(12000×g，15min)，混合物分为红色的酚-氯仿相(下相)、白色的中间相以及无色的上层水相。RNA在上层水相中。
3.转移上层水相(500μl)到一个新的Eppendorf管中，加入1ml无水乙醇，以沉淀RNA。
4.室温孵育10min以上，4℃条件下离心(12000×g，10min)，可见白色的RNA沉淀贴于管底壁。
5.吸弃上清，用70％的乙醇洗涤RNA沉淀一次，4℃条件下离心(7500×g，5min)6.吸弃上清，空气中自然干燥，用DEPC水溶解沉淀，-70℃保存备用。用紫外分光光度计测定RNA浓度及存度，A260/A280＞1.8。
七.RT-PCR按照Promega厂商所建议的条件进行实验。
试剂反转录试剂盒Reverse Transcription System(Cat.#A3500)(Promega厂商)，DNase(无RNase)(Promega厂商)，DEPC(华舜生物工程有限公司)八.5′race和3′race实验按照Roche厂商所建议的条件进行实验。
试剂RACE Kit(Cat.#3353621)(Roche厂商)九.GUS染色试剂GUS染液0.5mg/ml X-Gluc(Duchefa公司)，50mM KHPO4(pH7)，0.5mMK3Fe(CN)6，0.5mM K4Fe(CN)6，20％(v/v)甲醇，0.1％(v/v)Triton-X100(华舜生物工程有限公司)。
步骤1.转入GUS染液中，500mmHg真空抽气。
2.37℃染色过夜。
3.95％乙醇脱色后观察。
此外，Southern杂交和植物总DNA提取方法(CTAB法)均按照《分子克隆实验指南》(Sambrook等人，第二版，New YorkCold Spring Harbor LaboratoryPress，1995)中所述的方法进行。
(II)具体实施例实施例1RG突变体植株的获得T-DNA标签分离基因是植物功能基因研究的最重要手段之一。T-DNA(transfer DNA)是位于根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)Ti(tumor inducing)质粒或发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)Ri(root inducing)质粒上的一段DNA，它可以从农杆菌中转移并稳定的整合到植物染色体上，因此可作为一类外源基因载体，将外源DNA转移到植物细胞，并再生出能够表达外源基因的转基因植物；也可能使插入位点基因的表达受到影响，从而产生可筛选的突变表型，由于T-DNA序列已知，一旦遗传分析确定突变表型与插入的标签连锁，即可通过IPCR或TAIL-PCR方法获得标签两端的侧翼序列，然后将侧翼序列与基因组序列相比较获得突变基因的信息。由于农杆菌转化异源宿主单子叶植物水稻非常有效，利用T-DNA建立各类突变体库是目前了解水稻整个功能基因组最广泛采用的方法。在本发明人构建的T-DNA转化群体中，发现一个水稻叶片向外卷曲的突变体。
因此，利用T-DNA标签法，本发明人分离得到了该水稻叶片向外卷曲的基因。
实施例2RG突变体植株BY240的形态学观察一般叶片在生长过程中都发生自然弯曲，但是本发明人发现的一个叶片向外卷曲的突变体BY240，由于叶片外卷引起叶片挺直不披垂，使整个植株的株型直立。对照中花11和RG突变体植株的叶片具体形态见图1，可观察到对照中花11的叶片是平的，而RG突变体植株BY240的叶片是向外卷曲的。
另外，整个RG突变体植株的生长形态见图6，可见在生长过程中叶片外卷，大多叶片都可保持挺直状态，下垂少。
实施例3外卷突变体(BY240)的Southern杂交和染色体分析进行外卷突变体(BY240)的Southern杂交。用HindIII酶切中花11、BY240叶片总DNA和pDsBar1300质粒(pDsBar1300质粒构建方法见Wang J，等，ActaPhytophydiologica Sinica(in Chinese)，2000，26501)DNA，以Ds片段为探针与HindIII酶切后的中花11、BY240叶片总DNA和pDsBar1300质粒DNA进行Southern杂交，BY240和pDsBar1300质粒存在杂交条带，中花11无杂交条带。Southern杂交结果见图2。
通过外卷纯合突变体与原品种中花11号杂交的F2群体分析，发现外卷突变与插入的T-DNA(含抗除草剂基因)存在着共分离；外卷突变体的Southern杂交分析证明，该突变体的T-DNA插入为单拷贝插入。
用Tail-PCR分离T-DNA插入位点的旁邻序列(左端旁邻序列SEQ IDNO3(其中第1-21位为T-DNA序列，第22-615为水稻基因组序列)和右端旁邻序列SEQ ID NO4(其中第1-491位为水稻基因组序列，第492-729位为水稻基因组序列))表明，T-DNA插入在水稻第4染色体上，并且位于RG基因位点的启动子区域，离起始密码子ATG有1798bp。插入位置见图3。
实施例4RG基因的克隆利用水稻抽提的总RNA，以RT-PCR分段分离出RG基因的mRNA片段并测序，获得RG基因的编码序列SEQ ID NO1。根据水稻通用密码子编码规律，及RG基因的编码序列SEQ ID NO1推导出RG蛋白的序列，获得的RG蛋白的序列为SEQ ID NO2。
将RG基因构建入质粒，获得含有T-DNA和RG cDNA的可表达RG蛋白的pUN-RGCO重组表达载体(图5)。具体方法如下在pCAMBIA1300(购自CAMBIA公司)多克隆位点HindIII和BamH I处插入Ubi启动子，在Sac I和EcoR I处插入Nos终止子，获得pUN载体。
pUN-RGCO是在pUN载体多克隆位点BamH I和Kpn I之间插入水稻RG基因全长cDNA构建而成。
另外，用类似方法，直接用水稻基因组DNA为模板，通过PCR反应扩增获得SEQ ID NO8所示的基因组序列。
实施例5RG基因的序列分析利用http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/网页中“Align two sequences(b12seq)”和“Protein-protein BLAST(blastp)”分析工具对RG基因的序列进行分析。分析结果如下RG基因组序列如SEQ ID NO2所示，启动子区在ATG的上游1.5K到2K左右区域，转录起始位点经过确认在ATG上游174bp的位置，第一外显子共147bp，第一内含子112bp，第二外显子762bp，终止子TGA距ATG351bp。
实施例6外卷水稻植株中RG基因过量表达1.中花11(ZH11)与BY240植株的比较以中花11水稻植株作为对照，比较BY240突变植株与中花11植株的RG基因表达情况。
利用RT-PCR技术，比较了RG基因的表达，发现BY240突变体的RG基因与中花11的RG基因相比在表达上存在极大上调的现象。
以ZH11水稻植株作为对照，比较BY240突变植株与ZH11植株的各个部位中RG基因的表达情况。
结果见图4，其中，泳道1ZH11成熟叶 泳道5BY240成熟叶泳道2ZH11成熟叶鞘 泳道6BY240成熟叶鞘泳道3ZH11幼穗 泳道7BY240幼穗泳道4ZH11成熟茎 泳道8BY240成熟茎从图4可很明显地观察到，BY240成熟叶、BY240成熟叶鞘、BY240幼穗、BY240成熟茎中RG基因的表达显著高于ZH11中各相应的部位。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>上海市农业科学院作物育种栽培研究所<120>水稻叶片外卷基因及其应用<130>058806<160>8<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>909<212>DNA<213>粳稻(Oryza sativa L.)<220>
<221>CDS<222>(173)..(520)<223>
<400>1atccccctat aaatacttgc catctcttct ccgtccaacc acaccaccca gcaagaagac60cccgagcaat tctacccgct cggagctcct cccctttcat cgtctccaat caccatcatc120tgcacgtctc accggcccta cgcaacagca agtgggttac ctctcgatcg gg atg agc178Met Ser1cgc agc aac aag aag agc tct agg ggc atc gac ctg aag ctg aac ctc 226Arg Ser Asn Lys Lys Ser Ser Arg Gly Ile Asp Leu Lys Leu Asn Leu5 10 15tcg ctg ccg gcg aga ggg gac tcg tcg tcc agg agg gcg atg gcc gcc 274Ser Leu Pro Ala Arg Gly Asp Ser Ser Ser Arg Arg Ala Met Ala Ala20 25 30gac gag gag tcg tcg ccg agc tcg tgc ctg tcg tcg gag aac gag cac 322Asp Glu Glu Ser Ser Pro Ser Ser Cys Leu Ser Ser Glu Asn Glu His35 40 45 50ggc ctg cag tgg tcc aac agc ccg gag gcg acg tcc atg gtg ctc gcc 370Gly Leu Gln Trp Ser Asn Ser Pro Glu Ala Thr Ser Met Val Leu Ala55 60 65gcc tgc cct cgc tgc ttc atc tac gtc atg ctc ccg cag gat gat ccg 418Ala Cys Pro Arg Cys Phe Ile Tyr Val Met Leu Pro Gln Asp Asp Pro70 75 80
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Asp Pro Arg Cys Pro Gln Cys Lys Ser Pro Val Ile Leu Asp Phe Leu85 90 95Gln Gln Asp Asn Gly Asn Asn Asn Ala Asn Ser Asn Ser Ser Arg Lys100 105 110Thr Arg Arg Gly115<210>3<211>615<212>DNA<213>粳稻(Oryza sativa L.)<400>3cagaaccaca atatatcctg tgctcataac tgtgccacta ggttattgct tagtacagga60tatggtatat aaatgtatct ttgcacgtat atattgccat tagtcggtgt atgggggcca120aacccatgtg ctcttcttta attccatggt ggcatctaag gagcttaatt agagattatg180agtgaaaaat aatctccact gagttttctc gcgccttctt gttgtggttg caaaggcaat240gagctccaat gcaaaatagt tggatatatt gcgatttcgc ataaggtacc aagttattgg300caaaattcac aatttaatta ctttttaaac tccagctgct gttctagtgg actctcttgt360tgcttgtctt attttgaggt atgtattgat gaatactatg atagctcttt tggaacgcat420gaattttata ggaatttcgt gggagttagt tgaattcagt gaacgtcctg aaggaggccc480tgatatttgt gctactgata taatatttgt ggtgctgatg accagatgat gcttatatgc540ccactcgctt agtgaagact tgcgaggtgt cgcgctttag atgtttggaa ttggatagag600gtggatggaa gtatg 615<210>4<211>729<212>DNA<213>粳稻(Oryza sativa L.)<400>4cgagatgctt actatcccac cttgattaat gatgatgaca tacaactcac ttaaagttgt60
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1.一种分离的RG蛋白，其特征在于，该蛋白选自下组(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)将SEQ ID NO2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有叶片外卷功能的由(a)衍生的多肽。
2.一种分离的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸选自下组(i)编码权利要求1所述的RG蛋白的多核苷酸；或(ii)与(i)中的多核苷酸互补的多核苷酸。
3.如权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码具有SEQ IDNO2所示氨基酸序列的多肽。
4.如权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸选自下组(1)SEQ ID NO1中1-909位所示的核苷酸序列；(2)SEQ ID NO1中173-520位所示的核苷酸序列；或(3)SEQ ID NO8中1-1021位所示的核苷酸序列。
5.一种载体，其特征在于，它含有权利要求2所述的多核苷酸。
6.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求5所述的载体，或基因组中整合有权利要求2所述的多核苷酸。
7.一种使水稻叶片发生外卷的方法，其特征在于，该方法包括增加所述水稻中RG基因或其同源基因的表达。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，通过插入T-DNA序列或用强启动子驱动从而增强该RG基因或其同源基因的表达。
9.一种改良水稻的方法，其特征在于，它包括步骤(a)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有权利要求1所述的RG蛋白的DNA编码序列；(b)将水稻细胞或组织或器官与步骤(a)中的农杆菌接触，从而使该RG蛋白DNA编码序列转入水稻细胞，并且整合到水稻细胞的染色体上；(c)选择出转入所述RG蛋白DNA编码序列的水稻细胞或组织；(d)将步骤(c)中的植物细胞或组织再生成水稻植株。
10.一种DNA分子的用途，所述的DNA分子编码序列如SEQ ID NO2所示的蛋白，其特征在于，所述的DNA分子用于制备促进叶片外卷的水稻。
全文摘要
本发明公开了一种水稻叶片外卷基因RG及其应用。本发明还涉及使水稻叶片发生外卷从而提高水稻产量的方法。本发明还涉及一种改良植物的方法，采用本发明方法可使得水稻叶片外卷，增加叶片的挺直度从而增加叶片受光面积、使中下层叶片能受到较多的光照。在密植状态下通过使叶片外卷也可改善群体的通风透光性，减少发病机会。本发明的外卷基因还可作为基因转化植株后代的追踪标记和杂交制种过程中真杂种的指示标记。
文档编号C12N15/29GK1970569SQ20051011062
公开日2007年5月30日 申请日期2005年11月23日 优先权日2005年11月23日
发明者沈革志, 张景六, 黎凌, 王新其, 殷丽青 申请人:上海市农业科学院作物育种栽培研究所, 中国科学院上海生命科学研究院