专利名称：重组丝氨酸蛋白酶及含有其的杀虫真菌剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的融合蛋白，具体地说涉及含有昆虫几丁质酶的几丁质结合域和真菌的丝氨酸蛋白酶序列的重组蛋白。
本发明还涉及编码上述重组蛋白的核苷酸序列和氨基酸序列。
本发明涉及表达上述重组蛋白的表达载体。
本发明还涉及含有上述重组蛋白的杀虫真菌剂。
背景技术：
自然环境下，昆虫种群数量得以控制，在很大程度上归功于杀虫真菌病害的大规模流行(Chanley，The Mycota IV Environmental and MicrobialRelationships，1997，pp 185-201)。杀虫真菌作为生防制剂已在我国、欧美和非洲得到广泛的应用(冯明光，《植物保护21世纪展望暨第三届全国青年植物保护科技工作者学术研讨会论文集》，1998)，但同时也存在击倒害虫时间长和防效不稳定等缺点，这些缺点限制了杀虫真菌更广泛的应用。因此，研究杀虫真菌侵染的分子机理，对杀虫真菌的改造具有重要意义。
和植物病原真菌类似，杀虫真菌主要是通过菌丝机械压力和水解酶的协同作用，直接穿透昆虫体壁进而引起侵染致病的。在这一过程中杀虫真菌分泌蛋白酶、几丁质酶和酯酶等多种水解酶，其中蛋白酶与几丁质酶起重要作用(Charnley，Fungal spore disease initiation in plants and animals，1991，pp267-287)，其对应的基因已经或正在被相继克隆。
深入研究病原真菌侵染致病的分子机理，挖掘新的致病基因，一直是人们研究的热点。然而，由于杀虫真菌致病机理非常复杂，是一个多基因控制的复杂体系。所以，尽管世界上多个研究小组都致力于寻找一些新的毒力因子，但进展缓慢。那么，能否利用现代生物技术手段，对现有的一些毒力因子进行分子改造，获得活力或致病性更强的毒力因子呢？如上所述，蛋白酶是杀虫真菌重要的毒力因子，能否通过增强或改良其活性或相关酶学特性，提高蛋白酶分解昆虫体壁的能力，从而提高杀虫真菌的毒力呢？目前的研究结果表明，几丁质酶中的几丁质结合域的功能有两个一个是使几丁质酶与几丁质相结合；另外一个是破坏晶体几丁质之间起稳定作用的氢键，从而有利于几丁质酶的作用。大量的研究表明缺失几丁质结合域的几丁质酶对可溶性底物的水解能力没有变化，但是对晶体几丁质的水解能力却降低，并且抑菌效果也降低了(Taira T et al.，Biosci.Biotechnol.Biochem，2002，66(5)970-977)。另一方面，在不具有几丁质结合域的几丁质酶上添加几丁质结合域可以增加几丁质酶在底物表面的浓度，从而提高分解几丁质的能力。在没有几丁质结合区域的哈兹木霉几丁质酶基因Chit42上，添加几丁质结合区域或纤维素结合区域都能显著提高该杂交酶结合到真菌细胞壁中几丁质的能力，并增强了降解几丁质的速度(LimOn et al.，FEMS Microbiology Letters，2001，19857-63)。
在昆虫的体壁结构中，几丁质纤丝为蛋白质所包裹。如果蛋白酶的分子结构中具有几丁质结合域，就有可能提高蛋白酶对含有几丁质一蛋白质复合物的分解速度。但分析表明，蛋白酶中只有来自按蚊(Anopheles gambiae)的蛋白酶Sp22D(Orman MJ et al.，Gene，2000，2519-17)、交替单孢菌(Alteromonassp.)O-7菌株的蛋白酶AprIV(Katsushiro M et al.，Journal of Bacteriology，2002，1841865-1872)与来自灰色链霉菌(Streptomyces griseus)的蛋白酶C(SidhuSSe al.，The Journal of biological chemistry，1994，26920167-20171)具有几丁质结合域。Katsushiro M(Journal of Bacteriology，2002，1841865-1872)等人对交替单孢菌(Alteromonas sp.)O-7菌株的蛋白酶基因AptIV进行了缺失研究。研究结果表明，当用虾壳(未去除蛋白质)作为底物，完整的AprIV释放的蛋白质是AprIVΔC(缺失了几丁质结合域的AprIV)的3倍。当用几丁质酶处理经AprIV与ApdVΔC处理过的虾壳，AprIV处理过的虾壳中检测到的几丁质酶活性明显高于AprIVΔC。该结果表明，具有几丁质结合域的蛋白酶在作用未去除蛋白质的虾壳时，可以增加降解底物蛋白质的速度及增加几丁质酶的作用。但目前从昆虫虫生真菌上克隆的丝氨酸蛋白酶中均未发现有几丁质结合域的存在，也未有将虫生真菌来源的丝氨酸蛋白酶与昆虫几丁质酶的几丁质结合域相融合的报道。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种重组丝氨酸蛋白酶，其含有来源于真菌的丝氨酸蛋白和来源于昆虫的几丁质酶的几丁质结合域，具有提高降解昆虫体壁活性和提高杀虫真菌毒力的特性。
本发明的另一个目的在于提供编码上述重组蛋白的核苷酸序列和氨基酸序列。
本发明的再一目的在于提供含有上述核苷酸序列的表达载体。
本发明的再一目的在于提供含有本发明重组蛋白的杀虫真菌。
根据本发明的一方面，一种重组丝氨酸蛋白酶，含有一融合蛋白，所述融合蛋白由来源于真菌的丝氨酸蛋白与来源于昆虫的几丁质酶的几丁质结合域融合而成。在本发明的一个具体实施方案中，所述融合蛋白由来源于球孢白僵菌(Beauveria bassiana)的丝氨酸蛋白酶(以下简称CDEP-1)与来源于家蚕(Bombyx mori)的几丁质酶的几丁质结合域(以下简称SwChBD)融合而成。
根据本发明的另一方面，编码本发明重组丝氨酸蛋白酶的核苷酸序列含有编码来源于真菌的丝氨酸蛋白的基因与编码来源于昆虫的几丁质酶的几丁质结合域的基因。在本发明的一个具体实施方案中，采用分子生物学技术构建了一个重组核苷酸序列，其含有编码球孢白僵菌(Beauveria bassiana)的丝氨酸蛋白酶的基因与编码家蚕的几丁质酶的几丁质结合域的基因，其具有如SEQID NO.1所示的核苷酸序列和如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
更进一步地，可以在构建重组核苷酸序列时插入一段丝氨酸蛋白酶的信号肽序列，以利于后续重组载体的构建和蛋白的表达。含有信号肽序列的重组丝氨酸蛋白酶序列如SEQ ID NO.3所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
根据本发明的再一方面，构建了重组表达载体，将本发明构建的重组核苷酸序列转入适宜的质粒载体，再转化合适的宿主可以获得本发明的重组表达载体，优选的质粒载体可以为适于酵母表达的质粒载体，优选的宿主可以为酵母宿主，更优选为毕赤酵母(Pichia pastoris)。
根据本发明的再一方面，提供一种杀虫真菌剂，其含有本发明的重组丝氨酸蛋白酶和杀虫真菌，其中杀虫真菌可以是球孢白僵菌(Beauveria bassiana)、金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)、黄绿绿僵菌(Metarhizium flavoviride)、布氏白僵菌(Beauveria brongniartii)、玫烟色拟青霉(Paecilomycesfuosoroseus)、汤普森被毛孢(Hirsutella thompsonii)、粉拟青霉(Paecilomycesfainosus)等。
根据本发明的再一方面，提供一种杀虫真菌转化菌株，用本发明构建的质粒载体转化杀虫真菌而获得可表达本发明重组蛋白的杀虫真菌转化菌株，在本发明的一个具体实施方案中，构建了球孢白僵菌转化菌株。
本发明所获得的重组丝氨酸蛋白酶可以在昆虫体壁得到富集，从而提高降解昆虫体壁的速度。增效作用证明，在球孢白僵菌中添加重组的丝氨酸蛋白酶可以明显提高球孢白僵菌的毒力。
本发明提供的转重组丝氨酸蛋白酶基因的球孢白僵菌转化菌株。毒力分析结果证明，转化子的毒力较对照有明显的提高。
下面，结合附图，通过对本发明较佳实施方式的描述，详细说明本发明。
附图的简要说明
图1用于酵母表达的质粒图谱，其中A，B分别为pPIC9K-CDEP、pPIC9K-CDEP-SwChBD的质粒图谱；图2为转球孢白僵菌质粒图谱，其中ApUC-bar::gfp-CDEP；BpUC-bar::gfp-CDEP-SwChBD；图3为本发明的CDEP-SwChBD酵母表达载体与球孢白僵菌转化载体准备过程中的PCR产物与克隆载体的部分酶切图谱；其中A，PCR扩增的SwChBD；B，PCR扩增的CDEP-1(1没有信号肽，2有信号肽)；C，EcoRI与NotI双酶切pPIC9K-CDEP-SwChBD；D，EcoRI与HindIII双酶切pUC-bar::gfp-CDEP-SwChBD；A中的marker是MBI公司的50bp DNA Ladder；B，C，D中的marker是MBI公司的λ/Eco911 15；图4为CDEP-1与CDEP-SwChBD的SDS-PAGE分析；其中M，小分子量蛋白质标准；1，CDEP-SwChBD；2，CDEP-1；图5以蚕蜕为底物测定蛋白酶处理后释放的蛋白质浓度与几丁质酶活性；A，蛋白质浓度；B，几丁质酶活性，先加入蛋白酶处理2h后，再加入几丁质酶处理2h；c，球孢白僵菌的几丁质酶Bbchit1单独处理底物；1，球孢白僵菌的蛋白酶CDEP-1处理底物后，加入几丁质酶处理；2，CDEP-SwChBD处理底物后再加入几丁质酶处理；3，球孢白僵菌的蛋白酶CDEP-1(加入终浓度为1mmol/L的PMSF抑制蛋白酶活性)处理底物后，加入几丁质酶处理；4，CDEP-SwChBD(加入终浓度为1mmol/L的PMSF抑制蛋白酶活性)处理底物后再加入几丁质酶处理。该结果表明，蛋白酶与杂交蛋白酶均能提高几丁质酶的活性，但杂交蛋白酶提高的幅度明显高于野生型蛋白酶。
图6表达的蛋白酶作为添加剂加入到球孢白僵菌对蚜虫的毒力分析；其中C，0.05％的Tween-80；Bb0062，107个/mL的球孢白僵菌孢子；CDEP-1，浓度为107个/mL的球孢白僵菌孢子里添加了终浓度为0.16μmol/L的CDEP-1；CDEP-SwChBD，浓度为107个/mL的球孢白僵菌孢子里添加了终浓度为0.16μmol/L的CDEP-SwChBD。
图7表达的蛋白酶作为添加剂加入到球孢白僵菌对菜青虫的毒力分析；其中C，0.05％的Tween-80；Bb0062，107个/mL的球孢白僵菌孢子；CDEP-1，浓度为107个/mL的球孢白僵菌孢子里添加了终浓度为0.16μmol/L的CDEP-1；CDEP-SwChBD，浓度为107个/mL的球孢白僵菌孢子里添加了终浓度为0.16μmol/L的CDEP-SwChBD。
发明的
具体实施例方式
本发明所用的实验材料如无特别说明均为市售购买产品。
实施例11、几丁质结合域的克隆扩增的模板为四龄家蚕(西南农业大学蚕桑学院提供)蜕皮时期的mRNA反转录的cDNA(反转录试剂盒为TaKaRa公司产品)为模板。
根据家蚕几丁质酶(GenBank登录号AB052914)的序列设计引物P15’-ACT AGT CAC AAC CAC CAC CAC CGT G-3’P25’-GCG GCC GCC CGG GTT ACG AAC ATF CCG GTC TGT-3’用高保真的pfu DNA聚合酶(鼎国公司产品)进行PCR扩增，PCR扩增条件如下94℃ 5min；94℃ 30sec，58℃，30sec，72℃ 1min，30个循环；加入0.7单位的Taq DNA聚合酶再延伸20min。PCR扩增获得了约340bp的结合域基因(序列如SEQ ID NO.4所示)，并引入相应的酶切位点。
PCR产物经凝胶回收试剂盒(Amersham公司产品)纯化后，A-T克隆进pMD-T载体(TaKaRa公司产品)。用SpeI/NotI双酶切验证，验证的阳性克隆再测序验证(上海博亚公司)，测序正确的质粒命名为pMD-SwChBD。
2、丝氨酸蛋白酶基因的克隆以蝉蜕诱导的球孢白僵菌cDNA文库为模板，根据球孢白僵菌丝氨酸蛋白酶基因CDEP-1的序列(GenBank登录号AY040532)设计引物P35’-GAA TTC GTT GAG CCT GCT CCT CTC ATC-3’P45’-GCG GCC GCC CGG GTT AGG TGG CGC CTT AAA TGC C-3’P55’-TCT AGA GT GGC GCC TTA AAT GCC-3’P65’-GAA TTC ATG CGT CTA TCA ATC ATT GCT-3’1)扩增用于酵母表达的丝氨酸蛋白酶基因(无蛋白酶本身的信号肽)用引物P3与P4引物进行扩增。用高保真的pfu DNA聚合酶(鼎国公司产品)进行PCR扩增，PCR扩增条件如下94℃ 5min；94℃ 30sec，58℃，30sec.72℃ 2min，30个循环；加入0.7单位的Taq DNA聚合酶再延伸20min。PCR扩增获得了1086bp的丝氨酸蛋白酶基因，并引入相应的酶切位点(序列如SEQID NO.5所示)。
PCR产物经凝胶回收试剂盒(Amersham公司产品)纯化后，A-T克隆进pMD-T载体(TaKaRa公司产品)。用EcoRI/NotI双酶切验证，验证的阳性克隆再测序验证(上海博亚公司)，测序正确的质粒命名为pMD-CDEP。
2)扩增用于酵母表达且能与几丁质结合域相融合的丝氨酸蛋白酶基因(无蛋白酶本身的信号肽)用引物P3与P5引物进行扩增。用高保真的pfu DNA聚合酶(鼎国公司产品)进行PCR扩增，PCR扩增条件如下94℃ 5min；94℃ 30sec，58℃，30sec，72℃ 2min，30个循环；加入0.7单位的Taq DNA聚合酶再延伸20min。PCR扩增获得了约1086bp的结合域基因，并引入相应的酶切位点(序列如SEQ IDNO.6所示)。
PCR产物经凝胶回收试剂盒(Amersham公司产品)纯化后，A-T克隆进pMD-T载体(TaKaRa公司产品)。用EcoRI/SpeI双酶切验证，验证的阳性克隆再测序验证(上海博亚公司)，测序正确的质粒命名为pMD-hCDEP。
3)扩增用于球孢白僵菌表达的丝氨酸蛋白酶基因(包含丝氨酸蛋白酶的信号肽)
用引物P6与P4引物进行扩增。用高保真的pfu DNA聚合酶(鼎国公司产品)进行PCR扩增，PCR扩增条件如下94℃ 5min；94℃ 30sec，58℃，30sec，72℃ 2min，30个循环；加入0.7单位的Taq DNA聚合酶再延伸20min。PCR扩增获得了约1140bp的结合域基因，并引入相应的酶切位点(序列如SEQ IDNO.7所示)。
PCR产物经凝胶回收试剂盒(Amersham公司产品)纯化后，A-T克隆进pMD-T载体(TaKaRa公司产品)。用EcoRI/SpeI双酶切验证，验证的阳性克隆再测序验证(上海博亚公司)，测序正确的质粒命名为pMD-spCDEP。
4)扩增用于球孢白僵菌表达且能与几丁质结合域相融合的丝氨酸蛋白酶基因(包含丝氨酸蛋白酶的信号肽)用引物P6与P5引物进行扩增。用高保真的pfu DNA聚合酶(鼎国公司产品)进行PCR扩增，PCR扩增条件如下94℃ 5min；94℃ 30sec，58℃，30sec，72℃ 2min，30个循环；加入0.7单位的Taq DNA聚合酶再延伸20min。PCR扩增获得了约1140bp的结构域基因，并引入相应的酶切位点(序列如SEQ IDNO.8所示)。
PCR产物经凝胶回收试剂盒(Amersham公司产品)纯化后，A-T克隆进pMD-T载体(TaKaRa公司产品)。用EcoRI/SpeI双酶切验证，验证的阳性克隆再测序验证(上海博亚公司)，测序正确的质粒命名为pMD-hspCDEP。
CDEP-1、CDEP-SwChBD酵母表达载体的构建及酵母转化实施例21、CDEP-1酵母表达载体的构建用EcoRI/NotI酶切pMD-CDEP，回收约1kb的外源片段，克隆到用相同酶消化的pPIC9K(Invitrogen公司)载体。用EcoRI/NotI酶切验证，阳性克隆命名为pPIC9K-CDEP，其质粒结构图见图1A(表达产物的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示)。
2、CDEP-SwChBD酵母表达载体的构建用EcoRI/XbaI酶切pMD-hCDEP，回收约1kb的外源片段，用SpeI/NotI酶切pMD-SWChBD，回收340bp的外源片段，将以上回收的两个片段同时克隆进用EcoRI/NotI酶切的pPIC9K(Invitrogen公司)载体。EcoRI/NotI酶切鉴定的阳性克隆命名为pPIC9K-CDEP-SwChBD，其质粒结构图见图1B，表达产物的氨基酸序列如SEQ ID NO.2。
3、CDEP-1、CDEP-SwChBD酵母表达载体的转化及诱导表达提取上述质粒，电转化进毕赤酵母。
挑取转化子与BMGY中培养至OD600约为3时，4℃下1500g离心5min收集菌体，重悬于BMMY中，使OD600达到约为1。每隔24h添加终浓度1％的甲醇诱导。诱导72h后，4℃下8000g离心10min。收集上清液，SDS-PAGE分析。结果表明，表达产物存在于上清液中。
培养基BMGY/BMMY的配方BMGY每升含13.4g YNB，0.0004g生物素，10g酵母粉，20g蛋白胨，100mmol/L pH6.0的磷酸钾，10ml的甘油BMMY每升含13.4g YNB，0.0004g生物素，10g酵母粉，20g蛋白胨，100mmol/L pH6.0的磷酸钾，5ml的甲醇4、发酵产物的纯化将诱导表达的上清液4℃下8000g离心10min，上清液于透析袋(截留分子量14,000道尔顿，BBI公司产品)中用PEG 20,000浓缩6倍。先用20mmol/LpH6.0的磷酸钾缓冲液平衡Hiload26/60柱，每次上样5mL，用平衡缓冲液洗脱，流速3mL/min，洗脱液分步收集，得表达产物。用底物Suc-(Ala)2-Pro-Phe-NA(Sigma公司)检测有丝氨酸蛋白酶活性。纯化的CDEP与CDEP-SwChBD的SDS-PAGE结果如图4所示。
CDEP-1、CDEP-SwChBD球孢白僵菌转化载体的构建实施例31、CDEP-1球孢白僵菌转化载体的构建及转化用EcoRI/SmaI双酶切pMD-spCDEP，回收1140bp的片段，用SmaI/HindIII双酶切pUC-bar::gfp，回收750bp的Trp终止子，用EcoRI/HindIII双酶切pUC-bar::gfp，回收10000bp的载体序列。将上述回收的三个片段连接，转化到大肠杆菌Dh5α中。用EcoRI/HindIII进行验证。酶切鉴定的阳性克隆命名为pUC-bar::gfp-CDEP，其质粒结构图见图2A。提取阳性克隆的质粒，用HindIII线性化后转化进球孢白僵菌Bb0062菌株(球孢白僵菌(Beauveriabassiana)Bb0062分离自感染的菜青虫(Pieris rape)，保存于西南农业大学生物技术中心，也可以从公知途径获得，例如CCTCCAF93297或从其它途径分离得到)。
2、CDEP-SwChBD球孢白僵菌转化载体的构建用EcoRI/SmaI双酶切pMD-hspCDEP，回收1500bp的片段，用SmaI/HindIII双酶切pUC-bar::gfp，回收750bp的Trp终止子，用EcoRI/HindIII双酶切pUC-bar::gfp，回收约10000bp的载体序列。将上述回收的三个片段连接，转化到大肠杆菌Dh5d中。用EcoRI/HindIII进行验证。酶切鉴定的阳性克隆命名为pUC-bar::gfp-CDEP-SwChBD，其质粒结构图见图2B(核苷酸序列如SEQID NO.3，表达产物的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)。提取阳性克隆的质粒，用HindIII线性化后转化进球孢白僵菌(Beauveria bassiana)Bb0062菌株。
CDEP-SwChBD酵母表达载体与球孢白僵菌表达载体构建的酶切鉴定结果如图3所示。
实施例4CDEP-1与CDEP-SwChBD对家蚕体壁的降解作用取1.5ml离心管，准确称量10mg底物(家蚕体壁)，加入500μl 100mmol/L磷酸钾缓冲液(pH6.0)洗涤，12000rpm，5min，弃上清。按以下的方法进行处理c，球孢白僵菌的Bbchit1单独处理底物；1，球孢白僵菌的蛋白酶CDEP-1处理底物后，加入几丁质酶处理；2，CDEP-SwChBD处理底物后再加入几丁质酶处理。3，球孢白僵菌的蛋白酶CDEP-1(加入终浓度为1mmol/L的PMSF抑制蛋白酶活性)处理底物后，加入几丁质酶处理；4，CDEP-SwChBD(加入终浓度为1mmol/L的PMSF抑制蛋白酶活性)处理底物后再加入几丁质酶处理。该结果表明，蛋白酶与杂交蛋白酶均能提高几丁质酶的活性，但杂交蛋白酶提高的幅度明显高于野生型蛋白酶。
c.400μl 100mmol/L磷酸钾缓冲液(pH6.0)；1.300μL CDEP-1(0.8μmol/L)+100μL 100mmol/L磷酸钾缓冲液(pH6.0)；2.300μL CDEP-SwChBD(0.8μmol/L+100μL 100mmol/L磷酸钾缓冲液(pH6.0))3.300μLCDEP-1(0.8μmol/L)+4μL 100mmol/L PMSF+100μL 100mmol/L磷酸钾缓冲液(pH6.0)4.300μL CDEP-SwChBD(0.8μmol/L)b+4μl 100mmol/L PMSF+100μL100mmol/L磷酸钾缓冲液(pH6.0)在28℃下，200rpm振荡处理2h。12000rpm离心5min，Braford法测定上清中蛋白质浓度(扣除加入蛋白质的量)，结果见附图5A。弃上清，加入350μL100mmol/L磷酸钾缓冲液(pH 6.0)、100μL的几丁质酶Bbchit1(浓度0.4μmol/L)及4μL 100mmol/L PMSF；28℃，200rpm，2h；12000rpm，5min，测几丁质酶活性，见附图5B。结果表明，CDEP-SwChBD处理昆虫体壁释放的蛋白质是CDEP-1的3.14倍。而且CDEP-SwChBD处理过底物检测到的几丁质酶活性与CDEP-1相比增加了35.7％。这些结果均表明CDEP-SwChBD与CDEP-1相比，增强了对昆虫体壁的降解能力。
实施例5CDEP-1与CDEP-SwChBD对球孢白僵菌毒力的影响在下述实验中所用的桃蚜为本实验室饲养，菜青虫为田间甘蓝上所生长。
1.以桃蚜为试虫0.05％Tween-80悬浮野生型球孢白僵菌的孢子，涡旋，四层擦镜纸过滤，0.85％NaCl重悬，调节孢子终浓度到1×107个/mL。添加的蛋白酶CDEP-1与CDEP-SwChBD的终浓度为0.16μmol/L。将配制好的孢子悬液用喷雾塔直接喷于虫体。以0.05％Tween-80为空白对照，分析杂交蛋白酶对野生型球孢白僵菌毒力的影响。
结果见图6。统计结果表明未添加蛋白酶、添加了野生型蛋白酶与杂交蛋白酶的野生型球孢白僵菌孢子处理桃蚜后，感染死亡率分别为31.4％、37.6％和54.3％。说明，杂交蛋白酶CDEP-SwChBD对野生型球孢白僵菌具有明显的杀虫增效作用。
2.菜青虫为试虫0.05％的无菌Tween-80收集野生型球孢白僵菌的孢子，涡旋，四层擦镜纸过滤，离心，0.85％NaCl重悬，调节孢子终浓度1×106、5×106、1×107、5×107、1×108，添加的蛋白酶的终浓度为0.16μmol/L。将配制好的孢子悬液用喷雾塔直接喷于虫体。以0.05％Tween-80为空白对照，分析杂交蛋白酶CDEP-SwChBD对野生型球孢白僵菌杀虫的增效作用。
结果见图7。统计结果表明添加了野生型蛋白酶和杂交蛋白酶CDEP-SwChBD的野生型球孢白僵菌的LD50分别为1.0×107个/mL和1.3×107个/mL，而野生型球孢白僵菌的LD50＝2.5×107个/mL。结果表明添加了杂交蛋白酶CDEP-SwChBD的野生型球孢白僵菌孢子处理菜青虫的LD50明显下降。
实施例6杂交蛋白酶球孢白僵菌转化子的毒力分析0.05％的无菌Tween-80收集蛋白酶(包括野生型和重组型)球孢白僵菌转化子的孢子，涡旋，四层擦镜纸过滤，离心，无菌0.85％NaCl重悬，调节孢子终浓度1×107/mL。将配制好的孢子悬液用喷雾塔直接喷于虫体(菜青虫)。以0.05％Tween-80为空白对照，以野生型球孢白僵菌的孢子为阴性对照，分析转化子的毒力。结果表明与野生型的蛋白酶转化子相比，杂交蛋白酶转化子的半致死时间分别缩短了24％，28％和33％，该结果表明改造过的重组丝氨酸蛋白酶能显著提高球孢白僵菌的毒力。
由以上结果可见，本发明成功地获得了重组丝氨酸蛋白酶和转化的杀虫真菌菌株。
以上对本发明的详细描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明做出各种改变和变形，只要不脱离本发明的精神，这些改变和变形均应属于所附权利要求的范围。
05P101407.ST25SEQUENCE LISTING<110>西南大学<120>重组丝氨酸蛋白酶及含有其的杀虫真菌剂<130>05P101407<160>9<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1422<212>DNA<213>人工序列(artificial)<220>
<221>CDS<222>(1)..(1422)<223>编码重组丝氨酸蛋白酶<400>1gtt gag cct gct cct ctc atc gag gcc cgc ggg cag acc att gcc ggc 48Val Glu Pro Ala Pro Leu Ile Glu Ala Arg Gly Gln Thr Ile Ala Gly1 5 10 15aag tac att gtc aag ctc aag gac act gcg acc att ggt atc atg gat 96Lys Tyr Ile Val Lys Leu Lys Asp Thr Ala Thr Ile Gly Ile Met Asp20 25 30gct gcg tcc aag gtg ccc aac acc gaa cac gtc tat gaa aat gtc ctc144Ala Ala Ser Lys Val Pro Asn Thr Glu His Val Tyr Glu Asn Val Leu35 40 45aag gga ttc tcg gcc act ctt aac cag gaa caa ctt gac cgt ctc cgc192Lys Gly Phe Ser Ala Thr Leu Asn Gln Glu Gln Leu Asp Arg Leu Arg50 55 60cac gat cct gat gtc gag tcc atc gag cag gat gcc att gtt agc atc240His Asp Pro Asp Val Glu Ser Ile Glu Gln Asp Ala Ile Val Ser Ile65 70 75 80aac gcc gtt gtc cgg caa gcc gga gct ccc tgg ggt cta ggt cgc atc288Asn Ala Val Val Arg Gln Ala Gly Ala Pro Trp Gly Leu Gly Arg Ile85 90 95tcg cac agg gca cga ggc gcg acc acg tat gac tac gac tcg agc gcc336Ser His Arg Ala Arg Gly Ala Thr Thr Tyr Asp Tyr Asp Ser Ser Ala100 105 110ggc gcg ggt aca tgc gta tat gtc att gac act ggc gtc tat gac tct384Gly Ala Gly Thr Cys Val Tyr Val Ile Asp Thr Gly Val Tyr Asp Ser
05P101407.ST25115 120 125cac cct gat ttc gaa gga cgt gcc aag caa atc aaa tcc ttt gtc tct432His Pro Asp Phe Glu Gly Arg Ala Lys Gln Ile Lys Ser Phe Val Ser130 135 140ggc act tca gat ggt cac ggc cac ggc aca cac tgc gcc gga act att480Gly Thr Ser Asp Gly His Gly His Gly Thr His Cys Ala Gly Thr Ile145 150 155 160ggc tcc aag act tac ggc gta gcc aag aag gcg tcc att ttt ggc gtc528Gly Ser Lys Thr Tyr Gly Val Ala Lys Lys Ala Ser Ile Phe Gly Val165 170 175aag gtg ctc gaa gac agt ggc tcg ggt tcg ctc agc ggc gtc att gcc576Lys Val Leu Glu Asp Ser Gly Ser Gly Ser Leu Ser Gly Val Ile Ala180 185 190gga atg gac ttt gtc gct acg gac cgg aaa tcc cgt tca tgc agc aaa624Gly Met Asp Phe Val Ala Thr Asp Arg Lys Ser Arg Ser Cys Ser Lys195 200 205ggc acc gtc gcc agc atg tcc ctt ggc ggt ggc tac tcg gcc acc gtg672Gly Thr Val Ala Ser Met Ser Leu Gly Gly Gly Tyr Ser Ala Thr Val210 215 220aac cag gcc gcc gcg cgt ctg cag gct tcg ggc gtt ttt gtc gcc gtc720Asn Gln Ala Ala Ala Arg Leu Gln Ala Ser Gly Val Phe Val Ala Val225 230 235 240gcc gcc ggc aac gac aat agg gat gcc gcc cag acc tcg ccc gcc tgg768Ala Ala Gly Asn Asp Asn Arg Asp Ala Ala Gln Thr Ser Pro Ala Trp245 250 255gag ccg tcc gtc tgc acc gtc gga gct acc gac tcg tct gac cgc cgc816Glu Pro Ser Val Cys Thr Val Gly Ala Thr Asp Ser Ser Asp Arg Arg260 265 270tcc agc ttc tcc aac ttt gga aaa gct gtt gac att ttc gca cct ggt864Ser Ser Phe Ser Asn Phe Gly Lys Ala Val Asp Ile Phe Ala Pro Gly275 280 285act ggc att ctg tcg acc tgg aat aat ggc ggc act aat acc atc tcg912Thr Gly Ile Leu Ser Thr Trp Asn Asn Gly Gly Thr Asn Thr Ile Ser290 295 300ggc act tcg atg gcc act ccc cac att gcc ggt ctc ggt gcc tac ctt960Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Ile Ala Gly Leu Gly Ala Tyr Leu305 310 315 320ttg gct ctc ggc aaa ggc act gcc ggc aac ctc tgc caa act atc cag 1008Leu Ala Leu Gly Lys Gly Thr Ala Gly Asn Leu Cys Gln Thr Ile Gln325 330 335act ctc tcc acc aag aat gtc ctt act ggc gtt cct tca ggc acc gtc 1056Thr Leu Ser Thr Lys Asn Val Leu Thr Gly Val Pro Ser Gly Thr Val340 345 350aac tac ctg gca ttt aac ggc gcc act cta gtc aca acc acc acc acc 1104Asn Tyr Leu Ala Phe Asn Gly Ala Thr Leu Val Thr Thr Thr Thr Thr355 360 365gtg aaa ccg acg aca aca aga acc acc gcg agg cca act act acc aca 1152Val Lys Pro Thr Thr Thr Arg Thr Thr Ala Arg Pro Thr Thr Thr Thr370 375 380acg aaa gta ccc cat ggc acc act gaa gaa gac ttt gac att aac gtg 1200Thr Lys Val Pro His Gly Thr Thr Glu Glu Asp Phe Asp Ile Asn Val385 390 395 400aga ccg gaa gtc gag gaa cta ccc acg gaa aac gaa gtc gac aat gcg 1248Arg Pro Glu Val Glu Glu Leu Pro Thr Glu Asn Glu Val Asp Asn Ala405 410 415gat gtg tgt aac tct gag gac gac tac ata cca gac aag aaa gag tgt 1296
05P101407.ST25Asp Val Cys Asn Ser Glu Asp Asp Tyr Ile Pro Asp Lys Lys Glu Cys420 425 430agc aag tat tgg cga tgt gtg aac ggc gag gga gtt cag ttc tcg tgt1344Ser Lys Tyr Trp Arg Cys Val Asn Gly Glu Gly Val Gln Phe Ser Cys435 440 445caa ccg ggg aca atc ttc aac gtg aaa ctt aac gtt tgc gat tgg cct1392Gln Pro Gly Thr Ile Phe Asn Val Lys Leu Asn Val Cys Asp Trp Pro450 455 460gaa aat aca gac aga ccg gaa tgt tcg taa1422Glu Asn Thr Asp Arg Pro Glu Cys Ser465 470<210>2<211>473<212>PRT<213>人工序列(artificial)<400>2Val Glu Pro Ala Pro Leu Ile Glu Ala Arg Gly Gln Thr Ile Ala Gly1 5 10 15Lys Tyr Ile Val Lys Leu Lys Asp Thr Ala Thr Ile Gly Ile Met Asp20 25 30Ala Ala Ser Lys Val Pro Asn Thr Glu His Val Tyr Glu Asn Val Leu35 40 45Lys Gly Phe Ser Ala Thr Leu Asn Gln Glu Gln Leu Asp Arg Leu Arg50 55 60His Asp Pro Asp Val Glu Ser Ile Glu Gln Asp Ala Ile Val Ser Ile65 70 75 80Asn Ala Val Val Arg Gln Ala Gly Ala Pro Trp Gly Leu Gly Arg Ile85 90 95Ser His Arg Ala Arg Gly Ala Thr Thr Tyr Asp Tyr Asp Ser Ser Ala100 105 110Gly Ala Gly Thr Cys Val Tyr Val Ile Asp Thr Gly Val Tyr Asp Ser115 120 125His Pro Asp Phe Glu Gly Arg Ala Lys Gln Ile Lys Ser Phe Val Ser130 135 140Gly Thr Ser Asp Gly His Gly His Gly Thr His Cys Ala Gly Thr Ile145 150 155 160Gly Ser Lys Thr Tyr Gly Val Ala Lys Lys Ala Ser Ile Phe Gly Val165 170 175Lys Val Leu Glu Asp Ser Gly Ser Gly Ser Leu Ser Gly Val Ile Ala180 185 190
05P101407.ST25Gly Met Asp Phe Val Ala Thr Asp Arg Lys Ser Arg Ser Cys Ser Lys195 200 205Gly Thr Val Ala Ser Met Ser Leu Gly Gly Gly Tyr Ser Ala Thr Val210 215 220Asn Gln Ala Ala Ala Arg Leu Gln Ala Ser Gly Val Phe Val Ala Val225 230 235 240Ala Ala Gly Asn Asp Asn Arg Asp Ala Ala Gln Thr Ser Pro Ala Trp245 250 255Glu Pro Ser Val Cys Thr Val Gly Ala Thr Asp Ser Ser Asp Afg Arg260 265 270Ser Ser Phe Ser Asn Phe Gly Lys Ala Val Asp Ile Phe Ala Pro Gly275 280 285Thr Gly Ile Leu Ser Thr Trp Asn Asn Gly Gly Thr Asn Thr Ile Ser290 295 300Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Ile Ala Gly Leu Gly Ala Tyr Leu305 310 315 320Leu Ala Leu Gly Lys Gly Thr Ala Gly Asn Leu Cys Gln Thr Ile Gln325 330 335Thr Leu Ser Thr Lys Asn Val Leu Thr Gly Val Pro Ser Gly Thr Val340 345 350Asn Tyr Leu Ala Phe Asn Gly Ala Thr Leu Val Thr Thr Thr Thr Thr355 360 365Val Lys Pro Thr Thr Thr Arg Thr Thr Ala Arg Pro Thr Thr Thr Thr370 375 380Thr Lys Val Pro His Gly Thr Thr Glu Glu Asp Phe Asp Ile Asn Val385 390 395 400Arg Pro Glu Val Glu Glu Leu Pro Thr Glu Asn Glu Val Asp Asn Ala405 410 415Asp Val Cys Asn Ser Glu Asp Asp Tyr Ile Pro Asp Lys Lys Glu Cys420 425 430Ser Lys Tyr Trp Arg Cys Val Asn Gly Glu Gly Val Gln Phe Ser Cys435 440 445Gln Pro Gly Thr Ile Phe Asn Val Lys Leu Asn Val Cys Asp Trp Pro450 455 460Glu Asn Thr Asp Arg Pro Glu Cys Ser465 470<210>3
05P101407.ST25<211>1476<212>DNA<213>人工序列(artificial)<220>
<221>sig_peptide<222>(1)..(54)<223>含信号肽序列的重组丝氨酸蛋白酶序列<400>3atgcgtctat caatcatcgc tgccgctctt cccctggcca ttgcggctcc ggtcgttgag 60cctgctcctc tcatcgaggc ccgcgggcag accattgccg gcaagtacat tgtcaagctc120aaggacactg cgaccattgg tatcatggat gctgcgtcca aggtgcccaa caccgaacac180gtctatgaaa atgtcctcaa gggattctcg gccactctta accaggaaca acttgaccgt240ctccgccacg atcctgatgt cgagtccatc gagcaggatg ccattgttag catcaacgcc300gttgtccggc aagccggagc tccctggggt ctaggtcgca tctcgcacag ggcacgaggc360gcgaccacgt atgactacga ctcgagcgcc ggcgcgggta catgcgtata tgtcattgac420actggcgtct atgactctca ccctgatttc gaaggacgtg ccaagcaaat caaatccttt480gtctctggca cttcagatgg tcacggccac ggcacacact gcgccggaac tattggctcc540aagacttacg gcgtagccaa gaaggcgtcc atttttggcg tcaaggtgct cgaagacagt600ggctcgggtt cgctcagcgg cgtcattgcc ggaatggact ttgtcgctac ggaccggaaa660tcccgttcat gcagcaaagg caccgtcgcc agcatgtccc ttggcggtgg ctactcggcc720accgtgaacc aggccgccgc gcgtctgcag gcttcgggcg tttttgtcgc cgtcgccgcc780ggcaacgaca atagggatgc cgcccagacc tcgcccgcct gggagccgtc cgtctgcacc840gtcggagcta ccgactcgtc tgaccgccgc tccagcttct ccaactttgg aaaagctgtt900gacattttcg cacctggtac tggcattctg tcgacctgga ataatggcgg cactaatacc960atctcgggca cttcgatggc cactccccac attgccggtc tcggtgccta ccttttggct 1020ctcggcaaag gcactgccgg caacctctgc caaactatcc agactctctc caccaagaat 1080gtccttactg gcgttccttc aggcaccgtc aactacctgg catttaacgg cgccactcta 1140gtcacaacca ccaccaccgt gaaaccgacg acaacaagaa ccaccgcgag gccaactact 1200accacaacga aagtacccca tggcaccact gaagaagact ttgacattaa cgtgagaccg 1260gaagtcgagg aactacccac ggaaaacgaa gtcgacaatg cggatgtgtg taactctgag 1320gacgactaca taccagacaa gaaagagtgt agcaagtatt ggcgatgtgt gaacggcgag 1380ggagttcagt tctcgtgtca accggggaca atcttcaacg tgaaacttaa cgtttgcgat 1440tggcctgaaa atacagacag accggaatgt tcgtaa 1476<210>4<211>353<212>DNA
05P101407.ST25<213>家蚕(Bombyx mori)<220>
<221>misc feature<222>(1)..(353)<223>家蚕几丁质酶结合域序列<400>4actagtcaca accaccacca ccgtgaaacc gacgacaaca agaaccaccg cgaggccaac 60tactaccaca acgaaagtac cccatggcac cactgaagaa gactttgaca ttaacgtgag120accggaagtc gaggaactac ccacggaaaa cgaagtcgac aatgcggatg tgtgtaactc180tgaggacgac tacataccag acaagaaaga gtgtagcaag tattggcgat gtgtgaacgg240cgagggagtt cagttctcgt gtcaaccggg gacaatcttc aacgtgaaac ttaacgtttg300cgattggcct gaaaatacag acagaccgga atgttcgtaa cccgggcggc cgc 353<210>5<211>1105<212>DNA<213>球孢白僵菌(Beauveria bassiana)<400>5gaattcgttg agcctgctcc tctcatcgag gcccgcgggc agaccattgc cggcaagtac 60attgtcaagc tcaaggacac tgcgaccatt ggtatcatgg atgctgcgtc caaggtgccc120aacaccgaac acgtctatga aaatgtcctc aagggattct cggccactct taaccaggaa180caacttgacc gtctccgcca cgatcctgat gtcgagtcca tcgagcagga tgccattgtt240agcatcaacg ccgttgtccg gcaagccgga gctccctggg gtctaggtcg catctcgcac300agggcacgag gcgcgaccac gtatgactac gactcgagcg ccggcgcggg tacatgcgta360tatgtcattg acactggcgt ctatgactct caccctgatt tcgaaggacg tgccaagcaa420atcaaatcct ttgtctctgg cacttcagat ggtcacggcc acggcacaca ctgcgccgga480actattggct ccaagactta cggcgtagcc aagaaggcgt ccatttttgg cgtcaaggtg540ctcgaagaca gtggctcggg ttcgctcagc ggcgtcattg ccggaatgga ctttgtcgct600acggaccgga aatcccgttc atgcagcaaa ggcaccgtcg ccagcatgtc ccttggcggt660ggctactcgg ccaccgtgaa ccaggccgcc gcgcgtctgc aggcttcggg cgtttttgtc720gccgtcgccg ccggcaacga caatagggat gccgcccaga cctcgcccgc ctgggagccg780tccgtctgca ccgtcggagc taccgactcg tctgaccgcc gctccagctt ctccaacttt840ggaaaagctg ttgacatttt cgcacctggt actggcattc tgtcgacctg gaataatggc900ggcactaata ccatctcggg cacttcgatg gccactcccc acattgccgg tctcggtgcc960taccttttgg ctctcggcaa aggcactgcc ggcaacctct gccaaactat ccagactctc 1020tccaccaaga atgtccttac tggcgttcct tcaggcaccg tcaactacct ggcatttaac 1080
05P101407.ST25ggcgccacct aacccgggcg gccgc 1105<210>6<211>1094<212>DNA<213>球孢白僵菌(Beauveria bassiana)<400>6gaattcgttg agcctgctcc tctcatcgag gcccgcgggc agaccattgc cggcaagtac 60attgtcaagc tcaaggacac tgcgaccatt ggtatcatgg atgctgcgtc caaggtgccc 120aacaccgaac acgtctatga aaatgtcctc aagggattct cggccactct taaccaggaa 180caacttgacc gtctccgcca cgatcctgat gtcgagtcca tcgagcagga tgccattgtt 240agcatcaacg ccgttgtccg gcaagccgga gctccctggg gtctaggtcg catctcgcac 300agggcacgag gcgcgaccac gtatgactac gactcgagcg ccggcgcggg tacatgcgta 360tatgtcattg acactggcgt ctatgactct caccctgatt tcgaaggacg tgccaagcaa 420atcaaatcct ttgtctctgg cacttcagat ggtcacggcc acggcacaca ctgcgccgga 480actattggct ccaagactta cggcgtagcc aagaaggcgt ccatttttgg cgtcaaggtg 540ctcgaagaca gtggctcggg ttcgctcagc ggcgtcattg ccggaatgga ctttgtcgct 600acggaccgga aatcccgttc atgcagcaaa ggcaccgtcg ccagcatgtc ccttggcggt 660ggctactcgg ccaccgtgaa ccaggccgcc gcgcgtctgc aggcttcggg cgtttttgtc 720gccgtcgccg ccggcaacga caatagggat gccgcccaga cctcgcccgc ctgggagccg 780tccgtctgca ccgtcggagc taccgactcg tctgaccgcc gctccagctt ctccaacttt 840ggaaaagctg ttgacatttt cgcacctggt actggcattc tgtcgacctg gaataatggc 900ggcactaata ccatctcggg cacttcgatg gccactcccc acattgccgg tctcggtgcc 960taccttttgg ctctcggcaa aggcactgcc ggcaacctct gccaaactat ccagactctc1020tccaccaaga atgtccttac tggcgttcct tcaggcaccg tcaactacct ggcatttaac1080ggcgccactc raga 1094<210>7<211>1159<212>DNA<213>球孢白僵菌(Beauveria bassiana)<400>7gaattcatgc gtctatcaat catcgctgcc gctcttcccc tggccattgc ggctccggtc 60gttgagcctg ctcctctcat cgaggcccgc gggcagacca ttgccggcaa gtacattgtc 120aagctcaagg acactgcgac cattggtatc atggatgctg cgtccaaggt gcccaacacc 180gaacacgtct atgaaaatgt cctcaaggga ttctcggcca ctcttaacca ggaacaactt 240gaccgtctcc gccacgatcc tgatgtcgag tccatcgagc aggatgccat tgttagcatc 300
05P101407.ST25aacgccgttg tccggcaagc cggagctccc tggggtctag gtcgcatctc gcacagggca360cgaggcgcga ccacgtatga ctacgactcg agcgccggcg cgggtacatg cgtatatgtc420attgacactg gcgtctatga ctctcaccct gatttcgaag gacgtgccaa gcaaatcaaa480tcctttgtct ctggcacttc agatggtcac ggccacggca cacactgcgc cggaactatt540ggctccaaga cttacggcgt agccaagaag gcgtccattt ttggcgtcaa ggtgctcgaa600gacagtggct cgggttcgct cagcggcgtc attgccggaa tggactttgt cgctacggac660cggaaatccc gttcatgcag caaaggcacc gtcgccagca tgtcccttgg cggtggctac720tcggccaccg tgaaccaggc cgccgcgcgt ctgcaggctt cgggcgtttt tgtcgccgtc780gccgccggca acgacaatag ggatgccgcc cagacctcgc ccgcctggga gccgtccgtc840tgcaccgtcg gagctaccga ctcgtctgac cgccgctcca gcttctccaa ctttggaaaa900gctgttgaca ttttcgcacc tggtactggc attctgtcga cctggaataa tggcggcact960aataccatct cgggcacttc gatggccact ccccacattg ccggtctcgg tgcctacctt 1020ttggctctcg gcaaaggcac tgccggcaac ctctgccaaa ctatccagac tctctccacc 1080aagaatgtcc ttactggcgt tccttcaggc accgtcaact acctggcatt taacggcgcc 1140acctaacccg ggcggccgc1159<210>8<211>1148<212>DNA<213>球孢白僵菌(Beauveria bassiana)<400>8gaattcatgc gtctatcaat catcgctgcc gctcttcccc tggccattgc ggctccggtc 60gttgagcctg ctcctctcat cgaggcccgc gggcagacca ttgccggcaa gtacattgtc120aagctcaagg acactgcgac cattggtatc atggatgctg cgtccaaggt gcccaacacc180gaacacgtct atgaaaatgt cctcaaggga ttctcggcca ctcttaacca ggaacaactt240gaccgtctcc gccacgatcc tgatgtcgag tccatcgagc aggatgccat tgttagcatc300aacgccgttg tccggcaagc cggagctccc tggggtctag gtcgcatctc gcacagggca360cgaggcgcga ccacgtatga ctacgactcg agcgccggcg cgggtacatg cgtatatgtc420attgacactg gcgtctatga ctctcaccct gatttcgaag gacgtgccaa gcaaatcaaa480tcctttgtct ctggcacttc agatggtcac ggccacggca cacactgcgc cggaactatt540ggctccaaga cttacggcgt agccaagaag gcgtccattt ttggcgtcaa ggtgctcgaa600gacagtggct cgggttcgct cagcggcgtc attgccggaa tggactttgt cgctacggac660cggaaatccc gttcatgcag caaaggcacc gtcgccagca tgtcccttgg cggtggctac720tcggccaccg tgaaccaggc cgccgcgcgt ctgcaggctt cgggcgtttt tgtcgccgtc780gccgccggca acgacaatag ggatgccgcc cagacctcgc ccgcctggga gccgtccgtc840tgcaccgtcg gagctaccga ctcgtctgac cgccgctcca gcttctccaa ctttggaaaa900gctgttgaca ttttcgcacc tggtactggc attctgtcga cctggaataa tggcggcact960aataccatct cgggcacttc gatggccact ccccacattg ccggtctcgg tgcctacctt 1020
05P101407.ST25ttggctctcg gcaaaggcac tgccggcaac ctctgccaaa ctatccagac tctctccacc 1080aagaatgtcc ttactggcgt tccttcaggc accgtcaact acctggcatt taacggcgcc 1140actctaga 1148<210>9<211>361<212>PRT<213>人工序列(artificial)<400>9Val Glu Pro Ala Pro Leu Ile Glu Ala Arg Gly Gln Thr Ile Ala Gly1 5 10 15Lys Tyr Ile Val Lys Leu Lys Asp Thr Ala Thr Ile Gly Ile Met Asp20 25 30Ala Ala Ser Lys Val Pro Asn Thr Glu His Val Tyr Glu Asn Val Leu35 40 45Lys Gly Phe Ser Ala Thr Leu Asn Gln Glu Gln Leu Asp Arg Leu Arg50 55 60His Asp Pro Asp Val Glu Ser Ile Glu Gln Asp Ala Ile Val Ser Ile65 70 75 80Asn Ala Val Val Arg Gln Ala Gly Ala Pro Trp Gly Leu Gly Arg Ile85 90 95Ser His Arg Ala Arg Gly Ala Thr Thr Tyr Asp Tyr Asp Ser Ser Ala100 105 110Gly Ala Gly Thr Cys Val Tyr Val Ile Asp Thr Gly Val Tyr Asp Ser115 120 125His Pro Asp Phe Glu Gly Arg Ala Lys Gln Ile Lys Ser Phe Val Ser130 135 140Gly Thr Ser Asp Gly His Gly His Gly Thr His Cys Ala Gly Thr Ile145 150 155 160Gly Ser Lys Thr Tyr Gly Val Ala Lys Lys Ala Ser Ile Phe Gly Val165 170 175Lys Val Leu Glu Asp Ser Gly Ser Gly Ser Leu Ser Gly Val Ile Ala180 185 190Gly Met Asp Phe Val Ala Thr Asp Arg Lys Ser Arg Ser Cys Ser Lys195 200 205Gly Thr Val Ala Ser Met Ser Leu Gly Gly Gly Tyr Ser Ala Thr Val210 215 220
05P101407.ST25Asn Gln Ala Ala Ala Arg Leu Gln Ala Ser Gly Val Phe Val Ala Val225 230 235 240Ala Ala Gly Asn Asp Asn Arg Asp Ala Ala Gln Thr Ser Pro Ala Trp245 250 255Glu Pro Ser Val Cys Thr Val Gly Ala Thr Asp Ser Ser Asp Arg Arg260 265 270Ser Ser Phe Ser Asn Phe Gly Lys Ala Val Asp Ile Phe Ala Pro Gly275 280 285Thr Gly Ile Leu Ser Thr Trp Asn Asn Gly Gly Thr Asn Thr Ile Ser290 295 300Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Ile Ala Gly Leu Gly Ala Tyr Leu305 310 315 320Leu Ala Leu Gly Lys Gly Thr Ala Gly Asn Leu Cys Gln Thr Ile Gln325 330 335Thr Leu Ser Thr Lys Asn Val Leu Thr Gly Val Pro Ser Gly Thr Val340 345 350Asn Tyr Leu Ala Phe Asn Gly Ala Thr355 360
权利要求
1.一种重组丝氨酸蛋白酶，其含有一融合蛋白，所述融合蛋白由来源于真菌的丝氨酸蛋白与来源于昆虫的几丁质酶的几丁质结合域融合而成。
2.权利要求1所述的重组丝氨酸蛋白酶，其特征在于所述融合蛋白由来源于球孢白僵菌(Beauveria bassiana)的丝氨酸蛋白酶与来源于家蚕(Bombyxmori)的几丁质酶的几丁质结合域融合而成。
3.权利要求1所述的重组丝氨酸蛋白酶，其特征在于其具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
4.一种分离的核苷酸序列，其编码权利要求1所述的重组丝氨酸蛋白酶，含有编码来源于真菌的丝氨酸蛋白的基因与编码来源于昆虫的几丁质酶的几丁质结合域的基因。
5.权利要求4所述的核苷酸序列，其特征在于其含有编码球孢白僵菌(Beauveria bassiana)的丝氨酸蛋白酶的基因与编码家蚕(Bombyx mori)的几丁质酶的几丁质结合域的基因。
6.权利要求5所述的核苷酸序列，其特征在于其具有如SEQ ID NO.1所示的序列。
7.权利要求5所述的核苷酸序列，其特征在于其进一步含有一丝氨酸蛋白酶的信号肽序列，如SEQ ID NO.3所示。
8.含有权利要求4所述核苷酸序列的重组表达载体。
9.权利要求8所述的重组表达载体，其特征在于所述表达载体为酵母表达载体。
10.含有权利要求1所述的重组丝氨酸蛋白酶的杀虫真菌剂。
11.权利要求10所述的杀虫真菌剂，其特征在于其含有杀虫有效量的所述重组丝氨酸蛋白酶和杀虫真菌。
12.含有权利要求4所述核苷酸序列的杀虫真菌转化菌株。
13.权利要求12所述的杀虫真菌转化菌株，其特征在于所述杀虫真菌为球孢白僵菌(Beauveria bassiana)。
全文摘要
本发明涉及一种重组丝氨酸蛋白酶，其含有一融合蛋白，由来源于真菌的丝氨酸蛋白与来源于昆虫的几丁质酶的几丁质结合域融合而成，含有一种分离的核苷酸序列编码来源于真菌的丝氨酸蛋白的基因与编码来源于昆虫的几丁质酶的几丁质结合域的基因。本发明所获得的重组丝氨酸蛋白酶可以在昆虫体壁得到富集，从而提高降解昆虫体壁的速度和提高杀虫真菌毒力的特性。
文档编号C12N15/81GK1763187SQ20051011469
公开日2006年4月26日 申请日期2005年10月27日 优先权日2005年10月27日
发明者裴炎, 范艳华, 张永军, 方卫国, 肖月华 申请人:西南大学