一种提高蚓激酶组分f－ⅲ在酵母中表达效率的方法

专利名称：一种提高蚓激酶组分f－ⅲ在酵母中表达效率的方法
技术领域：
本发明涉及在酵母中高效表达和生产单一组分蚯蚓蚓激酶F-III的方法，其中包括使用密码子得到优化的蚓激酶F-III基因及特定的酵母发酵培养生长条件，并进而通过肠道给药或注射的方式利用这种源自酵母的、含有蚓激酶F-III重组蛋白作为主要活性成份的胶囊、冲剂、针剂或其他制剂形式从而引起人或哺乳动物心脑和四肢血管血栓形成受到抑制或血栓溶解。
血栓(thrombus)是由于在人体或哺乳动物心脑和四肢血管管腔内的血液发生凝固或血液中的某些有形成分互相粘集在一起后所形成的。在正常的生理状态下，血液中的一些凝血因子不断地被激活并在凝血酶的作用下，形成微量的纤维蛋白并附着在血管内膜上，但这些微量的纤维蛋白又不断地被激活了的纤维蛋白溶解系统所溶解，与此同时，那些被激活的凝血因子也不断地被单核吞噬细胞系统所吞噬。处于相互拮抗过程中的凝血系统和抗凝血系统(纤维蛋白溶解系统)维持着一种动态的平衡，即保证了血液有潜在的可凝固性又始终保证了血液的流体状态。然而，有时在某些因素的作用下，上述动态平衡被打破，使其向凝血过程的一方发生倾斜，血液便开始在心脑和四肢血管管腔内加速凝固并最终形成血栓。例如，在手术后卧床、创伤、晚期癌症全身转移时易形成血栓。
人体内的纤维蛋白溶解系统(纤溶酶系统)是一个具有多重生理功能的蛋白水解系统，其主要作用是降解血管壁上沉积的纤维蛋白。该系统主要包括了三个组成部分，它们分别是纤溶酶原、纤溶酶原激活物和纤维蛋白溶解抑制物。人纤溶酶原(plasminogen)是一个分子量为92,000Da的单链糖蛋白，通过在精氨酸560-缬氨酸561处发生断裂，它可以被激活成具有二条肽链、能水解纤维蛋白的纤溶酶，它是血栓得以溶解的直接参与者。纤溶酶原的激活物有多种，最重要的纤溶酶原激活物是组织型纤溶酶原激活物(t-PA)和尿激酶型纤溶酶原激活物(u-PA)，它们均可作用于纤溶酶原从而使其转变为有活性的纤溶酶，因此可以说它们是通过纤溶酶而间接发挥溶栓作用。纤维蛋白溶解抑制物主要有α2抗纤溶酶(α2-antiplasmin)和纤溶酶原激活物的抑制物(PAI-1)，它们的作用恰好与上述蛋白相反，α2抗纤溶酶的分子量约为70,000Da，它能迅速灭活纤溶酶。而PAI-1则是直接与t-PA或u-PA起反应，使它们丧失激活能力。
随着人们生活水平的不断提高和工作速度的不断加快，心脑和四肢血管发生血栓的几率也越来越高，因此，具有纤溶酶活性的蛋白或能够激活人纤溶酶原的物质都有可能成为新一代的溶栓制剂并在临床治疗上发挥重要作用。
蚯蚓又称地龙，属环节动物门(Annelida)、毛足纲(Chaetopoda)，种类非常多，仅在我国境内就有200多种。在我国传统医药学中，蚯蚓作为中药具有解热、镇定、利尿和降压等功效，而蚯蚓提取物中含有纤溶成分在我国古代医药文献中早已有记载[1]。1982年，日本人Mihara首次从正蚓科(Lumbricidae)的粉蚯蚓(Lumbricus rubellus)中提取出一组具有纤溶酶活性的蛋白，并将其命名为蚓激酶(lumbrokinase)[2]。现已知道，在粉正蚓中至少含有六种不同的蚓激酶组分，分另被命名为F-I-0、F-I-1、F-I-2、F-II、F-III-1和F-III-2，它们的分子量分别为29662、29667、24664、24220、24196和2 3013Da，经检测发现它们均具有纤溶酶活性，而且都是单一的肽链结构。此六种酶并不是由同一个基因所编码，而是分别来自至少4个同源性很低的基因的同工酶[3，4]。特别值得指出的是，虽然称之为同工酶，但它们之间在功能上实际上也存在着很大的差异，例如，蚓激酶组分F-II不仅具有直接的纤溶酶活性，而且还是唯一具有纤溶酶原激活物的蛋白[5]，在此功能上有些类似于t-PA或u-PA。另外，人们还发现，在其他一些种类的蚯蚓中，如赤子爱胜蚓(Eisenia foetida)也存在着多组分的蚓激酶现象[5，6，7]。2003年，我国科技工作者王峰等人利用离子交换和液相层析等方法从赤子爱胜蚓中共分离出7种不同的蚓激酶组分，分别被命名为EFE-a、EFE-b、EFE-c、EFE-d、EFE-e、EFE-f和EFE-g，经MALDI-TOF质谱分析，测得它们的分子量分别为24663、29515、29690、29595、24201、24170和23028Da。通过分子量比对以及N-端部分氨基酸序列分析，认为EFE-a可能与粉正蚓中的F-II相当，EFE-b、EFE-c和EFE-g则与F-III-1和F-III-2非常相似，EFE-d和EFE-e类似于粉正蚓中F-1-1或F-1-2，而EFE-f可能与F-1-0相当[5]，遗憾的是他们并没有克隆出编码上述蚓激酶组分的任何一个基因。
迄今为止，有许多研究证明蚓激酶在体外具有很强的纤溶酶活性。特别值得提出的是，与其他纤溶酶所不同的是，蚯蚓蚓激酶可以通过口服或肠道给药的方式而发挥作用。1992年，Mihara等人开始给志愿病人口服提纯的蚓激酶成分，随后每日抽血进行多项生理和生化指标的测定，结果发现1)纤维蛋白降解产物在口服给药后1-2天便开始升高，保持到第17天后活性消失；2)组织纤溶酶原活激活剂(t-PA)的含量和纤溶酶活性在给药期间一直增高，这预示着蚓激酶不但具有纤溶酶的活性，而且可以通过激活t-PA而发挥纤溶活性[8]。
蚓激酶制剂现已由中国科学院生物物理所研制成功，现由江中制药厂(商品名博洛克)和青岛双龙制药厂(商品名普恩复肠溶胶囊)生产经销，总有效率为93.73％，显效率为7.6％，特别对中风引起的肢体瘫痪、口眼歪斜、语言障碍的恢复效果更为明显[9]。但蚓激酶制剂的生产目前仍面临着许多问题有待解决，如1)生产规模受到蚯蚓生长周期的影响，生产成本比较高，因此不能满足市场的需求；2)蚯蚓中蚓激酶的含量并不高，直接利用蚯蚓粗制备物，成品制剂中有效成份的含量很低，若要提高药品的有效成份，需要额外的提取加工过程，但这会使药品的价格更高，普通患者难以接受，另外，从蚯蚓中提取蚓激酶的过程也很繁杂；3)人工饲养的蚯蚓中常含有一些寄生虫，可能会对人类的健康带来潜藏的危害；4)由于该蚓激酶制剂的非单一活性成份的作用，给研究该药物在体内的代谢过程带来了极大的困难，由此也造成了该类制剂药效的不确定性，另外，也更无法作为注射液而加以使用。
基因工程研究领域的最新进展使利用一些酵母细胞作为生物反应器而高效表达外源基因成为可能，特别值得提出的是巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统。迄今为止，人们利用此表达系统已成功表达的外源蛋白超过300种[10]，包括来自细菌、真菌、原核生物、植物、动物和人类等广泛来源的基因。作为生物反应器，其优越性还在于1)酵母为单细胞生物，遗传背景、生理特征较为清楚。其生长营养要求简单，细胞密度高，易于操作，而且发酵技术较为成熟、工艺简单、成本低廉；2)在蛋白质诱导表达过程中以甲醇为唯一碳源，无抗药性标记、培养过程中不分泌有毒物质，毒性较细菌小，具有良好的安全性；3)利用甲醇诱导乙醇氧化酶启动子(A0X1)进行重组蛋白质的表达，无论胞内还是分泌均有可能实现高效表达，且使用分泌型表达时本底表达很少，产物易于纯化；4)酵母为真核生物，可进行很多典型的高等真核生物蛋白翻译后加工修饰，如糖基化、脂酰化、磷酸化以及蛋白裂解、折叠、二硫键的形成等[11，12，13]。
2001年，尽管日本人Sugimoto等人首次实现了蚓激酶F-III-2基因在毕赤酵母中的初步表达，并证实了分泌到酵母体外的这种重组蛋白是具有纤溶酶活性的，但令人非常遗憾的是，该论文不仅对重组蚓激酶F-III-2的蛋白表达量没有过任何文字描述，也没有公布有关该重组酵母的任何培养生长条件[14]。另外，再就是他们所使用的F-III-2基因是源自粉正蚓的DNA编码序列，在导入毕赤酵母表达之前并未进行过任何修饰和改造。
在本发明之前，还没有人对编码任何蚯蚓蚓激酶组分F-III的基因按照酵母所偏爱的密码子进行过优化以便其能更稳定和更高效地在酵母体内表达，由此极大地增加重组蚓激酶F-III的生物产量，也未对重组酵母的发酵培养条件进行过优化，从而为大规模、工业化发酵生产这种单一组分的重组蚓激酶奠定基础，而这类蛋白在经过部分或完全纯化后有可能通过肠道给药或注射的方式使人体或其他哺乳动物心脑和四肢血管血栓的形成受到抑制或血栓受到溶解。
本发明的目的之一是要证实编码蚯蚓蚓激酶单一组分F-III的基因在不改变任何氨基酸序列的前提下，若按照酵母所偏爱的密码子修饰后，不仅可以在酵母中表达和生产，而且其表达效率要比未经过密码子优化的蚓激酶F-III基因有极大的提高，从而使分泌到体外的重组蚓激酶F-III的生物量也大大增加，由此为该重组蛋白的下游加工带来极大的方便并能显著够降低生产成本。按照一个优先的实施方案，密码子优化后的蚓激酶F-III基因要能够在毕赤酵母中高效表达和生产，而所产生的蚓激酶F-III重组蛋白不仅可以分泌到体外，而且该重组蛋白就如同源自蚯蚓的天然蛋白或其他表达系统所产生的该蚓激酶重组蛋白一样，具有类似的纤溶酶活性。
本发明的目的之二是提供最适的重组酵母培养生长和诱导表达条件，按照一个优先的实施方案，特别提供了有关重组毕赤酵母的最适培养生长和诱导表达条件，由此使该重组酵母的生长量和重组蛋白蚓激酶F-III的分泌量都尽可能地达到最大化，以便为这种重组酵母的大规模工业化生产、低成本发酵和纯化奠定基础。
本发明利用酵母表达系统生产单一组分的蚯蚓蚓激酶F-III，该重组蛋白在溶解纤维蛋白活性方面与天然蛋白类似。按照一个优先的实施方案，就是本发明提供了极大提高蚓激酶单一组分F-III在毕赤酵母中表达效率的方法、重组酵母的高密度发酵方法以及如何应用这种重组蚓激酶蛋白的方法。
本发明利用酵母表达系统生产单一组分的蚯蚓蚓激酶F-III，如果将其加工成口服胶囊、冲剂、针剂或其它制剂，则具有廉价、安全、功效确定和使用方便的特点，会使更多的人或动物得到保护。按照一个优先的实施方案，人或哺乳动物只需以肠道给药的方式或注射的方式利用这些源自酵母发酵产物的部分纯化产物或完全纯化产物(剂量可确定)制备的胶囊、冲剂、针剂或其它制剂便可获得对人和哺乳动物心脑和四肢血管类血栓疾病的抵抗能力。
本发明所指的蚓激酶重组蛋白F-III是指在酵母中表达和生产的，首先是编码蚯蚓蚓激酶单一组分F-III的基因被分离出来，该基因密码子在经过优化或未经过优化的情况下，被分别插入到一个带有α-因子信号肽序列的酵母表达载体上，在该质粒载体上，还含有一个诱导性启动子，该启动子位于蚓激酶基因F-III的上游，它操纵蚓激酶基因F-III在酵母细胞中的表达。该质粒载体经线性化后，通过LiCl法或电融合法转化酵母细胞，稳定整合到酵母染色体上，此重组酵母在发酵培养过程中经过诱导后，表达的重组蚓激酶F-III在信号肽的引导下得以分泌到培养基中。
本发明提供了极大提高蚯蚓蚓激酶F-III重组蛋白在酵母细胞中生物产量的方法，按照一个优先的实施方案，本发明提供了极大提高单一组分蚯蚓蚓激酶F-III重组蛋白在毕赤酵母细胞中生物产量的方法，而该重组蛋白已知在天然状态下可引起人体或其他哺乳动物心脑和四肢血管血栓的形成受到抑制或血栓受到溶解。或者说，本发明所指的蚯蚓蚓激酶单一组分F-III具有纤溶酶活性，具有与源自蚯蚓中相同组分的天然蚓激酶类似的纤溶酶活性。或者更确切说，本发明的蚓激酶蛋白与源自蚯蚓或其它常规表达系统产生的该蚓激酶重组蛋白一样，均能够通过口服、肠道给药或注射的方式引起人体或其他哺乳动物心脑和四肢血管血栓的形成受到抑制或血栓受到溶解。
本发明的重组蛋白可以是该蚓激酶F-III天然蛋白的全部。然而，在某些具体实施方案中，所表达的蚓激酶也可能只是该天然蛋白的一部分。有时，该蚓激酶可与另外一个蚓激酶组分在同一个酵母细胞内同时分别表达或拼接在一起形成融合蛋白共同表达。蛋白的融合可以通过蛋白翻译后加工、共价结合的方式，或者通过DNA重组技术使基因在翻译表达前就相互拼接在一起，而这两种技术是本领域专家早已熟知的技术。
在酵母细胞中蚓激酶F-III蛋白基因表达效率的高低，直接关系到以后该重组蛋白的提取加工利用及所生产相关产品成本的高低，按照一个优先实施的方案，为提高蚓激酶F-III在酵母细胞中的表达量，编码蚓激酶F-III的基因可以按照酵母所偏爱的密码子进行优化，以便使该基因在酵母细胞中更稳定，在转录成mRNA和翻译成蛋白时效率更高。
对本发明所使用的方法和其它相关事项极为重要的是一些质粒载体的构建，它们在获得本发明所指的酵母细胞及其表达重组产物的加工应用中起重要作用。用于转化酵母细胞的质粒载体由密码子优化后的、编码单一组分的蚯蚓蚓激酶F-III基因或其衍生物的DNA序列和操纵该基因或DNA序列在所说的酵母细胞中表达的一个诱导性启动子组成。在某些具体实施方案中，质粒载体还包括一个选择性或标记基因，主要用于重组酵母细胞的筛选和检测。在某些具体实施方案中，本发明的诱导性启动子是醇氧化酶基因启动子(A0X1)。正如上面所述，按照某些具体的实施方案，本发明的质粒载体用于转化毕赤酵母，它所编码的外源蛋白是蚯蚓蚓激酶F-III，更进一步说，质粒载体所编码的重组蛋白F-III能够使人或其他哺乳动物心脑和四肢血管血栓的形成受到抑制或血栓受到溶解，就象天然蛋白和源自其它表达系统所产生的该蚓激酶蛋白一样。
本发明也提供了酵母细胞的转化和重组酵母细胞的筛选方法，它包括以下步骤1)蚯蚓蚓激酶F-III基因的克隆以及按照酵母所偏爱的密码子对该基因密码子进行优化；2)构建一个质粒表达载体，其中含有编码蚯蚓蚓激酶单一组分F-III蛋白的基因或其衍生物的基因(包括基因密码子被优化或与其他基因相互融合等)，而且该基因或其衍生物被置于一个诱导性启动子的操纵之下；3)通过电融合法或LiCl法用上述质粒表达载体转化酵母细胞；4)挑选转化的酵母细胞单菌落，逐一分别接种到MM和MD固体平板培养基上，那些在MD培养基上生长正常但在MM平板上生长及其缓慢或完全不生长的酵母单菌落就是含有外源基因的重组子。
按照一个具体的实施方案，本发明提供了经过优化的重组毕赤酵母培养生长条件及重组蚓激酶F-III的纯化方法，它包括了以下四个阶段1)菌体培养，在经过22-24小时的培养后，酵母菌体湿重将达到95-100g/L左右；2)饲喂碳源，在培养4小时后，酵母菌体的湿重将到达200-210g/L左右；3)诱导表达，加入甲醇，诱导酵母细胞高效表达重组蚓激酶F-III蛋白并将其分泌到培养基中；4)蛋白纯化，发酵液经离心、硫酸铵沉淀和过凝胶分子筛等步骤，蚓激酶F-III重组蛋白的纯度可达99％以上。
本发明涉及到了一种胶囊、冲剂、针剂或其它制剂的组成成分问题，胶囊、冲剂或其它制剂中至少含有源自酵母的蚓激酶F-III重组蛋白作为主要的活性成分。就本发明而言，胶囊、冲剂或其它制剂中含有的蚓激酶F-III重组蛋白应该能够精确定量，以便更有效地发挥该纤溶酶的溶栓作用。按照本发明的一个优先实施方案，本发明的胶囊、冲剂、针剂或其它制剂中所含有的源自毕赤酵母的重组蛋白是单一组分的蚯蚓蚓激酶F-III，它能够使人体或其他哺乳动物心脑和四肢血管血栓的形成受到抑制或血栓受到溶解，就如同天然蛋白或其它表达系统产生的蚯蚓蚓激酶F-III一样。
本发明在详细介绍酵母表达系统时仅提到了毕赤酵母表达系统，然而，正如本领域专家所早已熟知的酵母表达系统那样，许多种酵母表达系统都可以利用本发明提供的方法进行转化、表达和生产。因此，所有这些酵母表达系统都应包括在本发明的权利要求范围之内。
就象下面实例中所要详细描述的那样，本发明描述的酵母转化方法中所用的质粒表达载体是一个整合性质粒表达系统，按照一个优先的实施方案，本发明所使用的质粒是表达载体pPIC9K，它与日本人Sugimoto所使用的pPICZαB也是不同的[14]。
本发明包括以下几个组成部分1)对编码蚓激酶F-III的基因进行密码子优化，在不改变蚓激酶F-III蛋白氨基酸序列的前提下，根据酵母所偏爱的密码子，人工合成编码蚓激酶F-III的全基因DNA核苷酸序列，该产物同样被直接插入到pGEM-T的T位点内，经蓝白系统选择，可获得含有外源插入片段的细菌克隆(重组子)，序列分析所获基因的正确性和完整性；2)利用DNA重组技木构建酵母质粒表达载体，它们分别含有未经密码子优化的蚓激酶F-III蛋白基因(作为对照)以及密码子优化后的蚓激酶F-III蛋白基因或其衍生物(包括与其他基因的相互融合等)，本发明不仅允许在一种酵母细胞中生产一种蚯蚓蚓激酶蛋白，而且可以在一种酵母细胞中同时生产多种组分的蚯蚓蚓激酶重组蛋白。将编码各组分的蚯蚓蚓激酶蛋白的基因构建在同一个表达载体上，然后用其转化酵母细胞，从而在一种酵母细胞中可同时表达多种不同的蚯蚓蚓激酶组分。例如，粉正蚓中含有F-I-1、F-II和F-III-1等6种组分的蚓激酶，若将其中的两个蚓激酶基因构建在同一个酵母表达载体上并分别受不同的诱导性启动子控制，然后将其同时导入酵母细胞，从而在一个酵母细胞中就可以同时产生这两种蚓激酶；也可以将这编码这两种蚓激酶的基因在转化前就相互融合，但并不改变各自的移码框架，在导入酵母后，其体内便可表达由这两种蛋白形成的一个融合蛋白，由此，便可能进一步提高这两种蛋白的溶栓活性。此外，酵母也可以通过多次转化或者同时用多个含有不同蚓激酶基因的表达载体同时转化的方法获得。4)高表达酵母重组子的筛选，经过电融合或LiCl法将上述酵母质粒表达载体分别导入酵母受体细胞，在RDB固体平板培养基上挑选转化的酵母细胞单菌落，逐一分别接种到MM和MD固体平板培养基上，那些在MD培养基上生长正常但在MM平板上生长及其缓慢或完全不生长的酵母单菌落就是含有外源基因的重组子。为了筛选到高表达重组酵母菌株，将获得的酵母重组子逐一接种在诱导表达培养基中进行诱导表达，在相同的培养条件下，对其诱导表达产物进行纤溶酶活性鉴定，从中可挑选出表达效率最高的酵母菌株；5)提供重组酵母最适生长培养和诱导表达条件，重组酵母的高密度发酵分为了菌体培养、碳源饲喂和诱导表达三个阶段，在每个阶段均给予最适的培养时间和环境条件。发酵液经离心、硫酸铵沉淀和过凝胶分子筛过滤后，可得到纯度达99％以上的蚓激酶F-III重组蛋白；6)以该重组蛋白为主要活性成份加工制作成胶囊、冲剂、针剂或其它制剂，在通过肠道给药或注射给药的情况下，有可能使人体或其他哺乳动物心脑和四肢血管血栓的形成受到抑制或血栓受到溶解，从而达到防病和治病的目的。
为了详细描述本发明的某些优先实施方案，并以相应的绘图作参考

图1密码子未优化的蚯蚓蚓激酶组分F-III基因的克隆及其酵母表达p9KFIII的构建。
图2密码子优化后的蚯蚓蚓激酶组分F-III基因的克隆及其酵母表达载体p9KFIIIM的构建。
图3蚯蚓蚓激酶组分F-III基因改造前后密码子对比。N代表密码子优化前的基因序列；M代表密码子优化后的基因序列。
图4利用固体平板法检测源自毕赤酵母的重组蚓激酶组分F-III蛋白的纤溶酶活性。PCK赤子爱胜蚓提取液(阳性对照)；CK1经pPIC9K质粒转化的酵母重组子诱导表达产物(阴性对照)；CK2BMMY培养液(阴性对照)；1-5含密码子未经优化的蚓激酶组分F-III基因的不同重组酵母菌株的诱导表达产物；6-11含密码子优化蚓激酶组分F-III基因的不同重组酵母菌株的诱导表达产物。
图5SDS-PAGE检测PP-FIII和PP-FIIIM高密度发酵表达产物及通过离心、硫酸铵沉淀和凝胶分子筛纯化后的蚓激酶组分F-III重组蛋白。1为标准蛋白分子量marker(Amersham Biosicences产品)；2为经pPIC9K质粒转化的酵母重组子诱导表达产物(阴性对照)；3为PP-FIII高密度发酵后诱导表达产物；4为和PP-FIIIM高密度发酵后诱导表达产物；5为纯化后的重组蚓激酶组分F-III，源自PP-FIII高密度发酵后诱导表达产物；6为纯化后的重组蚓激酶组分F-III，源自PP-FIIM高密度发酵后诱导表达产物；下面以毕赤酵母表达蚯蚓蚓激酶F-III为例，描述一些优先的实施方案，但本发明的应用不仅限于此。
选择蚯蚓蚓激酶F-III在酵母中表达和生产是因为心脑和四肢血管栓塞是一种非常常见的人或哺乳动物疾病，尽管目前所使用的溶栓药物很多，但都存在着价格极高、功效不确定、副作用大和安全性差等不足，而蚯蚓蚓激酶组分F-III是蚯蚓蚓激酶中纤溶活性最强的一类丝氨酸蛋白酶类，因此很有可能被开发成为新一代的溶栓药剂。选择毕赤酵母表达系统是因为它是目前最常用的一个外源重组蛋白表达系统。
实施例11.蚓激酶F-III基因的克隆RNA抽提试剂盒(Flash UNIQ-10柱式总RNA抽提试剂盒)购自上海生工生物工程公司，根据试剂盒中所提供的方法，从赤子爱胜蚓(Eisenia foetida)(该蚯蚓由中国农业科学院土壤肥料研究所杨珍基研究员提供)中提取出其总RNA作为RT-PCR扩增的模板。根据已公布的蚯蚓蚓激酶组分F-III的DNA核苷酸编码序列(见GenBank，登录号AB045719)，合成了一对特异性引物(由上海生工生物工程公司合成)，其中上游引物P1(5’端引物)为5’-AACTCGAGAAAAGAGAGGCTATTGTCGGAGGAATTGAAGCC-3’，其中含有XhoI限制性酶切位点和酵母KEX2基因表达产物切割识别序列(见引物中下划线处)；下游引物P2(3’端引物)为5’-AAAGCGGCCGCTTAGTTGTTGGTGATTGTGTCGGT-3’其中含有NotI限制性酶切位点(见引物中下划线处)。RT-PCR试剂盒(TaKaRa RNALAPCRTMKit)购自大连宝生物工程有限公司，根据该试剂盒中所提供的方法，利用P1和P2引物，以上述提取出蚯蚓总RNA为模板，通过RT-PCR扩增获得了一个长度约为750bp左右的DNA片段(其中反转录条件反应体系20μl，以P2为引物合成cDNA链，42℃水浴60min进行反转录；95℃处理5min灭活反转录酶。PCR条件反应体系100μl，以P1和P2为扩增引物，首先，94℃预变性4min；然后按照94℃变性30sec、55℃退火45sec、72℃延伸90sec，进行35个循环；最后，72℃延伸10min)。该DNA片段被直接插入到pGEM-T质粒中的T位点内(见Promega公司产品说明书)，按照该公司提供的方法，通过蓝白系统筛选，得到含有该基因的细菌克隆pGEMFIII(见图1)，然后，通过核苷酸序列分析，确定该蚓激酶F-III的基因是正确和完整的(见序列表的3，现该序列已经在GenBank登录，登录号AY684711)(DNA测序工作由上海生工生物工程公司完成)。与此前已公布的粉正蚓蚓激酶组分F-III-1(见GenBank，登录号AB045720)和F-III-2(见GenBank，登录号AB045719)比对发现，DNA核苷酸序列同源性分别为89.1％和99.6％，而氨基酸序列同源性分别达到了89％和98.8％，由此可见，由赤子爱胜蚓所克隆出的该蚓激酶基因确实也属于蚓激酶组分F-III，并且与源自粉正蚓的蚓激酶组分F-III-2基因几乎完全一致。
2.酵母表达载体p9KFIII的构建因为在扩增蚓激酶F-III基因时，在其5’端和3’端引物中分别引入了XhoI和NotI限制性酶切位点，所以pGEMFIII质粒DNA经XhoI和NotI双酶切后，可将蚓激酶F-III基因切下来，通过琼脂糖凝胶电泳，可分离获得该DNA片段，随后将其插入到质粒pPIC9K中(XhoI和NotI双酶切)，便构建成酵母诱导性表达载体p9KFIII(见图1)。
质粒pPIC9K购自美国Invitrogen公司，它是一个高效的酵母诱导性表达载体，在甲醇的诱导下，可高效表达外源基因。因为在该表达载体多酶切位点前含有α-因子信号肽编码序列，在与外源蛋白基因融合表达后，可引导外源重组蛋白向酵母胞外分泌。在分泌到胞外的过程中，该信号肽序列可以被酵母Kex2或Ste13基因表达产物完全地切割下来，从而完全不会影响到重组蚓激酶F-III的活性。
实施例2
1.密码子优化的蚓激酶F-III基因的人工合成尽管蚯蚓和酵母都属于真核生物，但它们在基因密码子偏好方面仍然存在着一定的差异，这种差异有可能会影响到蚓激酶基因在酵母中的稳定性和表达效率。为提高蚓激酶的生物产量，根据业已公布的蚓激酶组分F-III的氨基酸序列(见GenBank，登录号AY684711)，在不改变该蛋白氨基酸序列的前提下(见序列表的1)，按照酵母所偏爱的密码子[15]，人工设计和合成了新的蚓激酶组分F-III的全基因DNA核苷酸序列。同时，为了便于今后各种质粒载体的构建，在人工合成该蚓激酶F-III基因DNA核苷酸序列的同时，在该基因的5’端第一个密码子ATT前合成和添加了限制性酶切位点XhoI以及酵母KEX2基因表达产物切割识别序列(见序列表中的2)；，在该基因的3’端中止密码子TAA后增加了限制性酶切位点NotI(上述基因拼接和合成工作由上海博亚生物技术公司代为完成)。在不改变蚓激酶F-III氨基酸序列的前提下，密码子优化后的基因改变了其中的120个核苷酸碱基，总共涉及到104个密码子，而G+C含量由原来的51％变为49％，改造前后对比见图2。
2.密码子优化蚓激酶F-III基因的克隆上述人工合成的基因DNA片段被直接插入和连接到pGEM-T质粒中的T位点内(见Promega公司产品说明书)，按照该公司所提供的方法，通过蓝白系统筛选，得到含有密码子优化后的蚓激酶F-III基因的细菌克隆pGEMFIIIM(见图3)，然后，通过核苷酸序列分析，确定编码蚓激酶F-III的基因是正确和完整的(见序列表2)(DNA测序由上海博亚生物技术公司代为完成)。
3.酵母表达载体p9KFIIM的构建因为在人工合成密码子优化后的蚓激酶F-III基因时，在其5’端和3’端引物中分别引入了XhoI和NotI限制性酶切位点，所以pGEMFIIIM质粒DNA经XhoI和NotI双酶切后，可将密码子优化后的蚓激酶F-III基因切下来，通过琼脂糖凝胶电泳，可分离获得该DNA片段，随后将其插入到质粒pPIC9K中(XhoI和NotI双酶切)，便构建成酵母诱导性表达载体p9KFIIIM(见图3)。
实施例31.p9KFIII和p9KFIIIM质粒DNA的制备首先用碱裂解法[16]从大肠杆菌细胞DH5α(购自美国GIBCO公司)中分别提取出p9KFIII和p9KFIIIM质粒DNA，然后用1-2倍过量的限制性内切酶BglII分别酶切上述质粒DNA使之完全线性化，可利用琼脂糖凝胶电泳检测酶切是否完全。然后用酚和氯仿分别抽提上述酶切产物，乙醇沉淀，经冷冻干燥后，将沉淀重新溶解在无菌的去离子水中，-20℃冰箱中保存备用。
2.酵母细胞的转化挑取毕赤酵母菌株GS115(购自美国Invitrogen公司)单菌落，接种于5mlYPD培养基(1％酵母提取物，2％胰蛋白胨，2％葡萄糖)中，30℃振荡培养过夜，从中取出0.5ml培养液，接种于500ml YPD培养基中，30℃振荡培养至OD600nm光吸收值为1.4-1.5左右，4000rpm4℃下离心2分钟收集酵母细胞。将沉淀的酵母细胞重新悬浮在500ml冰浴的无菌水中，然后4000rpm4℃下离心2分钟再次收集酵母细胞。重复一次上述洗涤过程。用25ml冰浴的1mol/L山梨醇重新悬浮沉淀的酵母细胞，如上离心收集酵母细胞，再以0.5ml冰浴的1mol/L山梨醇重新悬浮沉淀的酵母细胞，从中取出80ul酵母感受态细胞，分别与上述制备的线性化质粒载体DNA(4-5ug)充分混合，然后转移到冰浴后的0.2cm无菌电击杯中。利用电击仪MicropulserTM(BioRad公司产品)将线性化的质粒DNA导入酵母感受态细胞中，所使用的电击参数为0.8kv，11.5uF。电击完成后，立即向电击杯中加入0.8ml冰浴的1mol/L山梨醇溶液，充分混匀后，将该菌液以每板200ul的体积涂布到RDB[1.34％Yeast Nitrogen Base With Ammonium Sulfatewithout amino acids(YNB)(Sigma公司产品)，1mol/L山梨醇，1％葡萄糖，0.00004％Biotin，0.005％谷氨酸，0.005％甲硫氨酸，0.005％赖氨酸，0.005％亮氨酸，0.005％异亮氨酸，1.5％琼脂]固体平板培养基上，平板倒置并置于30℃培养箱中培养至转化重组子出现。
用无菌牙签挑取RDB固体平板培养基上新长出的酵母单菌落(重组子)，分别点种MM(1.34％YNB，0.00004％Biotin，0.5％甲醇，1.5％琼脂)平板和MD(1.34％YNB，0.00004％Biotin，2％葡萄糖，1.5％琼脂)固体平板培养基；30℃培养2天，在MM和MD上生长一致的，其表型为Mut+。在MD上生长正常，在MM上生长缓慢或不长的，表型为Muts。
3.高表达酵母菌株的筛选挑取在MD平板上生长正常、但在MM平板上生长缓慢的转化子，接种于5mLBMGY[1％酵母提取物，2％胰蛋白胨，100mmol/L磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34％YNB，0.00004％Biotin，1％甘油(V/V)]液体培养基中(该培养基以甘油为碳源)，30℃摇床培养2天，4000rpm离心2min，去上清；用1mL BMMY[1％酵母提取物，2％胰蛋白胨，100mmol/L磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34％YNB，0.00004％Biotin，0.5％甲醇]液体培养基重新悬浮菌体(该培养基以甲醇作为外源蛋白基因表达诱导物)，30℃诱导培养4天；10000rpm4℃下离心5min，收集含有可能含有蚓激酶F-III重组蛋白的上清液。该上清液可直接用于纤溶酶活性的测定。
蚓激酶纤溶活性的检测完全按照Deogny等人所报道的固体平板方法[17]，待含纤维蛋白原(Sigma公司产品)和凝血酶(Sigma公司产品)的琼脂完全凝固后，用灭菌后的打孔器在平板上打出数个直径在6mm左右的圆孔，均匀分布在培养皿平板的四周。取各重组子诱导表达上清液(见上文)40ul加入到上述打好的圆孔中。以仅含有质粒载体pPIC9K的酵母细胞诱导表达产物上清液作为阴性对照。取赤子爱胜蚓1条，在与1ml的BMMY液体培养基混合，然后用玻璃匀浆器充分研磨，匀浆液在室温下10000rpm离心5分钟，取上清液40ul也加入到上述打好的圆孔中作为阳性对照。37℃下放置18小时后，结果发现，除作为阳性对照的赤子爱胜蚓提取液可形成透明圈外(纤维蛋白被溶解)，经p9KFIII和p9KFIIIM质粒DNA转化所获得的一些重组酵母菌株也能够形成透明圈(见图4)。由此可得出结论，在酵母中所表达的重组蚓激酶F-III是具有纤溶酶活性的，不管该基因是否按照酵母所偏爱的密码子进行过优化。
但特别值得指出的是，重组酵母菌株中若含有密码子优化后的蚓激酶F-III基因，其所形成透明圈的直径一般远远大于那些含有密码子未经优化F-III基因的那些重组酵母菌株的透明圈直径(见图4)，由此表明这两种重组酵母在分泌重组蚓激酶F-III蛋白的数量上是有显著差异的，这意味着基因密码子在经过优化后确实可以极大地提高蚓激酶组分F-III基因在酵母细胞中的表达效率以及分泌到胞外的生物产量。经由pPIC9K质粒转化的酵母菌株是不能够形成任何透明圈的(阴性对照)。另外，有些重组酵母菌株也不能够形成透明圈，可能与所导入的蚓激酶组分F-III基因未能表达有关。
根据所形成透明圈直径的大小，从上述两类多个酵母重组子中分别挑选出蚓激酶F-III表达效率最高(透明圈直径最大)的酵母菌株，并将其命名为PP-FIII(含有密码子未经优化的蚓激酶F-III基因)和PP-FIIIM(含有密码子优化后的蚓激酶F-III基因)。
实施例41.种子液的制备从RDB固体平板上挑取PP-FIII和PP-FIIIM酵母单菌落，分别接种于10mLYPD液体培养基中，30℃振荡培养过夜，以10％的接种量转接于100mL YPD液体培养基中，30℃振荡培养24小时，再以10％的接种量转接于1L BMGY培养基中，30℃振荡培养24小时，然后将其作为种子液。
2.重组酵母在20L发酵罐中的高密度发酵本发酵过程可以分为以下三个阶段1)菌体培养阶段在20L发酵罐(上海宝兴生物设备工程有限公司产品)中盛放了10L基础发酵培养基[10×BasalSalts(2.67％磷酸，0.093％硫酸钙，1.82％硫酸钾，1.49％硫酸镁，0.413％氢氧化钾)+4％甘油]，在接种前先加入28％的氨水使该培养基的pH值维持在5.0左右(氨水同时也可作为酵母菌体生长的氮源)，再按下述比例，在每升基础发酵培养基中加入4.37ml微量盐溶液PTM1(0.6％硫酸铜，0.008％碘化钠，0.3％硫酸锰，0.02％钼酸钠，0.002％硼酸，0.05％氯化钴，2％氯化锌，6.5％硫酸亚铁，0.025％生物素，0.5％硫酸)。按10％的比例接种此前制备好的种子液，30℃通气搅拌培养24小时左右。在该阶段进行过程中，随着菌体的生长，培养基中的溶氧量将由100％逐渐降低，当培养基中的碳源消耗完后，溶氧量将再度升高至80％以上，此时菌体的湿重将达95-100g/L。2)饲喂碳源阶段通过蠕动泵流加补料液，补料液为50％的甘油(其中含有12ml PTM1/L)，流加量为18.15ml/hr/L。30℃通气搅拌培养4小时左右，在此阶段调整通气量使溶氧量始终大于20％，此时菌体湿重将达200-210g/L左右。3)诱导表达阶段流加甲醇(含有12ml/L PTM1)，使甲醇的浓度始终维持在0.3％左右，溶氧量始终大于20％，30℃通气搅拌培养108小时，此时的重组蚓激酶F-III蛋白表达量达到最高峰。取数毫升发酵液经5000rpm4℃下离心10分钟，分别自PP-FIII和PP-FIIIM发酵产物中各取10ul发酵上清液进行SDS-PAGE电泳检测，可知蚓激酶F-III重组蛋白的分子量约为26KD左右(见图5)，利用凝胶成像仪(美国UVP公司产品)对该凝胶进行分析，确认PP-FIIIM的重组蚓激酶F-III蛋白表达量约为PP-FIII的6倍。
3.重组蛋白的纯化待一个发酵周期全部结束之后，留取500mL发酵液作为种子液(接种量为5％)直接进行下一轮的发酵过程。类似的操作累计共进行3轮，在每轮发酵过程中，均对菌体的生长量和蚓激酶F-III重组蛋白表达量进行测定。另外，在每轮发酵过程完全结束后，还取少许菌液涂布在YPD固体平板培养基上，并从中任意挑取10个单菌落，并完全按照蔡传奇等人的方法[18]，快速提取其基因组DNA并对其进行PCR检测，结果发现，菌体的生物量，生长速度及蚓激酶F-III重组蛋白的表达量在各轮发酵过程中基本保持稳定，另外，PCR的检测结果也证实PP-FIII和PP-FIIIM具有良好的遗传稳定性(见表1)。
表1.重组毕赤酵母PP-FIII和PP-FIIIM菌株的遗传稳定性和外源蛋白表达稳定性的测定
在一个发酵周期结束之后，除留下500mL发酵液作为种子液外，其余的发酵液经5000rpm 4℃下离心10分钟，留取上清。在其中分别加入固体硫酸铵至饱和度达80％，在室温下搅拌1个小时，然后5000rpm在室温下离心20分钟，收集沉淀，将沉淀重新悬浮在10ml 100mM Tris-HCl(pH8.0)缓冲液中，并转移至透析袋中，然后在4℃下针对1L的100mM Tris-HCl(pH8.0)缓冲液进行透析，以除去剩余的硫酸铵，在24小时的透析时间内更换三次外透析液。在透析结束后，自透析袋中吸出被透析物，然后按照Ausubel等人的方法[19]，将该透析物过Sephadex G-75分子筛凝胶柱(Sephadex G-75购自AmershamBiosciences公司)进行进一步的纯化，所使用的柱体积为80×2.5cm。在上样后用100mM Tris-HCl(pH8.0)缓冲液进行洗脱，按4ml的体积分部收集洗脱液。用固体平板法(见实施例3的3)检测每一部分洗脱液的纤溶酶活性，然后将所有能形成透明圈的洗脱部分汇集在一起，再次加入硫酸铵至终浓度达80％进行沉淀和透析，方法同上。将透析袋中的透析物分别转移至干燥瓶中，经冷冻干燥后，沉淀重新悬浮于10ml灭菌的去离子水中，通过SDS-PAGE电泳和凝胶成像仪分析，发现其蛋白纯度可达99％以上(见图5)。另外，就是重组蚓激酶F-III蛋白非常稳定，经过上述两次硫酸铵沉淀、透析和柱层析等长时间处理后，其活性并未受到任何损失。
利用Lowry法(蛋白测定试剂盒购自Sigma公司，货号为P5656)测定其中蛋白的含量(具体方法见试剂盒说明书)，其中PP-FIII蚓激酶F-III重组蛋白含量为0.4g/ml(三次高密度发酵的平均值)，而PP-FIIIM蚓激酶F-III重组蛋白含量为2.4g/L(三次高密度发酵的平均值)，此结果表明，编码蚓激酶F-III基因在经过密码子优化后，其表达效率确实比优化前至少要提高6倍，并与纯化前的高密度发酵诱导表达产物SDS-PAGE检测结果相一致(见上文)。
实施例51.含蚓激酶F-III重组蛋白胶囊的制备重组酵母经高密度发酵后，可获得大量的有纤溶酶活性和纤溶酶原激活物活性的、单一组分的蚯蚓蚓激酶F-III重组蛋白，该蛋白并不需要进行高度的提取和纯化过程(只需一步简单的硫酸铵沉淀和透析，以除去可能残留的甲醇即可)，可按一定的比例与马铃薯淀粉或其他可食用的粮食淀粉(淀粉主要是作为填充料)混匀，然后将其灌装成胶囊。根据具体情况，每个胶囊可灌入100-500mg这样的的干粉，例如，一个200mg的胶囊约含有1mg左右的重组蚓激酶F-III蛋白。成人多次服用这样的的胶囊，就有可能达到预防或防治血栓性疾病的目的。
2.含蚓激酶重组蛋白F-III冲剂的制备胶囊的容积比较小，因此每粒胶囊可含有的蚓激酶F-III重组蛋白数量也会比较少，病情严重患者在有些情况下可能一次就需要服用大剂量的蚓激酶才能够达到防病和治病的目的，因此，增加一次性口服给药的剂量在某些情况下可能是必需的。此时，可采用冲剂包装形式，每袋内装入1-2g蚓激酶重组蛋白F-III与马铃薯淀粉或其他粮食淀粉的混合物。以1g包装为例，其中可含有蚓激酶F-III重组蛋白达100mg。患者每次只需服用1袋，便有可能达到抑制血栓形成或溶解血栓的目的。在服用时，为避免高温导致蛋白变性，可伴以温开水稀释后服下。
3.含蚓激酶重组蛋白F-III针剂的制备蚓激酶F-III重组蛋白在经过进一步的纯化，例如离子交换层析或亲和层析后，可完全消除其中所含的杂质例如糖类、毒素和热源，此时的重组蚓激酶F-III蛋白可考虑加工成针剂，在通过静脉滴注的方式输入人体或动物体内，这样不仅能减少使用剂量，更能进一步提高它的溶栓效果。
参考文献1.江苏新医学院编，中药大辞典，上海科学技术出版社，上海1986，2111.
2.Mihara H，et al.，1982，Eur Pat Appl EP 105,092 C1C12 N9647，11，Apr 1984，JPAprl，82/173669，02 Oct，1982.
3.Mihara H，et al.，Jpn.J.Physiol.，1991，41(3)461-721.
4.Nakajima N，et al.，Biosci.Biotechnol.Biochem.，1993，57(10)1726-1730.
5.Wang F，et al.，Biotechnology Letters，2003，251105-1109.
6.周元聪等，生物化学和生物物理学报，1988，20(1)35-41.
7.徐建民等，上海医科大学学报，1991，18(4)252-255.
8.Mihara H，et al.，South Asia J Trop Med Public Health，1992，23，suppl.2131-140.
9.葛涛和梁国栋，中国生物工程杂志，2003，23(4)48-52.
10.Cregg J M，et al.，Biotechnology(N.Y.)，2000，11(8)905-910.
11.丁云菲等，巴斯德毕赤酵母研究进展，生命科学，2003.2.15(1)26～30.
12.刘志渊等，利用毕赤酵母表达外源蛋白的研究，生物技术，2004.2.14(1)56～58.
13.肖生科等，提高外源基因在巴斯德毕赤酵母中表达量的研究进展，生物技术通报，2004.2.23～30。
14.Sugimato M and Nakajima N，Biosci.Biotechnol.Biochem，2001，65(7)1575-1580.
15.Sharp P M，et al.，Neucleic Acids Res.，1986，145125-5142.
16.Sambrook J and Rusell D W，Molecular CloingA Laboratory Manual，2001，ColdSpringer harbor Laboratory Press.
17.Deogny L，et al.，Clinica.Chimica.Acta.1975，6085-89.
18.蔡传奇和方荣祥，生物工程学报，2001，17(2)155-160.
19.Ausubel F M，et al.，Short Protocols in Molecular Biology，John Wiley& Sons，Inc.1995，373-374.
本发明的进一步描述只是一些特别的优先实施方案，是按照专利申请要求以及为了解释和说明本专利的内容。很显然，在不背离本发明的精神和范围之内，可在此基础上，做进一步的改进和变化。
序列表<110>刘德虎<120>一种提高蚓激酶组分F-III在酵母中表达效率的方法<160>3<210>1<211>238<212>PRT<213>赤子爱胜蚓(Eisenia foetida)蚓激酶F-III<400>1Ile Val Gly Gly Ile Glu Ala Gly Pro Tyr Glu Phe Pro Trp Gln Val1 5 10 15Ser Val Arg Arg Lys Pro Ser Asp Ser His Phe Cys Gly Gly Ser Ile20 25 30Ile Asn Asp Arg Trp Val Val Cys Ala Ala His Cys Met Gln Gly Glu35 40 45
Ser Pro Ala Leu Val Ser Leu Val Val Gly Glu His Asp Ser Ser Ala50 55 60Ala Ser Thr Val Arg Gln Thr His Asp Val Asp Ser Ile Phe Val Asn65 70 75 80Glu Asn Tyr Asp Pro Arg Thr Leu Glu Asn Asp Val Ser Val Ile Lys85 90 95Thr Ala Ile Ala Ile Thr Phe Asp Ile Asn Val Gly Pro Ile Cys Ala100105 110Pro Asp Pro Ala Asn Asp Tyr Val Tyr Arg Lys Ser Gln Cys Ser Gly115 120 125Trp Gly Thr Ile Asn Ser Gly Gly Ile Cys Cys Pro Ala Val Leu Arg130135 140Tyr Val Thr Leu Asn Ile Thr Thr Asn Ala Phe Cys Asp Ala Val Tyr145 150 155 160Thr Ser Asp Thr Ile Tyr Asp Asp Met Ile Cys Ala Thr Asp Asn Thr165 170 175Gly Met Thr Asp Arg Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu180 185 190Ser Val Lys Asp Gly Ser Gly Ile Phe Ser Leu Val Gly Ile Val Ser195 200 205Trp Gly Ile Gly Cys Ala Ser Gly Tyr Pro Gly Val Tyr Ser Arg Val210 215 220Gly Phe His Ala Gly Trp Ile Thr Asp Thr Ile Thr Asn Asn *225 230 235<210>2<211>743<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(1)...(732)<400>2CTC GAG AAA AGA GAG GCT ATT GTC GGT GGT ATT GAG GCT GGT CCA TAC GAG TTC CCA 57Leu Glu Lys Arg Glu Ala Ile Val Gly Gly Ile Glu Ala Gly Pro Tyr Glu Phe Pro1 5 10 15TGG CAA GTC TCC GTC AGA AGA AAG CCA TCT GAC TCC CAC TTC TGT GGT GGT TCC ATC 114Trp Gln Val Ser Val Arg Arg Lys Pro Ser Asp Ser His Phe Cys Gly Gly Ser Ile20 25 30 35
ATC AAC GAC AGA TGG GTT GTC TGT GCT GCT CAC TGT ATG CAA GGT GAG TCC CCA GCT 171Ile Asn Asp Arg Trp Val Val Cys Ala Ala His Cys Met Gln Gly Glu Ser Pro Ala40 45 50 55TTG GTC TCT TTG GTC GTC GGT GAG CAC GAC TCC TCC GCT GCT TCT ACC GTC AGA CAA 228Leu Val Ser Leu Val Val Gly Glu His Asp Ser Ser Ala Ala Ser Thr Val Arg Gln60 65 70 75ACT CAC GAC GTT GAC TCC ATC TTC GTC AAC GAG AAC TAC GAC CCA AGA ACC TTG GAG 285Thr His Asp Val Asp Ser Ile Phe Val Asn Glu Asn Tyr Asp Pro Arg Thr Leu Glu80 85 90 95AAC GAC GTT TCT GTC ATC AAG ACT GCT ATC GCT ATC ACC TTC GAC ATC AAC GTT GGT 342Asn Asp Val Ser Val Ile Lys Thr Ala Ile Ala Ile Thr Phe Asp Ile Asn Val Gly100 105 110CCA ATC TGT GCT CCA GAC CCA GCT AAC GAC TAC GTC TAC AGA AAG TCC CAA TGT TCC 399Pro Ile Cys Ala Pro Asp Pro Ala Asn Asp Tyr Val Tyr Arg Lys Ser Gln Cys Ser115 120 125 130GGT TGG GGT ACT ATC AAC TCT GGT GGT ATC TGT TGT CCA GCT GTT TTG AGA TAC GTT 456Gly Trp Gly Thr Ile Asn Ser Gly Gly Ile Cys Cys Pro Ala Val Leu Arg Tyr Val135 140 145 150ACC TTG AAC ATC ACC ACC AAC GCG TTC TGT GAC GCT GTC TAC ACT TCC GAC ACT ATC 513Thr Leu Asn Ile Thr Thr Asn Ala Phe Cys Asp Ala Val Tyr Thr Ser Asp Thr Ile155 160 165 170TAC GAC GAC ATG ATC TGT GCT ACC GAC AAC ACT GGT ATG ACC GAC AGA GAC TCC TGT 570Tyr Asp Asp Met Ile Cys Ala Thr Asp Asn Thr Gly Met Thr Asp Arg Asp Ser Cys175 180 185 190CAA GGT GAC TCC GGT GGT CCA TTG TCC GTC AAG GAC GGT TCC GGT ATC TTC TCT TTG 627Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Ser Val Lys Asp Gly Ser Gly Ile Phe Ser Leu195 200 205GTT GGT ATT GTC TCT TGG GGT ATT GGT TGT GCT TCT GGT TAC CCA GGT GTT TAC TCC 684Val Gly Ile Val Ser Trp Gly Ile Gly Cys Ala Ser Gly Tyr Pro Gly Val Tyr Ser210 215 220 225AGA GTC GGT TTC CAC GCT GGT TGG ATC ACC GAC ACC ATC ACC AAC AAC TAA GCG GCC 741Arg Val Gly Phe His Ala Gly Trp Ile Thr Asp Thr Ile Thr Asn Asn *230 235 240GC 743<210>3
<211>717<212>DNA<213>赤子爱胜蚓(Eisenia foetida)蚓激酶F-III基因<220>
<221>CDS<222>(1)...(714)<400>3ATT GTC GGA GGA ATT GAA GCC GGA CCA TAC GAG TTC CCA TGG CAG GTG TCC GTC CGA57Ile Val Gly Gly Ile Glu Ala Gly Pro Tyr Glu Phe Pro Trp Gln Val Ser Val Arg1 5 10 15AGG AAG CCT TCT GAT TCC CAT TTC TGC GGA GGT AGC ATC ATC AAC GAT CGT TGG GTT 114Arg Lys Pro Ser Asp Ser His Phe Cys Gly Gly Ser Ile Ile Asn Asp Arg Trp Val20 25 30 35GTC TGC GCT GCT CAC TGC ATG CAG GGA GAG AGC CCT GCC CTG GTC TCA TTG GTC GTC 171Val Cys Ala Ala His Cys Met Gln Gly Glu Ser Pro Ala Leu Val Ser Leu Val Val40 45 50 55GGC GAG CAC GAT AGC AGC GCT GCG AGt ACA GTA CGT CAG ACT CAT GAT GTT GAT AGC 228Gly Glu His Asp Ser Ser Ala Ala Ser Thr Val Arg Gln Thr His Asp Val Asp Ser60 65 70 75ATC TTC GTC AAC GAA AAC TAC GAT CCC CGT ACA CTA GAA AAC GAC GTT TCT GTC ATC 285Ile Phe Val Asn Glu Asn Tyr Asp Pro Arg Thr Leu Glu Asn Asp Val Ser Val Ile80 85 90 95AAG ACA GCT ATC GCT ATC ACC TTC GAC ATC AAC GTT GGA CCA ATC TGT GCT CCA GAT 342Lys Thr Ala Ile Ala Ile Thr Phe Asp Ile Asn Val Gly Pro Ile Cys Ala Pro Asp100 105110CCG GCT AAC GAC TAC GTC TAC CGT AAG AGC GAG TGT TCC GGA TGG GGA ACT ATC AAT 399Pro Ala Asn Asp Tyr Val Tyr Arg Lys Ser Gln Cys Ser Gly Trp Gly Thr Ile Asn115 120 125 130TCA GGT GGA ATC TGC TGT CCC GCA GTT TTG CGA TAT GTT ACA CTG AAC ATC ACG ACC 456Ser Gly Gly Ile Cys Cys Pro Ala Val Leu Arg Tyr Val Thr Leu Asn Ile Thr Thr135 140 145 150AAC GCC TTC TGC GAC GCC GTC TAC ACA TCG GAC ACT ATC TAC GAC GAT ATG ATC TGC 513Asn Ala Phe Cys Asp Ala Val Tyr Thr Ser Asp Thr Ile Tyr Asp Asp Met Ile Cys155 160 165 170GCC ACA GAC AAC ACT GGG ATG ACC GAC AGA GAC TCC TGC CAG GGT GAC TCC GGC GGC 570Ala Thr Asp Asn Thr Gly Met Thr Asp Arg Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly
175 180 185 190CCT CTG AGC GTC AAG GAT GGC AGC GGA ATC TTC AGT CTG GTT GGC ATT GTG TCT TGG 627Pro Leu Ser Val Lys Asp Gly Ser Gly Ile Phe Ser Leu Val Gly Ile Val Ser Trp195 200 205GGA ATT GGT TGC GCC TCT GGC TAT CCA GGA GTT TAC TCC CGC GTC GGA TTT CAT GCT 684Gly Ile Gly Cys Ala Ser Gly Tyr Pro Gly Val Tyr Ser Arg Val Gly Phe His Ala210 215 220 225GGA TGG ATC ACC GAC ACA ATC ACC AAC AAC TAA 717Gly Trp Ile Thr Asp Thr Ile Thr Asn Asn *230 23权利要求
1.蚯蚓蚓激酶单一组分F-III，其特征在于它具有序列表中的1所示的氨基酸序列，而该蛋白在天然状态下通过肠道给药或注射的方式可使人体或其他哺乳动物心脑和四肢血管血栓的形成受到抑制或血栓受到溶解。
2.编码蚯蚓蚓激酶单一组分F-III的DNA序列或其衍生物(包括基因密码子被优化或与其他基因相互融合等)，其特征在于它们都编码或至少部分编码如序列表1中所示的氨基酸序列。
3.如权利要求2中的所述的DNA序列或其衍生物，其特征在于具有序列表中的2所示的核苷酸序列或其衍生物。
4.一种表达载体，其特征在于它含有权利要求2中所述的编码蚯蚓蚓激酶单一组分F-III的DNA序列或其衍生物。
5.如权利4中所述的表达载体，它是指pPIC9K或其他能够诱导表达并分泌重组蛋白到胞外的质粒载体。
6.一种宿主细胞，其特征在于它包含权利要求4中所述的表达载体。
7.如权利要求6中所述的宿主细胞，它是指毕赤酵母菌株GS115或其他能够表达外源基因的酵母菌株。
8.一种利用毕赤酵母GS115高效表达和生产如权利要求1中所述蚯蚓蚓激酶单一组分F-III的方法，其中包括了以下四个阶段a菌体培养b饲喂碳源c诱导表达d蛋白纯化
9.权利要求1中所述的蚓激酶在制备溶栓药物中的应用。
10.如权利要求9中的应用，其中还包括从所说的宿主细胞发酵表达产物中部分纯化或完全纯化出所说的蚯蚓蚓激酶F-III重组蛋白，而该重组蛋白就如同源自蚯蚓的天然蛋白或其他表达系统所产生的该蚓激酶重组蛋白一样，具有类似的纤溶酶活性，它可作为以溶栓为主要目的的胶囊、冲剂、针剂或其它制剂的重要活性组成部分。
全文摘要
本发明涉及在酵母中高效表达和生产单一组分蚯蚓蚓激酶F－III的方法，其中包括使用密码子得到优化的蚓激酶F－III基因及特定的酵母发酵培养生长条件，并进而通过肠道给药或注射的方式利用这种源自酵母的、含有蚓激酶F－III重组蛋白作为主要活性成份的胶囊、冲剂、针剂或其他制剂形式从而引起人或哺乳动物心脑和四肢血管血栓形成受到抑制或血栓溶解。
文档编号C12N15/57GK1952123SQ20051011297
公开日2007年4月25日 申请日期2005年10月18日 优先权日2005年10月18日
发明者刘德虎 申请人:刘德虎