专利名称：用于转基因植物安全性控制的基因删除系统及含有其的植物表达载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种解决转基因植物生物安全性的高效基因删除系统，具体地说，涉及基于来源于酵母的FLP/FRT和细菌噬菌体的Cre/loxP位点特异性重组酶(Site specific recombinase)系统。
本发明还涉及含有该基因删除系统的植物表达载体。
背景技术：
上个世纪90年代发展起来的植物转基因技术，随着技术日趋成熟、应用日益广泛，该技术已经成为增加作物产量、改善作物品质的一个重要手段。目前，在世界范围内，转基因作物的种植面积正在迅速增加，转基因技术给人类带来的好处日渐显著。
尽管转基因植物已经给人类带来了巨大的利益，转基因技术被认为是人类解决土地资源锐减和人口急剧膨胀这一矛盾最有效的方法之一，但由于该技术开发和利用的时间很短，人类对其生物安全性认识很有限，在科学界和社会公众中，很多人对植物转基因技术的安全性心存顾虑，认为目前人类还不能对转基因技术潜在危险性做出正确的评价。特别是2001年David和Ignacio在《Nature》上发表论文指出，转基因玉米可以通过花粉将外源基因转移到其近缘物种，在全世界范围内掀起了一场关于转基因植物是否安全的争论。
目前，人们对转基因植物生物安全性的担忧主要集中在①外源基因可能对生态环境和生物多样性带来不利的影响。如转基因植物花粉或种子的扩散造成基因逃逸(Gene flow)，可能使外源基因转移到杂草或近缘物种中，以及外源基因(如Bt基因)对非靶标生物的伤害，这些都可能给生态平衡和生物多样性造成灾难性的后果。②转基因食品对人类健康的潜在危害。如一些杀虫、抗菌基因以及过敏蛋白可能危害人类的健康，以及抗生素抗性基因逃逸到人类病原微生物中构成的潜在危险等等。
为了消除公众对转基因植物生物安全性的担忧，近年来，一些生物技术如共转化技术(Komari，T.et al，Plant J.1996，10165-174.)、位点特异性重组酶技术(Lyzniik，L.A.et al，Plant Cell Rep.2003，21925-932)等已经先后应用于转基因植物生物安全性的控制中。但迄今报道的这些技术存在以下的缺点①目前这些技术主要关心的是将转基因植物中的报告基因(如GUS基因或GFP基因)或抗性标记基因(如NPTII基因或Bar基因等)去除，而对其它改良作物品质、增加作物产量以及提高作物抗性等外源目的基因，在完成其功能后，并没有从转基因植物中删除，这些外源基因依然可能逃逸到自然界中，对生态环境和人类健康构成威胁，公众对转基因植物及其食品安全性的担忧也仍将存在。②上述技术删除转基因植物中外源基因的效率都比较低，只能在一定程度上删除转基因植物中的外源基因，无法满足转基因作物田间大面积释放后高效删除转基因的要求，不能彻底解决转基因植物中的生物安全性问题。③另外，这些技术往往需要通过杂交途径或二次转化等方法，才能实现对转基因植物中外源基因的删除，获得无外源基因的植株，该过程周期太长，可操作性差。因此，现有的基因删除技术均不能满足转基因植物安全性控制的需要。
比较而言，在这些技术中，来源于微生物的位点特异性重组酶系统在植物中的应用最为广泛，其删除效率也相对较高。目前，已经在植物上得到较多应用的位点特异性重组酶系统包括1)来源于细菌噬菌体P1(Bacteriophage P1)的Cre/loxP系统(Odell，J.et al，Mol.Gen.Genet.1990，223369-378.)。2)来自于酵母(Saccharomyces cerevisiae)2μ质粒的FLP/FRT系统(Lloyd，A.M.et al.Mol.Gen.Genet.1994，242653-657.)。所有重组酶系统完成重组过程所需元件仅仅包括重组酶(Recombinase)和该重组酶能特异识别的位点(Recognitionsite)，其工作原理也十分简单，过程为重组酶识别并结合转基因植物基因组中对应的特异性识别位点，形成所谓的Holliday结构，来自于重组酶C-端酪氨酸残基的羟基基团产生亲核攻击，破坏识别位点里不对称8bp序列两端的磷酸键，然后，参与重组反应的重组酶蛋白4个单体发生脂基转移反应，基因组DNA分别解链，再重新连接，完成重组过程(Voziyanov，Y.et al，Nucleic AcidsRes.1999，27930-941.)。
通常情况下，位点特异性重组酶系统根据识别位点方向和位置的不同，能够产生3种效应，分别为①当一对反向识别位点位于目的基因的两端时，在对应重组酶的作用下，识别位点间的所有基因将发生倒置，即倒位(Inversion)。②当一对同向识别位点位于目的基因的两端时，其相应的重组酶将删除识别位点之间的所有外源基因和一个识别位点，最后在基因组中只留下一个识别位点，这就是重组(Recombination)。③如果识别位点分别位于细胞中不同的染色体上，那么在对应重组酶的作用下，两条染色体可以在识别位点的位置发生染色体片段的互换，产生杂合的染色体，这种作用就叫作位置互换(Translocation)。
Cre重组酶是整合酶家族中的一员，其基因表达是一个38kD大小的蛋白质分子，它能特异识别位点loxP，调节loxP位点的分子内(切除、反接)和分子间(整合)的特异性重组。loxP是一段34bp的DNA序列，两端是两个13bp的反向重复序列，中间有一个8bp非对称间隔区域，Cre重组酶与非对称间隔区域识别结合后，将两个反向重复序列间的DNA片段切除。这个过程不需要其它任何辅助因子。
利用重组酶Cre/loxP系统对抗生素标记基因进行删除主要有几种方式，最早主要采用杂交的方式是，将重组酶基因导入到含识别位点和抗生素标记基因的转基因植物中去，从而删除标记基因。1991年，Dale等报道将标记基因NPTII置于两个loxP位点之间，通过表达Cre重组酶基因，可将标记基因NPTII从转基因植物基因组中切除。后来Russell等(1992)和Srivastava等(1999)都有成功的报道。这个方法需要在受体基因组内引入重组酶基因，剔除标记基因后还必须经过杂交和有性世代的遗传分离，去除重组酶基因，因此操作复杂，实验需要的时间很长。
作为改进，重组酶基因Cre、识别位点loxP以及标记基因放在同一表达载体上，Cre基因的表达受组织特异性启动子或化学诱导型启动子的控制，标记基因就可以在转基因植物生长的任何组织或任何阶段被删除。Zuo等(2001)采用化学诱导启动子获得了一个Cre/loxP自动删除系统，同样，Hoff等(2001)以及Zhang等(2003)利用热激蛋白启动子启动Cre基因的表达，分别在拟南芥和玉米愈伤组织中也自动删除了标记基因。与杂交系统相比，自动删除系统有以下几个明显的优点1)Cre基因的表达在转基因植物的T0代就可以表达，简化了操作程序，节约了时间。2)自动删除系统中Cre基因只在需要的时候才表达，且表达的时间很短，避免了Cre基因长时间大量表达对植物造成的伤害。3)这是目前唯一能在无性繁殖植物品种中删除标记基因的删除系统。
Mlynarova和Nap在2003年报道了一个将Cre/loxP自动删除和二次转化相结合的新的删除系统，在这个系统中，Cre基因的表达量受到了限制。他们转化烟草后发现，少量的Cre基因表达足以满足删除标记基因的需要，而且相对于组成型表达，其删除效率更高。
在FLP/FRT系统中，重组酶的识别位点由三个重复的13bp碱基片段构成，其中的两个片段碱基方向完全相同，另一个片段则与这两个片段的方向相反，这两部分之间被一个不对称的8bp间隔子(Spacer)隔开，整个识别位点的方向由该间隔子决定。48kD的FLP重组酶特异性识别FRT重组酶位点，FRT的方向性决定了FLP重组酶与之结合后，DNA片段是被重组还是被倒置。
FLP/FRT系统首先被Lyznik等在1993年应用到玉米和水稻的瞬时表达系统中，在他们的实验里，其中一个工程载体包含有uidA基因，但它的启动子和编码序列之间有一段1.31kb的DNA片段将其隔开，使该基因不表达，在这个片段两端分别有一个FRT识别位点，当FLP重组酶作用于两个同向识别位点后，将把这个片段切除掉，GUS报告基因就可以表达。另一个工程载体则只包含有adh1启动子或Ubiquitin启动子和FLP重组酶。当FLP基因在adh1启动子启动下，两个载体通过共转化方式倒入到原生质体中，GUS蛋白的活性恢复了阳性对照的10％。当FLP基因如果被Ubiquitin启动子作用时，GUS基因的活性可以达到60％～90％。另外，当识别位点FRT中的重复序列为3个(48bp)时，GUS基因的表达可以达到25％～50％，但如果FRT中的重复序列仅为两个(37bp)时，GUS基因的活性反而更高(60％～90％)。
1994年，Lloyed和Davies将FLP/FRT位点特异性重组酶系统稳定转化到烟草中去。表达FLP重组酶的植物与带有FRT识别位点的植株杂交，在T1代中，重组酶的删除效率为70％。在玉米细胞的稳定遗传转化中，Lyznik等(1996)发现通过二次转化将FLP基因和FRT识别位点共同转入植物，得到的愈伤组织中，4个中只有1个有GUS基因的表达，说明这种转化方法中重组的效率更低。Luo等(2000)采用杂交的方法，将FLP重组酶基因导入到拟南芥中，获得了很高的删除效率。
目前，已有的位点特异性重组酶系统存在着以下明显的缺点一是在这些系统中，重组酶基因一般都通过再转化或杂交的方法导入植物，这就带来了问题，当重组酶基因完成其功能，将需要删除的片段去除后，重组酶基因本身也是多余的，需要将其从转基因植物中删除掉，当然，通过后代遗传分离的方式，得到没有重组酶基因的植株也是可能的，但这样就很费时间，而且对于转基因植物材料是以无性生殖的植物品种那就很难了。对于Cre/loxP系统，为了克服这个缺点，Gleave等通过Cre基因在烟草中瞬时的表达，已经得到了无Cre基因的转基因植株。在这篇报道中，作者在没有抗生素筛选的情况下，从773株再生苗中，得到了两株含有loxP位点，但没有Cre基因的转基因植株。虽然这个方法确实可以在没有杂交和后代分离的情况下，得到了无重组酶基因的转基因植株，但由于这种方法效率低，而且需要做二次转化，大大限制了该方法在实际生产中的应用。
另一个潜在的问题是，我们目前还不十分清楚重组酶基因在转基因植物的大量表达，到底对植株有多大不利的影响。比如目前可以肯定的是Cre基因在马铃薯和矮牵牛中表达能够显著地抑制其生长，最近在烟草中也有类似的报道(Coppoolse，E.R.et al，Plant Mol.Biol.2003，51263-279.)。但目前我们还不知道，这种影响是因为Cre蛋白大量存在所产生的毒害作用引起的呢？还是由于其在基因水平上所造成的影响。如果是前者，随着Cre基因的不表达或弱表达，这种毒害就会随之消失；但如果是后者，这种影响可能就更长久一些。
更为关键的问题是，现有的位点特异性重组酶系统，主要考虑的是如何删除将转基因植物中的标记基因、报告基因，对于目的基因和重组酶基因本身，并没有被删除，而且这些重组酶系统删除外源基因的效率均不够高，很难满足在田间大规模释放的转基因作物中，完全删除外源基因，这大大限制了位点特异性重组酶系统在实际生产上的应用。
前人的研究发现，尽管重组酶系统Cre/loxP和FLP/FRT来源于不同微生物，但识别位点loxP和FRT的基本结构非常相似，两者都是由两端2个13bp的反向重复序列和中间一个8bp的非对称间隔序列(Spacer)构成。Lauth等(Lauth，M.et al.，Nucleic Acids Res.30115-128)研究发现，将loxP和FRT分别置于目的基因的两端，在重组酶Cre或FLP的作用下，能够提高重组酶蛋白识别和删除的效率。
发明内容
鉴于以上情况，为了获得高效的基因删除系统，解决转基因植物生物安全性问题，实现通过转基因植物获得非转基因产品的目的，本发明以位点特异性重组酶删除技术为基础，针对该技术目前在转基因植物中存在的转基因删除效率低的问题，构建新的高效基因删除系统。据此，构建了一个包含识别位点loxP和FRT的融合识别位点loxP-FRT，获得了一个全新的基因删除系统，希望该系统能够增强重组酶蛋白对识别位点序列的识别、结合以及切割作用，提高位点特异性重组酶系统在转基因植物中对外源基因的删除效率。
本发明的一个目的在于提供一种用于转基因植物安全性控制的高效基因删除系统，其含有融合的位点特异性重组酶系统Cre/loxP和FLP/FRT，该系统能够在转基因植物发育的特定发育阶段将其特定组织或器官中的外源基因彻底删除。
本发明的另一个目的在于提供一个融合的特异性识别位点核苷酸序列loxP-FRT，其至少包含34bp的loxP序列(如SEQ ID NO.1所示)和48bp的FRT序列(如SEQ ID NO.2所示)；更进一步地，考虑到当两个识别位点在一起，由于重组酶结合将占有一定的位置，在这种情况下如果识别位点直接相连接，将影响下一个重组酶结合到识别位点，因此可以在loxP与FRT之间插入一段间隔序列，而提高重组酶的结合效率，在本发明的一个具体实施方式
中，插入了一个4bp的间隔序列，构建成如SEQ ID NO.3所示的特异性识别位点序列。
本发明的再一个目的在于提供一种含有上述基因删除系统的植物表达载体，其将上述基因删除系统与植物的组织特异性启动子基因连接构建成植物表达载体，可在特定的植物器官中删除外源基因。
本发明的又一个目的在于提供一种制备安全转基因植物的方法。
根据本发明的一方面，一种用于转基因植物安全性控制的基因删除系统包括两个同向的融合特异性识别位点loxP-FRT，在两个特异性识别位点之间包含一段多克隆位点序列，所述多克隆位点用于插入各种需要导入植物中的目的基因序列，例如报告基因、筛选基因以及需转化入植物内的外源基因。
在本发明的一个具体实施方案中，采用人工化学合成的方法得到一段核苷酸序列loxP-FRT-MCS-loxP-FRT，该序列包括两个同向的融合特异性识别位点loxP-FRT，其间包含一段多克隆位点(Multiple Cloning Sites，MCS)序列。融合识别位点loxP-FRT共86bp，其中包括34bp的loxP序列、48bp的FRT序列以及在两个识别位点之间4bp的间隔序列，序列如SEQ ID NO.4所示，将该核苷酸序列插入到质粒载体pBIN19上。
同时，本发明也构建了融合基因35S-GUS∷NPTII-Nos，并将该融合基因片断插入到loxP-FRT-MCS-loxP-FRT片段的多克隆位点中。在构建的融合基因中，GUS作为报告基因，NPTII作为筛选基因。
根据本发明的另一方面，为了控制重组酶基因在特定植物器官中的表达，从而可以有目的地从特定的植物组织器官中删除外源基因，本发明提供了含有本发明基因删除系统的植物表达载体。通过将植物特定器官的组织特异性启动子序列插入本发明的基因删除系统中构建成本发明的植物表达载体，这些组织特异性启动子包括但不限于花粉特异性启动子、花器官和胚早期特异性表达的启动子，还包括根特异性启动子、叶特异性启动子等等其他植物特异性启动子。
在本发明的一个具体实施方案中，通过PCR方法从油菜基因组中克隆了BGP启动子，插入到FLP-Nos片段前，得到BGP-FLP-Nos，再将该片断引入质粒载体pBIN19上人工合成序列的多克隆位点中，获得最终的植物表达载体，将其命名为pLF-BGP-FLP-GN。将pLF-BGP-FLP-GN载体转化根癌农杆菌，并转化烟草。将花粉特异性启动子BGP与FLP基因融合，可以控制基因删除系统在转基因植物的花粉中特异表达，以删除转基因植物花粉中所有的外源基因。
在本发明的另一个具体实施方案中，采用类似方法，克隆了一个来自于拟南芥基因组花器官和胚早期特异性表达的启动子PAB5，将其插入到FLP-Nos片段前，在将PAB5-FLP-Nos片断引入质粒载体pBIN19上人工合成序列的多克隆位点中，获得植物表达载体，将其命名为pLF-PAB5-FLP-GN。将PAB5启动子融合到重组酶FLP基因的上游，可以控制基因删除系统在转基因植物的花粉和种子中特异表达，以删除转基因植物花粉和种子中所有的外源基因。
根据本发明的再一方面，制备安全的转基因植物的方法，包括将本发明的基因删除系统、组织特异性启动子与外源基因构建成植物表达载体转化植物而获得安全的转基因植物。
采用GUS组织染色、PCR鉴定和Southern杂交等手段对本发明的转基因植株进行检测，确定转基因植物外源基因的拷贝数。此外，分别对转基因pLF-BGP-FLP-GN和pLF-PAB5-FLP-GN植物的不同组织进行GUS染色，发现在转基因植株的根、茎、叶中，转基因能够正常表达，说明重组酶基因FLP在花粉和种子特异性启动子驱动下没有在营养器官中表达，外源基因的表达没有受到影响。通过对转基因烟草花粉和种子中的GUS基因进行检测，在转基因pLF-BGP-FLP-GN烟草花粉中，GUS组织染色后的结果说明，外源基因被完全删除。而在转基因pLF-PAB5-FLP-GN烟草中花粉和种子GUS组织染色后的结果，说明在转基因植物花粉和种子中，外源基因同样都被完全删除。
为了进一步确证外源基因的彻底删除，将转基因pLF-BGP-FLP-GN植物花粉与野生型烟草进行杂交，杂交后代GUS组织染色显示，没有外源基因存在。同样地，将转基因pLF-PAB5-FLP-GN植物分别自交，以及与野生型杂交，对自交和杂交后代分别进行GUS组织染色，结果都没有发现外源基因的表达。上述结果表明，在转基因pLF-BGP-FLP-GN植物中，转基因在花粉基因组被特异性地删除，而在转基因pLF-PAB5-FLP-GN植物的花粉和种子中，转基因都已经被彻底删除。
通过对pLF-BGP-FLP-GN和pLF-PAB5-FLP-GN基因删除系统在转基因烟草中的删除效率进行了统计，统计结果显示两者的删除效率都达到了100％。
另外，为了确证外源基因是否彻底删除，分别对删除后的转基因植物采用Southern杂交和PCR进行检测，结果都没有发现外源基因的检测信号。进一步对PCR扩增获得的残余片进行测序验证，结果显示，在转基因植物基因组仅残留了一个loxP-FRT融合识别位点。
因此，本发明成功地构建了基因删除系统和包含该删除系统的植物表达载体，该删除系统大大高于现有基因删除系统的删除效率。
为了更好地理解本发明的本质，下面结合附图，通过对本发明较佳实施方式的描述，详细说明但不限制本发明。
附图的简要说明
图1为PCR扩增人工合成序列FRT-MCS-FRT和loxPFRT-MCS-loxPFRT的电泳图谱其中，泳道1，FRT-MCS-FRT片段，161bp；泳道2，loxPFRT-MCS-loxPFRT片段，237bp；泳道MMDNA marker；图2为PCR扩增花粉特异性启动子BGP和花器官及胚早期特异性启动子PAB5的电泳图谱其中，泳道1为花粉特异性启动子BGP；泳道2为花器官及胚早期特异性启动子PAB5；CK为阴性对照，水作为模板；图3为PCR扩增CaMV 35S启动子、GUS基因和NPTII-Nos基因片段的电泳图谱其中，泳道MMDNA marker，泳道1为CaMV 35S启动子；泳道2为GUS基因；泳道3为NPTII-Nos基因片段；图4为pLF-GN质粒结构图；图5为pF-BGP-FLP-GN质粒结构图；图6为pLF-BGP-FLP-GN质粒结构图；图7为pLF-PAB5-FLP-GN质粒结构图；图8为PCR验证转基因pF-BGP-FLP-GN和pLF-BGP-FLP-GN植物的结果其中，MM，DNA分子Marker；CK为阴性对照；泳道10，阳性对照；泳道1、2、3、4、5分别代表GUS染色结果呈阳性的转基因pF-BGP-FLP-GN植物植株2、5、6、10、12的PCR检测结果；泳道6、7、8、9分别为GUS染色结果呈阳性的转基因pLF-BGP-FLP-GN植物植株2、4、6、9的PCR检测结果。
图9为PCR分子验证转基因pLF-PAB5-FLP-GN植株的结果其中，MM，DNA分子Marker；CK，阴性对照；泳道6，阳性对照；泳道1、2、3、4、5、7、8、9、10分别代表GUS染色结果呈阳性的转基因pLF-PAB5-FLP-GN植株1、2、4、5、9、11、13、15、16的PCR检测结果；图10为Southern杂交验证转基因pLF-BGP-FLP-GN和pLF-PAB5-FLP-GN植株结果其中，AMM，DNA分子marker；F2、F4、F6分别为转基因pLF-BGP-FLP-GN植物植株2、4、6的基因组DNA被HindIII酶切后的电泳图谱，F9、F11分别为转基因pLF-PAB5-FLP-GN植物植株9、11的基因组DNA被HindIII酶切后的电泳图谱；WT，为野生型植株，作为阴性对照。BMM，DNA分子marker；F2、F4、F6、F9、F11分别为转基因pLF-BGP-FLP-GN和pLF-PAB5-FLP-GN植物植株2、4、6和9、11，WT为野生型植株，作为阴性对照。结果显示，植株2为多拷贝T-DNA片断插入，植株4、6、9为单拷贝，植株11为两个拷贝。DNA探针为GUS基因的酶切片段；图11为GUS基因在转基因pLF-BGP-FLP-GN烟草不同组织中的表达情况其中，(A)叶片(横切)；(B)茎(横切)；(C)根；(D)花(纵切)；图12为GUS基因在转基因pLF-PAB5-FLP-GN烟草不同组织中的表达情况其中(A)叶片(横切)；(B)茎(横切)；(C)根；(D)花(纵切)；图13为转基因pLF-GN、pLF-BGP-FLP-GN和pLF-PAB5-FLP-GN植物T0代花粉GUS染色后不同时期的显微观察结果其中，A，为烟草时期7的花；B，烟草时期12的花；C，转基因pLF-GN植物T0代时期7时花粉GUS组织染色；D，转基因pLF-GN植物T0代时期12时花粉GUS组织染色；E，转基因pLF-BGP-FLP-GN植物T0代时期7时花粉GUS组织染色；F，转基因pLF-BGP-FLP-GN植物T0代时期12时花粉GUS组织染色；G，转基因pLF-PAB5-FLP-GN植物T0代时期7时花粉GUS组织染色；H，转基因pLF-PAB5-FLP-GN植物T0代时期12时花粉GUS组织染色；图14为转基因pLF-GN、pLF-BGP-FLP-GN和pLF-PAB5-FLP-GN烟草T0代植株与野生型杂交后代幼苗的GUS组织染色结果其中，A转基因植物pLF-GN自交后代幼苗的GUS染色；B转基因植物pLF-GN(父本)与野生型烟草(母本)杂交后代幼苗的GUS染色；C转基因pLF-BGP-FLP-GN植物自交后代幼苗的GUS染色，含有loxPFRT融合识别位点的重组酶删除系统；D转基因植物pLF-PAB5-FLP-GN自交后代幼苗的GUS染色；E转基因植物pLF-BGP-FLP-GN(父本)与野生型烟草(母本)杂交幼苗的GUS染色；F转基因植物pLF-PAB5-FLP-GN(父本)与野生型烟草(母本)杂交后代幼苗的GUS染色。实验中所用转基因植株均为单拷贝植株；图15为转基因pLF-BGP-FLP-GN和pLF-PAB5-FLP-GN植物及其与野生型杂交后代的Southern杂交结果其中，F4和F6中基因组DNA来自转基因pLF-BGP-FLP-GN植物植株4和6的T0代；F4×WT、F6×WT、F9×WT分别代表转基因pLF-BGP-FLP-GN植物株系4、6、9的T0代作为父本与野生型作为母本杂交，提取杂交后代基因组DNA做Southern分析的结果；F11×WT代表转基因pLF-PAB5-FLP-GN植物株系11的T0代作为父本与野生型作为母本杂交，提取杂交后代基因组DNA做Southern分析的结果；WT为野生型烟草，作为阴性对照；图16为PCR扩增转基因pLF-BGP-FLP-GN的T0植物及其与野生型烟草杂交后代中残余片段的琼脂糖凝胶电泳结果其中，wt-A为野生型烟草以开花前基因组DNA作为模板PCR扩增的结果，F4-A、F6-A、F9-A分别为以转基因pLF-BGP-FLP-GN植物植株4、6、9开花前基因组DNA作为模板PCR扩增的结果。wt-B为野生型烟草以开花后基因组DNA作为模板PCR扩增的结果，F4-B、F6-B、F9-B分别为以转基因pLF-BGP-FLP-GN植物植株4、6、9与野生型烟草杂交后代基因组DNA作为模板PCR扩增的结果；图17为构建的FRT-MCS-FRT的序列结构示意图；图18为构建的loxPFRT-MCS-loxPFRT的序列结构示意图。
发明的
具体实施例方式
本发明所用的试验材料如无特别说明均为市售购买产品。
实施例1植物表达载体的构建1、FRT-MCS-FRT和loxPFRT-MCS-loxPFRT片段的克隆为了获得FRT-MCS-FRT片断(MCS为多克隆位点Multiple Cloning Sites)，合成以下引物序列引物序列P15′>GCGAATTCGAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCGGAATAGGAACTTCGGTACCTAT<3′P25′>GTCGACGTAGAGCTCGACTCGAGAAGGATCCTTCCCGGGGAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATA<3′P35′>GGAACTTCGGAATAGGAACTTCGCTAGCGGC<3′P45′>TCTCTAGAAAGTATAGGAACTTCGAATTCGC<3′P55′>GGATCCTTCTCGAGTCGAGCTCTACGTCGACATAGGTACCGAAGTTCCTATTCCGAAGTTCCTAT<3′P65′>GCCGCTAGCGAAGTTCCTATTCCGAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTCCCCGGGAA<3′FRT-MCS-FRT的序列结构请参见图17所示。
为了获得loxPFRT-MCS-loxPFRT片断，合成带有两个同向loxP-FRT融合识别位点序列，在两个位点之间含有一个多克隆位点序列(MCS)，具体过程和序列如下引物序列P15′>GCGAATTCATAACTTCGTATAGCATACATTATAC-GAAGTTATGACCGAAGTTCCTATACTTTCTAGAG<3′P25′>AATAGGAACTTCGGAATAGGAACTTCGGTACCTA-TGTCGACGTAGAGCTCGACTCGAGAAGGATCCTT<3′P35′>CCCGGGATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAA-GTTATCTGAGAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAA<3′P45′>TAGGAACTTCGGAATAGGAACTTCGCTAGCGGC<3′P55′>TATAATGTATGCTATACGAAGTTATGAATTCGC<3′P65′>TAGGTACCGAAGTTCCTATTCCGAAGTTCCTATT-CTCTAGAAAGTATAGGAACTTCGGTCATAACTTC<3′P75′>CGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATCCCGGGA-AGGATCCTTCTCGAGTCGAGCTCTACGTCGACA<3′P85′>GCCGCTAGCGAAGTTCCTATTCCGAAGTTCCTAT-TCTCTAGAAAGTATAGGAACTTCTCAGATAACTT<3′loxPFRT-MCS-loxPFRT的序列结构请参见图18所示，核苷酸序列如SEQID NO.4所示。
根据上述序列和引物，通过人工合成的方式得到全序列后，退火，并以两端的引物作为扩增引物，用高保真的Platimum Pfx DNA聚合酶(Invitrogen，USA)进行PCR扩增。反应成分人工合成DNA产物(25ng/μL) 2微升dNTP(各10mM) 2微升氯化镁(5mM)+10倍缓冲液 2微升上游引物、下游引物(各100μM) 2微升Platimum Pfx DNA聚合酶 2UDNA聚合酶10倍缓冲液5微升总反应体积 50微升
PCR扩增条件如下94℃，1min，然后室温下缓慢退火至20℃，放置10min。然后94℃，1min，58℃，1min，72℃，30s，20个循环。最后72℃延伸10min。PCR扩增获得了约240bp的导向片段，并引入相应酶切位点，扩增后凝胶电泳的结果见图1。
PCR产物经小量胶回收试剂盒(Qiagene，USA)纯化后，以EcoRI/NheI双酶切，然后克隆于pUCm-T(Takara，USA)。用EcoRI/NheI双酶切鉴定，获得的阳性克隆再测序(PE公司，377测序仪；University of Connecticut，USA)验证，测序正确的质粒命名为pUC-F和pUC-LF。
2、花粉特异性启动子BGP的克隆根据Xu等(Xu，H.et al，Mol.Gen.Genet.1993，239，58-65)的报道分别合成两对引物，上游引物为5′>GCGGTACCTATCATTCCTTTAATTTCAAGG<3′(KpnI)，下游引物为5′>GTCTGCAGTTGGAGAGGAGATGGGTTG<3′(PstI)，从油菜(Brassica napus)基因组中，PCR扩增出花粉特异性启动子BGP。
反应成分基因组DNA(25ng/μL) 2微升dNTP (各10mM) 2微升氯化镁(5mM)+10倍缓冲液 2微升上游引物、下游引物(各100μM)2微升Platimum Pfx DNA聚合酶 2UDNA聚合酶10倍缓冲液 5微升总反应体积 50微升反应参数95℃，5分钟。94℃，1分钟，56℃，1分钟，72℃，1分钟，35个循环。72℃延伸10min。
扩增后凝胶电泳的结果见图2，PCR产物经小量胶回收试剂盒纯化后，以KpnI/PstI双酶切，然后克隆于pBlue-FLP-Nos(O′Gorman，S.et al，Science，1991，12511351-1355)。用KpnI/PstI双酶切鉴定，获得的阳性克隆再测序(PE公司，377测序仪；University of Connecticut，USA)验证，测序正确的质粒命名为pBlue-BGP-FLP-Nos。
3、花器官和胚早期特异性启动子PAB5的克隆根据Belostotsky等(Belostotsky D.A.et al.，Plant Cell 1996，81261-1275)的报道，分别合成两对引物，上游引物为5′>GGCGGTACCCTAGAAAGAGAACCAGGGAC<3′(KpnI)，下游引物为5′>CGGCTGCAGCCCCGAATTCCAGATGCAAC<3′(PstI)，从拟南芥(Arabidopsis tanefacien)基因组中，PCR扩增出花粉特异性启动子PAB5。
反应成分除了模板DNA为拟南芥DNA外，其他都相同于扩增BGP启动子的成分，反应条件也基本相同。
扩增后凝胶电泳的结果见图2，PCR产物经小量胶回收试剂盒纯化后，以KpnI/PstI双酶切，然后克隆于pBlue-FLP-Nos。用KpnI/PstI双酶切鉴定，获得的阳性克隆再测序(PE公司，377测序仪；University of Connecticut，USA)验证，测序正确的质粒命名为pBlue-PAB5-FLP-Nos。
4、35S-GUS-NPTII-Nos融合基因的获得参照Fabijanski等专利(Fabijanski，S.F.，Robert，L et al，WO 0159086 andGenBank Accession No.M26402GUS∷NPTII fusion.2001)，构建GUS基因和NPTII基因的融合基因。
具体过程为首先根据Chen等的报道(Chen，P.Y.et al，Mol.Breed.2003，11287-293)，分别合成两对引物，上游引物为5′>GGTCTAGAATGATTGAACAAGATGGATT-G<3′(含XbaI)，下游引物为5′>GGGTCGACAGACTCCCCGATCTAGTAAC-ATAGTA<3′(含SalI和SacI)。采用上述引物，以pBI121质粒DNA为模板，用高保真的Platimum Pfx DNA聚合酶(Invitrogen，USA)进行PCR扩增。
反应成分除了模板DNA为质粒pBI121外，其他都相同于扩增BGP启动子的成分。
反应参数95℃，5分钟。94℃，1分钟，57℃，1分钟，72℃，1.5分钟，20个循环。72℃延伸10min。
扩增后凝胶电泳的结果见图3，PCR产物经小量胶回收试剂盒纯化后，将NPTII-nos片段通过XbaI/SacI酶切位点装入到pBluescript II KS(+)上，用XbaI/SacI双酶切鉴定，获得的阳性克隆再测序验证，测序正确的克隆命名为pBlue-NPTII-Nos。
采用上述同样的方法，通过PCR扩增的方式获得GUS基因片段，根据Chen等的报道合成以下引物，上游引物为5′>GGTCIAGAATGTTACGTGGTG-TAGAAACC<3′(XbaI)，下游引物为5′>GGGGATCCTCATTGTTTGCCTCCC-TGCT<3′(BamHI)。采用上述引物，以pBI121质粒DNA为模板，用高保真的Puf DNA聚合酶(Invitrogen，USA)进行PCR扩增。
反应成分除了模板DNA为质粒pBI121外，其他都相同于扩增BGP启动子的成分。
反应参数95℃，5分钟。94℃，1分钟，57℃，1分钟，72℃，1.5分钟，20个循环。72℃延伸10min。
最后通过PCR扩增CaMV 35S组成型启动子，合成PCR引物，上游引物为5′>CCCTCGAGCCAGTATGGACGATTCAAGGC<3′(XhoI)，下游引物为5′>CCGGATCCCGTGTTCTCTCCAAATGAAATG<3′(BamHI)。以pBI121质粒DNA为模板，用高保真的Platimum Pfx DNA聚合酶(Invitrogen，USA)进行PCR扩增。
反应成分除了模板DNA为质粒pBI121外，其他都相同于扩增BGP启动子的成分。
反应参数95℃，5分钟。94℃，1分钟，56℃，1分钟，72℃，1分钟，20个循环。72℃延伸10min。
扩增后凝胶电泳的结果见图3，PCR产物经小量胶回收试剂盒纯化后，将GUS基因片段通过XhoI/BamHI酶切位点装入到pBlue-GUS∷NPTII上，用XhoI/BamHI双酶切鉴定，获得的阳性克隆再测序验证，并命名为pBlue-35S-GUS∷NPTII。在该融合基因两端分别含有一个XhoI和SalI位点，以便下一步构建。
5、植物表达载体的构建用EcoRI/NhEI双酶将FRT-MCS-FRT和loxPFRT-MCS-loxPFRT片段分别从中间载体pEGFP-F和pEGFP-LF上切下，插入植物载体pBIN19(Bevan，M.Binary，Nucl.Acids Res.1984，12，8711-8721)的相应位点，在将GUS∷NPTII融合基因从载体pBlue-35S-GUS∷NPTII上用XhoI/SalI切下，插入到FRT-MCS-FRT和loxPFRT-MCS-loxPFRT片段中间的多克隆位点(MSC)中，得到载体pF-GN和pLF-GN(loxP简写为L，FRT简写为F，35S-GUS∷NPTII简写为GN)，质粒结构图见图4。
用KpnI和SalI双酶从中间载体上pBlue-BGP-FLP-Nos切下BGP-FLP-Nos基因片段，插入到载体pF-GN和pLF-GN上的GUS∷NPTII融合基因前面的KpnI和SalI酶切位点之间，获得植物表达载体pF-BGP-FLP-GN和pLF-BGP-FLP-GN，质粒结构图见图5和图6。同样地，用KpnI和SalI从中间载体pBlue-PAB5-FLP-Nos上切下PAB5-FLP-Nos片段插入到载体pLF-GN上的GUS∷NPTII融合基因前面的KpnI和SalI酶切位点之间，获得植物表达载体pLF-PAB5-FLP-GN质粒结构图见图7。
将各个质粒采用液氮冻融法转化到根癌农杆菌LBA 4404中。
实施例2转基因烟草植株的获得种子消毒方法清水浸泡半小时，70％酒精消毒30秒，10％次氯酸钠溶液浸泡15分钟，在用无菌水漂洗3-4次；消毒后的种子置于1/2MS固体培养基上，于25℃的光照培养箱中培养成无菌苗，取叶片进行转化。
根癌农杆菌的培养首先从-80℃低温保存菌株中划平板，在平板上挑单菌落，置于液体YEB+50mg/L卡那霉素培养基中，于28℃(200转/分钟)摇床上培养28-36小时，取出200μl菌液于20ml液体YEB+50mg/L卡那霉素培养基中，继续培养4-6小时，至OD600值＝0.8左右，6000转/分钟离心10分钟收集菌体，弃上清，菌体用1/2MS液体培养基悬浮，用于烟草转化。
烟草转化采用叶盘法转化，在超净工作台内用消毒后的刀片切割外植体为0.5cm2左右，将切好的外植体放入菌液中浸泡10分钟左右，用无菌滤纸吸去叶片表面的菌液。
将叶片转入无抗生素的MS固体培养基中，置于暗箱中培养2-3天，然后将叶片转入含有50mg/L卡那霉素的筛选培养基(MS固体培养基+100mg/L头孢酶素+1.0mg/LBA+0.1mg/LNAA)中，在25℃光照为2000～10000lux条件下进行选择培养，选择培养的时间大约为3～4周，期间每两周更换一次新鲜的筛选培养基，直至抗性芽及植株产生，去其中的叶片用于进一步检测。
GUS检测将转基因植物材料(叶片、茎、根等)切成薄片，放入新鲜配置的X-Gluc染色液(Promega，USA)中，37℃保温1～12小时。待充分染色后，用75％(v/v)酒精脱色2～3次，至对照材料(野生型植物)呈白色。花粉和种子由于包被角质层和种皮，X-Gluc染色液难以浸透，为了染色充分，通常情况下，加入X-Gluc染液后，先抽真空5～10分钟，再按以上程序进行GUS组织染色。
PCR检测提取植物基因组DNA，采用CTAB法，过程如下将液氮速冻后的幼嫩叶片研磨成粉末，转移至10ml的离心管中，加入65℃预热的CTAB提取缓冲液(0.1g/ml)，剧烈震荡混匀。65℃水浴45分钟，其间颠倒混匀2～3次。加入与提取缓冲液等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，涡旋混匀3～5分钟，然后6000转/分钟，常温离心15分钟，将上清液转移到一新离心管中。加入2/3倍于上清液体积的异丙醇，充分混匀后室温放置2小时以上。在离心管中可见白色絮状沉淀，可用玻璃棒挑出，放入75％(v/v)的酒精漂洗2～3次；也可直接10000转/分钟室温离心10分钟收集沉淀，用75％(v/v)的酒精洗涤沉淀。空气干燥后，加入适量的TE溶解沉淀即得到基因组DNA。电泳检测植物总DNA含量。PCR检测再生植株中的NPTII抗性基因，合成其两端引物，上游引物为5′-AGGCTATTCGGCTATGACTGG-3′，下游引物5′-TCGGGAGCGGCGATACCGTA-3′。
反应成分除了模板DNA为转基因烟草基因组DNA外，其他都相同于扩增BGP启动子的成分。
反应参数95℃，5分钟；94℃，1分钟，56℃，1分钟，72℃，1分钟，40个循环。72℃延伸10min。
转基因pF-BGP-FLP-GN、pLF-BGP-FLP-GN和pLF-PAB5-FLP-GN烟草PCR检测的结果见图8和图9。
Southern杂交分析为进一步证明外源基因已经导入转基因植物中，分别选取转基因pLF-BGP-FLP-GN和pLF-PAB5-FLP-GN植物中的5个T0代植株进行了Southern杂交验证，同时确定了这几个植株外源基因插入转基因烟草基因组中的拷贝数。采用常用的CTAB法提取10μg植物基因组DNA用限制性内切酶HindIII充分酶切，然后在1.0％(w/v)琼脂糖凝胶上电泳，琼脂糖电泳结果见图10-A。再按《分子克隆实验指南》(2001年，第三版)的高盐法进行转膜、预杂交、杂交、洗膜和放射自显影。将pBI121质粒DNA的GUS片段，用RadPrime random primer labeling kit(GibcoBRL)标记上同位素α-32P，获得DNA探针。转基因pLF-BGP-FLP-GN和pLF-PAB5-FLP-GN5个植株Southern杂交结果见图10-B。
由于在载体pLF-BGP-FLP-GN和pLF-PAB5-FLP-GN上存在两个HindIII的酶切位点，其中一个位点位于FLP基因中间，另一个在CaMV 35S启动子和GUSNPTII融合基因之间，大小为2.2kb，所以，当以GUS片段作为探针时，所有转基因植株Southern杂交结果中，在2.2kb的位置都应该存在信号，如图9-B中所示。在植株2中至少还有4个条带，说明在该植株基因组上，至少有4个拷贝的外源基因插入。在植株4、6和9中，各有1条带，说明为单拷贝。植株11有2条带，则为双拷贝。在野生型植株中，未检测到任何杂交信号。以上结果与GUS染色和PCR检测结果相符，说明外源基因确实已经导入到转基因烟草的基因组中。
实施例3转基因植株中外源基因的表达分析1、转基因pLF-BGP-FLP-GN烟草中GUS基因的表达分析选取花粉特异性启动子BGP控制位点特异性重组酶FLP基因的表达，理论上，在转基因pLF-BGP-FLP-GN植物中，BGP启动子控制的重组酶FLP基因应该只在成熟花粉中表达，删除外源基因。因此，在转基因植物花粉成熟以前的所有组织中都应该能检测到GUS报告基因(CaMV 35S启动子控制)的大量表达。为了检测启动子BGP是否具有组织特异性表达特征，分别选取转基因pLF-BGP-FLP-GN烟草植株4中T0代植物的根、茎、叶和未成熟花器官等材料进行GUS组织染色，图11中显示的是pLF-BGP-FLP-GN转基因植物不同组织的GUS染色结果。
2、转基因pLF-PAB5-FLP-GN烟草中GUS基因的表达分析为了检测pAB5启动子是否具有很好的花粉、子房及胚胎早期组织表达特异性，将pAB5启动子控制的位点特异性重组酶删除系统导入到烟草中表达，对转基因植物各组织中GUS基因的表达情况进行检测。图12显示的是转基因pLF-PAB5-FLP-GN植物GUS组织染色结果。从图12中可知，在转基因烟草植株8的根、茎、叶和花器官中都检测到了GUS基因的大量表达，说明pLF-PAB5-FLP-GN载体中T-DNA片段确实已经插入到转基因烟草的基因组中，pLF-PAB5-FLP-GN删除系统的存在没有影响GUS报告基因在转基因植物根、茎、叶甚至花等组织中的正常表达，证明pAB5启动子具有较高的组织表达特异性。
实施例4转基因植株花粉中外源基因的删除分析1、转基因pLF-BGP-FLP-GN烟草花粉中外源基因的删除分析在转基因pLF-GN植物单拷贝植株中，由于没有位点特异重组酶基因存在，GUS基因的表达在时期7(图13-C)很高，GUS组织染色后多数花粉都呈蓝色，在时期12(图13-D)时，GUS基因的表达量仍然很高。在转基因pLF-BGP-FLP-GN植物植株的T0代花粉中，重组酶FLP基因有花粉特异性启动子BGP控制，同时存在融合识别位点loxP-FRT，尽管在时期7(图13-E)时GUS基因的表达同样很高，但在时期13(图13-F)中没有观察到蓝色花粉，说明在花粉成熟的中后期，由于花粉特异性启动子BGP引导重组酶FLP基因表达，该重组酶能迅速起作用，花粉基因组上的GUS等外源基因完全被删除，细胞中GUS蛋白被降解，所以在时期12的GUS组织染色后，没有检测到蓝色花粉的存在。
2、转基因pLF-PAB5-FLP-GN烟草花粉中外源基因的删除分析在转基因pLF-PAB5-FLP-GN植物植株的T0代花粉中，重组酶FLP基因有花粉特异性启动子PAB5控制，同时存在融合识别位点loxP-FRT，尽管在时期7(图13-G)时GUS基因的表达同样很高，但在时期12(图13-H)中没有观察到蓝色花粉，说明在花粉成熟的中后期，由于花粉特异性启动子PAB5引导重组酶FLP基因表达，该重组酶能迅速起作用，花粉基因组上的GUS等外源基因完全被删除，细胞中GUS蛋白被降解，所以在时期12的GUS组织染色后，没有检测到蓝色花粉的存在。
实施例5转基因植株与野生型杂交后代GUS组织染色的结果根据孟德尔经典遗传学理论，如果转基因T-DNA片段以单拷贝插入植物基因组中，在T1代就会表现出3∶1的分离比，因此，在转基因pLF-GN植物自交得到的后代中，理论上GUS组织染色应该有75％幼苗能够被染成蓝色，而在pLF-BGP-FLP-GN植物自交后代中，由于位点特异性重组酶系统的存在，则应该有50％～75％的幼苗能够染成蓝色，具体数量由pLF-BGP-FLP-GN系统的删除效率决定。在和pLF-PAB5-FLP-GN植物自交后代中，由于启动子PAB5能够驱动重组酶FLP在花粉和种子中特异性表达，因此，在自交后代中，应该有0％～75％的幼苗能够染成蓝色，具体数量由pLF-PAB5-FLP-GN系统的删除效率决定。
为了确证转基因烟草T0代花粉中GUS组织染色得到的结论是否可信，将转基因转基因pLF-GN、pLF-BGP-FLP-GN和pLF-PAB5-FLP-GN植物单拷贝植株T0代的花粉与野生型烟草进行杂交，得到杂交后代的种子，并将这些种子和它们萌发后的幼苗进行GUS组织染色。理论上，如果花粉基因组中的GUS基因没有被删除，那么杂交后代幼苗染色后就应该观察到蓝色(GUS基因的表达产物)。如果pLF-BGP-FLP-GN和pLF-PAB5-FLP-GN植物单拷贝T0代植株与野生型杂交后，由于删除系统的存在，在杂交后代幼苗中，GUS组织染色后蓝色幼苗数量应该减少或者没有蓝色幼苗。
图14中A、C、D分别显示转基因pLF-GN、pLF-BGP-FLP-GN和pLF-PAB5-FLP-GN植物自交后代幼苗GUS组织染色的结果，其中蓝色幼苗比例分别为75％、50％和0％。当用单拷贝转基因植物的花粉跟野生型杂交时，在转基因pLF-GN植物杂交后代中，应该有50％的幼苗带有GUS基因(图B)；在转基因pLF-BGP-FLP-GN植物的杂交后代中，推测大约0～50％的幼苗具有GUS基因。实验中得到的结果如图14-E中所示，在图14-E中则没有观察到蓝色种子，说明可能pLF-BGP-FLP-GN具有高的删除效率，已经将杂交后代基因组中的外源基因切除得更彻底。在图14-D和-F中GUS组织染色的结果显示，无论是转基因pLF-PAB5-FLP-GN植物花粉与野生型烟草杂交(图D)，还是转基因pLF-PAB5-FLP-GN植物自交(图F)，都没有检测到蓝色的幼苗，说明pAB5启动子在转基因植物花粉和子房中都能特异地启动重组酶FLP基因的表达，高效地删除外源基因。
实施例6转基因植株中外源基因的删除效率分析1、转基因pLF-GN、pF-BGP-FLP-GN和pLF-BGP-FLP-GN烟草中外源基因的删除效率分析为了获得pF-BGP-FLP-GN和pLF-BGP-FLP-GN系统在转基因烟草花粉中删除外源基因的效率，比较单个融合识别位点FRT和融合识别位点loxP-FRT对重组酶系统删除效率的影响，分别将转基因植株(作为父本)与野生型(作为母本)进行杂交，并对杂交后代的幼苗GUS组织染色，通过对蓝白幼苗的统计，得到这些系统在转基因烟草花粉中的删除效率，部分统计结果见表1所示。
表1.不同位点特异性重组酶系统删除效率的比较
注如果转基因植株为单拷贝时，杂交后代删除效率％＝(白色幼苗数-蓝色幼苗数)/(蓝色幼苗数+白色幼苗数)×100％。如果转基因植株具有两个拷贝，则删除效率％＝(3×白色幼苗数-蓝色幼苗数)/3×(蓝色幼苗数+白色幼苗数)×100％。ND表示该植株中删除效率未统计。
结果显示，在转基因pLF-GN(父本)×野生型(母本)杂交后代中，尽管存在融合识别位点，但由于没有重组酶基因，各个植株中删除效率都为0。在pFBFGN(父本)×野生型(母本)的杂交后代中，BGP启动子引导FLP重组酶基因表达，识别位点为其对应的FRT，在不同株系中删除效率分别达到了18.9％～77.5％。而在pLF-BGP-FLP-GN(父本)×野生型(母本)杂交后代GUS染色统计的结果显示，植株4、6和9的幼苗也计数到2万以上，没有发现蓝色幼苗，这些植株都为单拷贝转基因植物。有根据表1中GUS组织染色、Km抗性筛选以及Southern杂交的结果可知，植株11为双拷贝转基因植株，但与野生型杂交，幼苗GUS组织染色后，统计结果显示，删除效率也达到100％。而植株2为多拷贝插入，其删除效率仅为63.5％。删除效率最低的转基因植株是植株17，只有49.3％。
2、转基因pLF-PAB5-FLP-GN烟草中外源基因的删除效率分析在转基因pLF-PAB5-FLP-GN植物中，启动子PAB5在花粉、子房以及早期胚胎中特异性表达，为了检测pLF-PAB5-FLP-GN系统在转基因植物花粉和子房中的删除效率，分别将转基因pLF-PAB5-FLP-GN植物作为父本与野生型作为母本杂交，同时也将野生型作为父本与转基因pLF-PAB5-FLP-GN植物作为母本杂交。由于启动子PAB5引导FLP基因特异性表达，在转基因植物花粉或子房中外源基因都可能被删除。为了检测重组酶在不同组织中的删除效率，将杂交后代种子分别萌发，然后GUS组织染色，统计各个植株中的删除效率，其结果见表2。
表2中的统计结果显示，转基因pLF-PAB5-FLP-GN植物各个植株之间的删除效率差异比较大。植株9中删除效率最低，在花粉和子房中分别为19.8％和30.7％，在植株2中，尽管转基因植物的花粉与野生型烟草杂交的结果显示，外源基因在花粉中已经被完全删除掉，但其子房中的删除效率却并不高，仅达到69.7％。但在植株8和植株12中，无论是转基因植物作为父本与野生型杂交，还是其作为母本与野生型杂交，后代幼苗GUS组织染色后，个体统计到接近15,000时都没有发现蓝色植株，而且它们自交后代中也没有发现蓝色幼苗(结果未显示)，说明PAB5启动子引导重组酶FLP基因表达，在转基因pLF-PAB5-FLP-GN植物的花粉和种子中，都能将外源基因100％地删除。
表2.转基因pLFABFGN植物各个植株中删除效率的统计结果
注删除效率％＝(白色幼苗数-蓝色幼苗数)/(白色幼苗数+蓝色幼苗数)×100％。F父本，M母本。
实施例7转基因植物花粉基因组中残余外源片段的检测1、Southern杂交检测通过转基因pLF-BGP-FLP-GN烟草与野生型杂交后代的GUS组织染色，初步证实这些转基因植株杂交后代中已经没有GUS蛋白，由此推测，GUS基因可能已经从转基因pLF-BGP-FLP-GN植物花粉基因组中删除。为了上述结果是否可信，分别提取转基因pLF-BGP-FLP-GN植物植株T0代的基因组DNA和转基因pLF-BGP-FLP-GN植物与野生型烟草杂交后代的基因组DNA，以GUS基因片断作为DNA探针做Southern杂交，得到图15的结果。
图15中显示，F4和F6为转基因pLF-BGP-FLP-GN植物植株4和植株6的T0代Southern杂交结果，与图10-B中的杂交结果比较，两者杂交信号相似，说明两次Southem杂交结果重复性很好，实验结果可信。采用同样的DNA探针，对转基因pLF-BGP-FLP-GN植株4、6、9和转基因pLF-PAB5-FLP-GN植株11分别与野生型杂交后代，以及野生型烟草做Southern杂交，结果没有观察到任何探针信号(图15所示)，说明FLP重组酶基因已经不存在于转基因植物的花粉基因组中(FLP基因片段作为杂交探针)。该结果再次从分子水平上证实所有外源基因已经从转基因烟草花粉基因组中被彻底删除。
2、PCR检测根据图14的结果，在转基因pLF-BGP-FLP-GN植物植株4、6、9中，外源基因已经从转基因植物花粉基因组中被删除。为了进一步检测了转基因pLF-BGP-FLP-GN植物中未删除前的所有外源基因片段及其外源基因被删除后残留的DNA片段，确定转基因植物花粉基因组中已被删除的T-DNA大小，在T-DNA两端边界序列与loxPFRT融合识别位点序列之间分别设计了一对引物，以转基因pLF-BGP-FLP-GN植物T0代开花前及其与野生型杂交后代的基因组DNA为模板，PCR扩增，得到图16的结果。
从图16中可知，如果以转基因pLF-BGP-FLP-GN植物T0代开花前基因组DNA作为PCR扩增的模板，能够分别得到一条7.3kb(图16-F4-A、-F6-A、-F9-A)的扩增产物，其中7.3kb片段代表融合识别位点loxPFRT序列、BGP-FLP-nos和35S-GUS∷NPTII-nos片段。而以转基因植物与野生型烟草杂交后代基因组DNA作为PCR扩增的模板，由于位点特异性重组酶系统已经删除了融合识别位点序列之间的35S-GUS∷NPTII-nos基因、重组酶基因和一个融合识别位点loxPFRT，所以PCR扩增得到的结果只包括一个融合识别位点序列以及来自于T-DNA片段上的结构序列，大小约为220bp(图16-F4-B、-F6-B、-F9-B)。以上结果再次表明，在转基因pLF-BGP-FLP-GN植物植株4、6、9花粉基因组中，外源功能基因已经被删除。
3、转基因pLF-BGP-FLP-GN植物杂交后代中残余T-DNA片段序列分析根据前人的研究(Gwang Lee et al.，1998)，在FLP/FRT系统中，重组酶FLP特异性识别其位点FRT后，将两位点间的DNA片段切除，剩余部分重新连接，转基因植物基因组上只残留一个识别位点。在本实验中采用了loxPFRT融合识别位点，得到了比已有报道的位点特异性重组酶系统删除效率都高得多的重组酶删除系统。为了搞清楚该系统删除效率提高的原因是否与重组酶蛋白识别和结合融合识别位点，以及具体的切割位置有关，首先提取已经删除了外源基因的转基因植物基因组DNA，根据融合识别位点两端的T-DNA序列设计引物，进行PCR扩增，扩增的结果见图16所示，将其中株系4中大小约220bp的扩增片段分别回收、克隆后，测序分析。
从测序结果可知，在转基因pLF-BGP-FLP-GN植物与野生型烟草杂交后代中，确实只剩下一个loxPFRT融合识别位点以及T-DNA两端的非功能区序列，另外一个loxPFRT融合识别位点、35S-GUS∷NPTII-nos融合基因和BGP-FLP-nos已经被完全删除。重组酶蛋白识别和切割融合识别位点后剩下的残余DNA片段与以前报道的FLP/FRT系统中类似。以上结果也进一步从分子水平确证，在转基因pLF-BGP-FLP-GN烟草的花粉基因组中，所有外源功能基因确实已被删除。
以上对本发明的详细描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明做出各种改变和变形，这些改变和变形均应属于本发明所附权利要求的范围。
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<212>DNA<213>人工序列(artificial)<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(86)<223>融合的特异性识别位点loxP-FRT<400>3ataacttcgt atagcataca ttatacgaag ttatgaccga agttcctata ctttctagag60aataggaact tcggaatagg aacttc 86<210>4<211>237<212>DNA<213>人工序列(artificial)<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(237)<223>基因删除系统<400>4gcgaattcat aacttcgtat agcatacatt atacgaagtt atgaccgaag ttcctatact 60ttctagagaa taggaacttc ggaataggaa cttcggtacc tatgtcgacg tagagctcga120ctcgagaagg atccttcccg ggataacttc gtatagcata cattatacga agttatctga180gaagttccta tactttctag agaataggaa cttcggaata ggaacttcgc tagcggc 23权利要求
1.一种用于转基因植物安全性控制的基因删除系统，包括两个同向的loxP与FRT融合的特异性识别位点loxP-FRT，在所述两个特异性识别位点之间包含一段多克隆位点序列，其中所述loxP为来源于细菌噬菌体的Cre位点特异性重组酶的识别位点，所述FRT为来源于酵母的FLP位点特异性重组酶的识别位点，所述loxP-FRT由loxP识别位点序列与FRT识别位点序列融合形成，所述多克隆位点用于插入各种需要导入植物中的目的基因序列。
2.权利要求1所述的基因删除系统，其特征在于所述特异性识别位点loxP-FRT至少包含34bp的loxP序列和48bp的FRT序列，分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
3.权利要求1所述的基因删除系统，其特征在于所述融合的特异性识别位点中，在loxP序列与FRT序列之间还包括一段间隔序列。
4.权利要求3所述的基因删除系统，其特征在于所述融合的特异性识别位点具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
5.权利要求1所述的基因删除系统，其特征在于其具有SEQ ID NO.4所示的序列。
6.含有权利要求1所述的基因删除系统的植物表达载体。
7.权利要求6所述的植物表达载体，其特征在于在所述植物表达载体中，在基因删除系统的多克隆位点进一步引入一植物组织特异性启动子序列。
8.权利要求7所述的植物表达载体，其特征在于所述植物组织特异性启动子序列为花粉特异性启动子序列、或花器官和胚早期特异性启动子序列。
9.一种融合的特异性识别位点序列，由来源于细菌噬菌体的Cre位点特异性重组酶的识别位点loxP与来源于酵母的FLP位点特异性重组酶的识别位点FRT融合形成，其至少包含34bp的loxP序列和48bp的FRT序列，分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
10.一种制备安全的转基因植物的方法，包括将权利要求1所述的基因删除系统、植物组织特异性启动子与需导入植物的外源基因构建成植物表达载体转化植物而获得安全的转基因植物。
11.权利要求1所述的基因删除系统在制备转基因植物中的用途。
全文摘要
本发明涉及一种用于转基因植物安全性控制的基因删除系统，包括两个同向的loxP与FRT融合的特异性识别位点loxP－FRT，在所述两个特异性识别位点之间包含一段用于插入需导入植物中的目的基因的多克隆位点序列，将本发明的基因删除系统进一步引入一植物组织特异性启动子序列而构建的植物表达载体可以在特定的植物器官完全删除外源基因，本发明的基因删除系统删除效率达100％，可用于制备安全的转基因植物。
文档编号C12N15/82GK1769446SQ200510112579
公开日2006年5月10日 申请日期2005年10月11日 优先权日2005年10月11日
发明者罗克明, 裴炎, 李义, 段辉, 吴彦红, 理查德·麦卡沃伊, 郑雪莲 申请人:西南大学