专利名称：菌根真菌在石斛大面积栽培中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，具体地说涉及一项在石斛大面积栽培中应用菌根真菌以缩短石斛生产周期，提高石斛产量和质量的实用技术。
背景技术：
石斛是我国传统的名贵中药，具有益胃生津、滋阴清热、润肺止咳等功效。药理学研究表明，石斛属植物具有增强机体免疫力，抗肿瘤，抗衰老，抗血小板凝聚等作用。我国目前供药用的石斛属(Dendrobium)植物有30多种，主要分布在华南及西南地区。中华人民共和国药典(2005版)收载金钗石斛(D.nobile Lindl.)，铁皮石斛(Dendrobium candidum Wall.exLindl.)或马鞭石斛(D.fimbriatum Hook.Var.oculatum Hook.)及其近似种的新鲜或干燥茎可做中药石斛使用。多年来，由于产区药农的过度采挖，使得中药石斛的药用资源受到严重破坏，金钗石斛和铁皮石斛这两种植物的自然资源已濒临枯竭，均已被列为国家重点保护的珍稀濒危物种。
由于石斛属植物种子细小，萌发困难，同时无性繁殖系数低，加上其特殊的生活环境，给此类药材的大面积栽培带来很大困难。科学工作者和药农最广泛采用的是组织培养和人工栽培相结合的方法来繁殖铁皮石斛和金钗石斛。该方法存在的主要问题是无菌组培苗的移栽成活率低，抗病性差，易感染病原菌；人工栽培石斛的生产周期长，一般要5-7年才能收获。从目前情况看，石斛繁殖困难的问题还没有从根本上得到解决，导致生产上无法提供大量产品供药用。
根据兰科植物与真菌形成菌根结构的特点，我们自1987年开始从事自养型兰科药用植物菌根真菌的分离、培养，并进行了利用菌根真菌促进石斛、白芨等兰科药用植物生长和提高有效成分含量等方面的研究，并取得了较好效果。随后，我们自1992年开始进行兰科菌根真菌在石斛等兰科药用植物生长中的应用研究。我们从野生石斛的根中已经分离获得多种内生真菌，对它们促进石斛生长发育的关系进行了系统研究，从中筛选出对石斛的生长发育具有促进作用的优良菌株。将这些菌株用于石斛的栽培生产，对于提高石斛的产量和质量，保护石斛的自然资源具有重大的理论意义和实用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种应用菌根真菌大面积栽培石斛的方法，该方法石斛繁殖率高，栽培成活率高，可以缩短栽培石斛的生产周期，提高石斛的产量和质量，解决石斛药用资源短缺的问题。
为实现上述目的，本发明采用的技术是先分别培养菌根真菌和石斛苗，当石斛苗移栽到大田时加入菌根真菌共生栽培。本发明采用的4种小菇属菌根真菌经培养鉴定，分别为分离自铁皮石斛的石斛小菇MD-1(Mycena dendrobii)，分离自天麻的紫萁小菇MO-1(Mycenaosmundicola)，分离自墨兰的兰小菇MO-2(Mycena orchidicola)和分离自福建金线莲(花叶开唇兰)的开唇兰小菇MA-1(Mycena anoectochila)。这4种真菌于2002年1月14日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏单位地址北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所，保藏编号分别为MD-1CGMCC No.0685；MO-1CGMCC No.0689；MO-2CGMCC No.0688；MA-1CGMCC No.0687；保藏和存活证明见附件。
具体地说，本发明所述技术的步骤方法如下(除有特殊说明外，本发明中所述的比例均为重量百分比) 1.菌根真菌的培养 将上述4种菌根真菌自低温保藏的斜面试管菌种活化后，分别转接于PDA平皿中，于22-28℃恒温培养10-20天，分别在菌落边缘打孔成菌片，并以小碎块接入液体培养基中分别进行发酵培养制成种子菌种。种子菌种可以进一步接入液体或固体培养基进行放大培养。
真菌液体培养的培养基含有葡萄糖、无机盐类成分和天然添加物，其中葡萄糖的加入量为1.5-4％；无机盐类成分可以为硫酸镁，磷酸二氢钾，或磷酸氢二钾，或磷酸二氢钾和磷酸氢二钾以任意比例混合的混合物，其加入量为硫酸镁0.1-0.3％，磷酸二氢钾0.1-0.5％，或磷酸氢二钾0.1-0.5％，或磷酸二氢钾和磷酸氢二钾的混合物0.1-0.5％；天然添加物可以为麦麸(煮汁)，其加入量为2-5％。培养基pH 5.0-6.5。三角瓶或其他容器振荡培养或发酵罐通气培养，培养容器装量10-60％。培养基灭菌后接入上述菌根真菌，种子菌种接种量为培养容器装量的5-20％。菌根真菌液体培养的培养条件为振荡转速80-150转/分钟，18-28℃暗培养10-30天。培养结束后可直接使用或用匀浆机打碎培养产物备用。
菌根真菌固体培养的培养基中天然纤维性或淀粉性物质可以为阔叶树锯末、麦麸和碎玉米粒，这3种原料加入量之间的比例按重量计为阔叶树锯末∶麦麸∶碎玉米粒＝0.5-1.5∶0.5-1.5∶0.2-1.5。固体培养基的加水量为以上3种原料总重量的1-4倍。培养基pH 5.0-6.5。试管、玻璃罐头瓶或塑料袋等器皿静置培养，培养容器装量50-80％。培养基灭菌后接入液体培养的小菇属真菌的种子菌种，种子菌种的接种量为培养容器装量的5-15％。固体培养的培养条件为18-28℃暗培养，待菌丝从培养基顶部长入底部或长满培养基时(2个月左右)取出备用。
2.石斛苗的培养 石斛原球茎经过原球茎增殖、原球茎分化成苗、壮苗等步骤的培养，培育成苗。壮苗步骤可以将苗接在壮苗培养基上单独培养，也可以在壮苗培养的后期接入菌根真菌的PDA平皿培养的菌片，菌片直径3-15mm，每瓶苗接入1-5片菌片，或接入菌根真菌的液体培养物0.2-1.5ml，或接入菌根真菌的固体培养物0.2-1.5g，菌苗共培养时间为10-90天。经壮苗后的石斛苗可以在继代培养基上继代培养。各步骤所用培养基及培养时间分别为 (1)用于原球茎增殖的培养基是以1/2MS培养基为基本培养基，附加萘乙酸(NAA)、吲哚丁酸(IBA)和激动素(KT)，其加入量为每升(L)培养基加入NAA0.1-1.0mg，IBA0.1-0.8mg，KT0.1-0.8mg。培养时间45-120天。
(2)用于原球茎分化的培养基是以1/2MS培养基为基本培养基，附加IBA和KT，其加入量为每升(L)培养基加入IBA0.2-1.0mg，KT0.2-1.0mg。培养时间45-120天。
(3)用于壮苗的培养基是以1/2MS培养基为基本培养基，附加NAA、IBA和KT，其加入量为每升(L)培养基加入NAA0.2-1.5mg，IBA0.2-1.5mg，KT0.2-1.5mg。培养时间60-120天。
(4)用于石斛苗继代培养的培养基是以1/2MS培养基为基本培养基，每升(L)培养基附加马铃薯(煮汁)100-300g。培养时间60-120天。
石斛原球茎增殖、原球茎分化成苗、壮苗和苗的继代培养中，所用的每升(L)1/2MS基本培养基中均要添加蔗糖15-35g、肌醇50-150mg、琼脂6-15g。原球茎分化成苗、壮苗和苗的继代培养中，所用的每升(L)培养基中均要添加活性炭0.5-4g。培养基pH 5.0-6.5。用玻璃三角瓶或玻璃罐头瓶等器皿静置光照培养，培养容器装量10-50％。苗的培养条件为15-28℃光照培养，光照强度1500-5000Lux，光照时间8-12小时/天。
3.石斛苗与菌根真菌的共生栽培、田间管理及收获 石斛苗与菌根真菌的共生栽培基质有以下几种 (1)基质1中可以有蛭石、珍珠岩、锯末加刨花和碎石头，这4种材料加入量之间的比例按重量计为蛭石∶珍珠岩∶锯末加刨花∶碎石头＝1-2∶1∶2-5∶1-3； (2)基质2中可以有阔叶树树皮、腐殖土和碎石头，这3种材料加入量之间的比例按重量计为阔叶树树皮∶腐殖土∶碎石头＝3-6∶1-2∶1-5； (3)基质3中可以有泥炭土、珍珠岩、锯末加刨花和阔叶树树皮，这4种材料加入量之间的比例按重量计为泥炭土∶珍珠岩∶锯末加刨花∶阔叶树树皮＝1-2∶1∶2-5∶3-6； (4)基质4中可以有锯末加刨花和阔叶树树皮，这2种材料加入量之间的比例按重量计为锯末加刨花∶阔叶树树皮＝1-3∶2-6； (5)基质5中可以有锯末加刨花、阔叶树树皮和碎石头，这3种材料加入量之间的比例按重量计为锯末加刨花∶阔叶树树皮∶碎石头＝1-3∶2-6∶2-5； (6)基质6中可以有碎砖、阔叶树树皮和碎木炭，这3种材料加入量之间的比例按重量计为碎砖∶阔叶树树皮∶碎木炭＝1-5∶2-8∶1-4； (7)基质7中可以有锯末加刨花、碎木炭和阔叶树树皮，这3种材料加入量之间的比例按重量计为锯末加刨花∶碎木炭∶阔叶树树皮＝2-5∶1-3∶3-7； (8)基质8中可以有阔叶树树皮和蕨树根，这2种材料加入量之间的比例按重量计为阔叶树树皮∶蕨树根＝2-5∶1-3； 上述栽培基质中用到的材料的大小为碎刨花、碎木炭直径0.5-2cm，阔叶树树皮直径0.5-4cm，碎石头、碎砖直径1-5cm，蕨树根直径0.5-3cm； 栽培中还要用到山毛榉科Fagaceae植物栎树或其他杂木树的自然落叶，用时粉碎并浸湿，碎树叶直径0.5-2cm； 上述材料中的阔叶树树皮、锯末和刨花、蕨树根、腐殖土等可直接使用，或高温灭菌，或提前两个月铺好使其熟化，或堆积并盖塑料布发酵1-2个月，使其熟化以消除病虫害。
4种菌根真菌的液体培养物或固体培养物，在用于与石斛的共生栽培时，可以单独使用，或分别培养后任意选择两种或两种以上共同使用。石斛苗和菌根真菌按以下方法共生栽培 (1)地上遮阳栽培在具有遮阳网的露天大棚，或塑料薄膜温室，或玻璃温室中进行栽培，栽培基质厚度5-20cm。栽培时以2-5株石斛苗为一丛进行栽培，先在石斛苗根的基部放置0.5-5g湿的碎树叶，再在石斛苗根部放置以上备好的菌根真菌液体培养物0.4-2.5ml，或菌根真菌固体培养物0.3-2.0g，最后用栽培基质埋住石斛苗的根部，苗丛栽培的株、行距为8-18cm。
(2)立体遮阳栽培在地上搭架分层立体栽培，在硬质材料的盆或盒等容器的底部平铺一层共生栽培基质，栽培基质厚度3-10cm。栽培时以2-5株石斛苗为一丛进行栽培，先在石斛苗根的基部0.5-5g湿的碎树叶，再在石斛苗根部放置以上备好的菌根真菌液体培养物0.4-2.5ml，或菌根真菌固体培养物0.3-2.0g，最后用栽培基质埋住石斛苗的根部。丛苗栽培的株、行距为8-18cm。
石斛苗与菌根真菌共生栽培后需要的生长条件环境温度为5-30℃，光照量为正常日光量的1/3或1/2，避免直射光，或照度为2000-10000Lux；在石斛与菌根真菌共生的过程中每年可以补施液体培养或固体培养的菌根真菌0-5次。
与菌根真菌共生栽培的石斛，在上述栽培条件下生长2-3年可以收获，收获时采用“存一去二或存二去三”的方法收获栽培石斛的茎，即剪去二年或三年生的茎，保存一年或二年以下的幼茎；或采用“存二去三或存三去四”的方法收获栽培石斛的茎，即剪去三年或四年生的老茎，保存二或三年以下的幼茎；收获的新鲜石斛茎直接加工成产品，或阴干，或60℃以下烘干。
具体实施例方式 实施例一 1.紫萁小菇MO-1(Mycena osmundicola)的培养 将MO-1自低温保藏的斜面试管菌种活化一次后，转接于PDA平皿中，25℃恒温培养18天，用φ8mm的打孔器分别在平皿中的菌落边缘打孔成菌片，分别以小碎块接入液体培养基中发酵培养。液体培养基的组成按重量百分含量计算为葡萄糖2.5％，磷酸二氢钾0.15％，磷酸氢二钾0.1％，硫酸镁0.15％，麦麸3％(煮汁)。培养基pH 5.6，500mL三角瓶装培养基250mL，高压灭菌后接入MO-1真菌。培养条件为摇床震荡转速120转/分钟，23℃暗培养25天后用匀浆机打碎菌体及发酵物备用。
2.铁皮石斛苗的培养 铁皮石斛种子在无菌条件下萌发、分化形成原球茎，原球茎经过原球茎增殖、原球茎分化成苗和壮苗等步骤的培养，培育成苗。
原球茎增殖的培养基是以1/2MS培养基为基本培养基，每升(L)培养基加入蔗糖30g，肌醇100mg，萘乙酸(NAA)0.2mg，吲哚丁酸(IBA)0.2mg，激动素(KT)0.2mg，琼脂7.5g。培养基pH 5.6。100mL玻璃三角瓶装量35mL，121℃灭菌20分钟，接入铁皮石斛原球茎。培养条件24-26℃光照培养80天，光照强度3000Lux，光照时间10小时/天。
原球茎分化的培养基是以1/2MS培养基为基本培养基，每升(L)培养基加入蔗糖20g，肌醇80mg，吲哚丁酸(IBA)0.5mg，激动素(KT)0.5mg，活性炭1g，琼脂7.0g。培养基pH 5.8。100mL玻璃三角瓶装量30mL，121℃灭菌20分钟，接入铁皮石斛原球茎。培养条件24-26℃光照培养60天，光照强度3000Lux，光照时间10小时/天。
壮苗培养的培养基是以1/2MS培养基为基本培养基，每升(L)培养基加入蔗糖30g，肌醇120mg，萘乙酸(NAA)0.5mg，吲哚丁酸(IBA)0.5mg，激动素(KT)0.2mg，活性炭2g，琼脂8.5g。培养基pH 5.7。100mL玻璃三角瓶装量40mL，121℃灭菌20分钟，接入铁皮石斛苗。培养条件24-26℃光照培养100天，光照强度3000Lux，光照时间10小时/天。铁皮石斛苗培养至株高3.5cm以上，有节3个以上的壮苗即可进行栽培。
石斛苗继代的培养基是以1/2MS培养基为基本培养基，每升(L)培养基加入马铃薯(煮汁)200g，蔗糖25g，肌醇100mg，活性炭2g，琼脂7g。培养基pH 5.8。100mL玻璃罐头瓶装量30％，121℃灭菌20分钟，接入铁皮石斛的壮苗。培养条件为24-26℃光照培养，光照强度3000Lux，光照时间10小时/天。暂时不能移栽的铁皮石斛的壮苗可以在此培养基上培养。
3.铁皮石斛苗与紫萁小菇MO-1的共生栽培 共生栽培的基质选用基质5，其中锯末加刨花、阔叶树树皮和碎石头的加入量之间的比例按重量计为锯末加刨花∶阔叶树树皮∶碎石头＝2∶2∶3。锯末加刨花和阔叶树树皮直接使用。采用立体遮阳的方法进行栽培。在木质托盘的基部平铺一层4-6cm厚的共生栽培基质，栽培时以3株铁皮石斛苗为一丛进行栽培，先在铁皮石斛苗根的基部放置2g左右的湿的碎树叶，再在石斛苗根部放置以上备好的紫萁小菇MO-1液体培养物2ml左右，使铁皮石斛的根与MO-1菌接触，最后用栽培基质埋住石斛苗的根部。丛苗栽培的株、行距为10cm。
在露天搭架，分层放置木质托盘，并架设遮阳网，避免直射光，最忌夏秋中午前后的直射光，光照量为正常日光量的1/3左右，照度2000-5000Lux，每天光照9-11h。石斛适宜的环境温度为18-23℃，其空气温度夏天应控制在25℃以下，冬天应控制在18℃以上。石斛生长需较高的空气湿度，但栽培基质中不宜积水。
铁皮石斛苗与紫萁小菇MO-1共生栽培后，每年在春秋两季补施液体培养或固体培养的紫萁小菇MO-12-4次。铁皮石斛培养2-4年收获，采用存二去三或存三去四的方法，即收获生长了三或四年的老茎，保存二或三年以下的幼茎。收获的铁皮石斛阴干。
实施例二 1.石斛小菇MD-1(Mycena dendrobii)和兰小菇MO-2(Mycena orchidicola)的培养将MD-1和MO-2分别自低温保藏的斜面试管菌种活化一次后，分别转接于PDA平皿中，25℃恒温培养10天，用φ8mm的打孔器分别在平皿中的菌落边缘打孔成菌片，分别以小碎块接入液体培养基中发酵培养。液体培养基的组成按重量百分含量计算为葡萄糖3％，磷酸二氢钾0.3％，硫酸镁0.15％，麦麸3％(煮汁)。培养基pH 6.0。500mL三角瓶装培养基200mL，高压灭菌后分别接入MD-1和MO-2真菌。培养条件为摇床震荡转速100转/分钟，25℃暗培养10天，作为MD-1和MO-2真菌的种子菌种。
将液体培养的MD-1和MO-2真菌的种子菌种分别接入固体培养基中进行培养。固体培养基的组成为阔叶树锯末、麦麸和碎玉米粒，这3种原料加入量之间的比例按重量计为阔叶树锯末∶麦麸∶碎玉米粒＝1∶1∶0.5。固体培养基的加水量为以上3种原料总重量的2.5倍。培养基pH 5.5。培养基装在玻璃罐头瓶中，培养容器装量60-70％。培养基灭菌后分别接入液体培养的MD-1和MO-2真菌的种子菌种，种子菌种的接种量为培养容器装量的10％左右。培养条件为22-23℃静置暗培养。待MD-1和MO-2真菌的菌丝从培养基顶部长入底部或长满培养基时取出，将两种菌根真菌培养物按约1∶1的比例混合，备用。
2.金钗石斛苗的培养 金钗石斛种子在无菌条件下萌发、分化形成原球茎，原球茎经过原球茎增殖、原球茎分化成苗和壮苗等步骤的培养，培育成苗。
原球茎增殖的培养基是以1/2MS培养基为基本培养基，每升(L)培养基加入蔗糖15g，肌醇90mg，萘乙酸(NAA)0.2mg，吲哚丁酸(IBA)0.2mg，激动素(KT)0.1mg，琼脂7.5g。培养基pH 5.7。100mL玻璃三角瓶装量25mL，121℃灭菌20分钟，接入金钗石斛原球茎。培养条件24-26℃光照培养60天，光照强度2000Lux，光照时间10小时/天。
原球茎分化的培养基是以1/2MS培养基为基本培养基，每升(L)培养基加入蔗糖25g，肌醇80mg，吲哚丁酸(IBA)0.3mg，激动素(KT)0.2mg，活性炭1.5g，琼脂9.0g。培养基pH 6.0。100mL玻璃三角瓶装量30mL，121℃灭菌20分钟，接入金钗石斛原球茎。培养条件24-26℃光照培养50天，光照强度2000Lux，光照时间10小时/天。
壮苗培养的培养基是以1/2MS培养基为基本培养基，每升(L)培养基加入蔗糖35g，肌醇120mg，萘乙酸(NAA)0.5mg，吲哚丁酸(IBA)0.8mg，激动素(KT)0.1mg，活性炭3g，琼脂8.5g。培养基pH 5.6。100mL玻璃三角瓶装量40mL，121℃灭菌20分钟，接入金钗石斛苗。培养条件24-26℃光照培养100天，光照强度2000Lux，光照时间10小时/天。在壮苗培养至70天时，向培养基中接入兰小菇MO-2的固体培养物约2g，与金钗石斛苗共同培养至出瓶移栽。金钗石斛苗培养至株高3.5cm以上，有节3个以上的壮苗即可进行栽培。
3.金钗石斛苗与MD-1石斛小菇和兰小菇MO-2的共生栽培 共生栽培的基质选用基质2，其中阔叶树树皮、腐殖土和碎石头的加入量之间的比例按重量计为阔叶树树皮∶腐殖土∶碎石头＝2∶1∶2。阔叶树树皮和腐殖土提前两个月左右堆积使其熟化后使用。采用地上遮阳的方法，在塑料薄膜温室中进行栽培。在温室铺一层10-12cm厚的共生栽培基质，栽培时以3-4株金钗石斛苗为一丛进行栽培，先在金钗石斛苗根的基部放置2g左右的湿的碎树叶，再在石斛苗根部放置以上备好的MD-1和MO-2真菌固体培养物的混合物1.5g左右，使金钗石斛苗的根与MD-1和MO-2的混合物接触，最后用栽培基质埋住石斛苗的根部。苗丛栽培的株、行距为10cm。
石斛适宜的环境温度为18-23℃，其空气温度夏天应控制在25℃以下，冬天应控制在18℃以上。温室内要有遮阳网，避免直射光，最忌夏秋中午前后的直射光，光照量为正常日光量的1/3左右，照度2000-5000Lux，每天光照9-11h。石斛生长需较高的空气湿度，但栽培基质中不宜积水。
金钗石斛苗与石斛小菇MD-1和兰小菇MO-2共生栽培后，每年在春秋两季补施液体培养或固体培养的石斛小菇MD-1和兰小菇MO-22-4次。金钗石斛培养2-4年收获，采用存二去三或存三去四的方法，即收获生长了三或四年的老茎，保存二或三年以下的幼茎。收获的金钗石斛阴干。
比较例 菌根真菌对石斛苗生长的影响 将石斛小菇MD-1(Mycena dendrobii)和开唇兰小菇MA-1(Mycena anoectochila)分别用液体培养基摇床震荡暗培养15天。液体培养基组成按重量百分含量计算为葡萄糖2％，磷酸二氢钾0.25％，硫酸镁0.15％，麦麸2％(煮汁)。培养基pH 5.6，将两种菌的液体培养物等量混合，用匀浆机打碎，备用。
由原球茎分化的铁皮石斛苗和金钗石斛苗，分别单独在壮苗培养基上培养90天。壮苗培养基是以1/2MS培养基为基本培养基，每升(L)培养基加入蔗糖30g，肌醇100mg，萘乙酸(NAA)0.5mg，吲哚丁酸(IBA)0.5mg，激动素(KT)0.1mg，活性炭2g，琼脂7.5g。培养基pH5.8。
在共生栽培基质1上，用石斛苗与液体培养的MD-1和MA-1混合培养物进行共生栽培，考察菌根真菌对铁皮石斛和金钗石斛生长的影响。以不加菌根真菌栽培的铁皮石斛和金钗石斛的生长情况作为对照。共生栽培在玻璃温室中进行。基质1中蛭石、珍珠岩、锯末加刨花和碎石头的加入量之间的比例按重量计为蛭石∶珍珠岩∶锯末加刨花∶碎石头＝1∶0.5∶2∶1。
在温室铺一层10-12cm厚的共生栽培基质，栽培时均以3株石斛苗为一丛进行栽培，先在石斛苗根的基部放置2g左右的湿的碎树叶，再在石斛苗根部放置以上备好的MD-1和MA-1真菌液体培养物的混合物1.5ml左右，使石斛苗的根与MD-1和MA-1的混合物接触，最后用栽培基质埋住石斛苗的根部。对照则用栽培基质埋住石斛苗的根部直接栽培即可。苗丛栽培的株、行距为10cm。
石斛适宜的环境温度为18-23℃，其空气温度夏天应控制在25℃以下，冬天应控制在18℃以上。温室内要有遮阳网，避免直射光，最忌夏秋中午前后的直射光，光照量为正常日光量的1/3左右，照度2000-5000Lux，每天光照9-11h。石斛生长需较高的空气湿度，但栽培基质中不宜积水。
石斛苗与石斛小菇MD-1和开唇兰小菇MA-1共生栽培后，每隔4个月补施一次石斛小菇MD-1和开唇兰小菇MA-1固体培养物的混合物。石斛苗于栽培2年后收获，将与菌根真菌共生栽培的石斛苗和对照石斛苗连根取出，洗净培养基质，观察苗的形态，发现接菌栽培的石斛苗与对照石斛苗相比，节间明显膨大。收获的石斛苗于55℃干燥后称量苗的干重，统计分析结果表明，与对照铁皮石斛苗相比，接菌栽培的铁皮石斛苗的干重有显著提高，提高了24％；与对照金钗石斛苗相比，接菌栽培的金钗石斛苗的干重有显著提高，提高了19％。以葡萄糖为标准品，用苯酚-硫酸法测定铁皮石斛苗中多糖的含量，结果表明，与对照铁皮石斛苗相比，接菌栽培的铁皮石斛苗中多糖含量提高了2-3倍，多糖含量最高可达15.1％，已接近野生药材。以石斛碱为标准品，用酸性染料比色法测定金钗石斛苗中总生物碱的含量，结果表明，与对照金钗石斛苗相比，接菌栽培的金钗石斛苗中总生物碱含量能提高30-50％，总生物碱含量最高可达2.3％。
从以上结果可以看出，这4种菌根真菌对石斛的生长发育有明显促进作用。采用该项新技术，石斛生长周期可由传统栽培的5-7年缩短到2至3年；产量提高20％。与不接菌根真菌栽培的石斛苗(对照)相比，该项技术使石斛苗中多糖和生物碱等化学成分含量提高至接近野生石斛含量水平，从而保证了菌根共生后石斛药材的质量，为今后菌根真菌应用于石斛规范化栽培提供了科学依据。另外，该技术栽培方法简单、投资少、不施任何化肥和农药，生产出的石斛为绿色产品。
权利要求
1.一种应用菌根真菌大面积栽培石斛的方法，包括步骤
(1)菌根真菌的发酵培养
将4种菌根真菌MD-1，MO-1，MO-2，MA-1自低温保藏的斜面试管菌种活化后，分别转接于含PDA培养基的平皿中，于22-28℃恒温培养10-20天，分别在菌落边缘打孔成菌片，并以小碎块接入液体培养基中进行发酵培养；
由平皿固体菌种转接液体培养的MD-1，MO-1，MO-2和MA-1真菌可以直接使用，也可以作为种子菌种，种子菌种再进一步接入液体或固体培养基进行放大培养；
真菌液体培养的培养基含有葡萄糖、无机盐类成分和天然添加物，真菌用三角瓶或其他容器振荡或发酵罐通气暗培养，培养结束后可直接使用或用匀浆机打碎培养产物备用；
真菌固体培养的培养基含有天然纤维性或淀粉性物质，真菌用试管、玻璃罐头瓶或塑料袋等器皿静置暗培养，待菌丝大部分或全部长满培养基时取出备用；
(2)石斛苗的培养
石斛苗由石斛原球茎经过原球茎增殖、原球茎分化成苗、壮苗等步骤的培养，用玻璃三角瓶或玻璃罐头瓶等器皿静置光照培养，培育成苗；经壮苗后的石斛苗可以在继代培养基上继代培养；
壮苗步骤可以将苗接在壮苗培养基上单独培养，也可以在壮苗培养的后期接入菌根真菌共生培养一段时间，再出瓶用于大面积栽培；
原球茎增殖、原球茎分化成苗、壮苗、苗的继代培养等步骤所用的培养基是以1/2MS培养基为基本培养基，添加蔗糖、肌醇、琼脂，或添加活性炭、添加不同种类和浓度的植物激素，或添加马铃薯提取物；
(3)石斛苗与菌根真菌的共生栽培、田间管理及收获
石斛苗与菌根真菌大面积共生栽培的栽培基质含有树皮、树叶、蕨树根、锯末、刨花、木炭、石头、砖、蛭石、珍珠岩、腐殖土、泥炭土；
石斛苗和菌根真菌按以下方法共生栽培
①地上遮阳栽培在具有遮阳网的露天大棚，或塑料薄膜温室，或玻璃温室中进行栽培，栽培时先在石斛苗根的基部放置少量碎树叶，再在石斛苗根部放置以上备好的液体或固体菌根真菌适量，最后用栽培基质埋住石斛苗的根部；
②立体遮阳栽培在地上搭架分层立体栽培，在硬质材料的盆或盒等容器的底部平铺一层共生栽培基质，栽培时先在石斛苗根的基部放置适量碎树叶，再在石斛苗根部放置以上备好的液体或固体菌根真菌适量，最后用栽培基质埋住石斛苗的根部；
在石斛生长的过程中可以根据需要补施液体或固体菌根真菌；
石斛苗出瓶后与菌根真菌共生栽培2-3年后即可收获。
2.如权利要求1所述的培养方法，其中所述的4种小菇属真菌分别为石斛小菇MD-1(Mycena dendrobii)，保藏编号CGMCC No.0685，紫萁小菇MO-1(Mycena osmundicola)，保藏编号CGMCC No.0689，兰小菇MO-2(Mycena orchidicola)，保藏编号CGMCC No.0688，和开唇兰小菇MA-1(Mycena anoectochila)，保藏编号CGMCC No.0687。
3.如权利要求1和2所述的方法，其特征在于小菇属4种菌根真菌液体培养的培养基中葡萄糖的加入量按重量计为1.5-4％；无机盐类成分可以为硫酸镁，磷酸二氢钾，或磷酸氢二钾，或磷酸二氢钾和磷酸氢二钾以任意比例混合的混合物，其加入量按重量计为硫酸镁0.1-0.3％，磷酸二氢钾0.1-0.5％，或磷酸氢二钾0.1-0.5％，或磷酸二氢钾和磷酸氢二钾的混合物0.1-0.5％；天然添加物可以为麦麸(煮汁)，其加入量按重量计为2-5％；培养基pH5.0-6.5；三角瓶或其他容器振荡培养或发酵罐通气培养，培养容器装量10-60％；培养基灭菌后接入上述4种小菇属真菌，种子菌种接种量为培养容器装量的5-20％；液体培养的培养条件为振荡转速80-150转/分钟，18-28℃暗培养10-30天；培养结束后可直接使用或用匀浆机打碎培养产物备用。
4.如权利要求1和2所述的方法，其特征在于小菇属4种菌根真菌固体培养的培养基中天然纤维性或淀粉性物质可以为阔叶树锯末、麦麸和碎玉米粒，这3种原料加入量之间的比例按重量计为阔叶树锯末∶麦麸∶碎玉米粒＝0.5-1.5∶0.5-1.5∶0.2-1.5；固体培养基的加水量为以上3种原料总重量的1-4倍；培养基pH5.0-6.5；试管、玻璃罐头瓶或塑料袋等器皿静置培养，培养容器装量50-80％；培养基灭菌后接入液体培养的小菇属真菌的种子菌种，种子菌种的接种量为培养容器装量的5-15％；固体培养的培养条件为18-28℃暗培养，待菌丝从培养基顶部长入底部或长满培养基时取出备用。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于石斛苗的培养中，
(1)原球茎增殖培养的培养基中添加的植物激素为萘乙酸(NAA)、吲哚丁酸(IBA)和激动素(KT)，其加入量为每升(L)培养基加入NAA0.1-1.0mg，IBA0.1-0.8mg，KT0.1-0.8mg；培养时间45-120天；
(2)原球茎分化成苗的培养基中添加的植物激素为IBA和KT，其加入量为每升(L)培养基加入IBA0.2-1.0mg，KT0.2-1.0mg；培养时间45-120天；
(3)壮苗培养基中添加的植物激素为NAA、IBA和KT，其加入量为每升(L)培养基加入NAA0.2-1.5mg，IBA0.2-1.5mg，KT0.2-1.5mg；培养时间60-120天；
壮苗培养中，可以接入菌根真菌的PDA平皿培养的菌片，菌片直径3-15mm，每瓶苗接入1-5片菌片，或接入菌根真菌的液体培养物0.2-1.5ml，或接入菌根真菌的固体培养物0.2-1.5g；菌苗共培养时间为10-90天；
(4)石斛苗继代培养的培养基中添加马铃薯(煮汁)的量为每升(L)培养基加入100-300g；培养时间60-120天；
石斛原球茎增殖、原球茎分化成苗、壮苗和苗的继代培养中，所用的每升(L)1/2MS基本培养基中均要添加蔗糖15-35g、肌醇50-150mg、琼脂6-15g；原球茎分化成苗、壮苗和苗的继代培养中，所用的每升(L)培养基中均要添加0.5-4g的活性炭；培养基pH5.0-6.5；用试管或玻璃瓶等器皿培养，培养容器装量10-50％；苗的培养条件为15-28℃光照培养，光照强度1500-5000Lux，光照时间8-12小时/天。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于石斛苗与菌根真菌的共生栽培基质有以下几种
(1)基质1中可以有蛭石、珍珠岩、锯末加刨花和碎石头，这4种材料加入量之间的比例按重量计为蛭石∶珍珠岩∶锯末加刨花∶碎石头＝1-2∶1∶2-5∶1-3；
(2)基质2中可以有阔叶树树皮、腐殖土和碎石头，这3种材料加入量之间的比例按重量计为阔叶树树皮∶腐殖土∶碎石头＝3-6∶1-2∶1-5；
(3)基质3中可以有泥炭土、珍珠岩、锯末加刨花和阔叶树树皮，这4种材料加入量之间的比例按重量计为泥炭土∶珍珠岩∶锯末加刨花∶阔叶树树皮＝1-2∶1∶2-5∶3-6；
(4)基质4中可以有锯末加刨花和阔叶树树皮，这2种材料加入量之间的比例按重量计为锯末加刨花∶阔叶树树皮＝1-3∶2-6；
(5)基质5中可以有锯末加刨花、阔叶树树皮和碎石头，这3种材料加入量之间的比例按重量计为锯末加刨花∶阔叶树树皮∶碎石头＝1-3∶2-6∶2-5；
(6)基质6中可以有碎砖、阔叶树树皮和碎木炭，这3种材料加入量之间的比例按重量计为碎砖∶阔叶树树皮∶碎木炭＝1-5∶2-8∶1-4；
(7)基质7中可以有锯末加刨花、碎木炭和阔叶树树皮，这3种材料加入量之间的比例按重量计为锯末加刨花∶碎木炭∶阔叶树树皮＝2-5∶1-3∶3-7；
(8)基质8中可以有阔叶树树皮和蕨树根，这2种材料加入量之间的比例按重量计为阔叶树树皮∶蕨树根＝2-5∶1-3；
上述栽培基质中用到的材料的大小为碎刨花、碎木炭直径0.5-2cm，阔叶树树皮直径0.5-4cm，碎石头、碎砖直径1-5cm，蕨树根直径0.5-3cm；
栽培中还要用到山毛榉科Fagaceae植物栎树或其他杂木树的自然落叶，用时粉碎并浸湿，碎树叶直径0.5-2cm；
上述材料中的阔叶树树皮、锯末和刨花、蕨树根、腐殖土等可直接使用，或高温灭菌，或提前两个月铺好使其熟化，或堆积并盖塑料布发酵1-2个月，使其熟化以消除病虫害。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于石斛苗与菌根真菌共生栽培时，以2-5株石斛苗为一丛进行栽培，先在每丛石斛苗根的基部放置0.5-5g湿的碎树叶，再在每丛石斛苗的根部放置上述制备好的菌根真菌液体培养物0.4-2.5ml，或菌根真菌固体培养物0.3-2.0g，最后用栽培基质压住苗的根部；苗丛栽培的株、行距为8-18cm；
采用地上遮阳栽培的方法进行石斛苗与菌根真菌共生栽培时，栽培基质厚度5-20cm；
采用立体遮阳栽培的方法进行石斛苗与菌根真菌共生栽培时，栽培基质厚度3-10cm；
石斛苗与菌根真菌共生栽培后需要的生长条件环境温度为5-30℃，光照量为正常日光量的1/3或1/2，或照度为2000-10000Lux；在石斛与菌根真菌共生的过程中每年可以补施液体培养或固体培养的菌根真菌0-5次。
8.如权利要求1和7所述的方法，其特征在于与菌根真菌共生栽培的石斛，在上述栽培条件下生长2-3年可以收获，收获时采用“存一去二或存二去三”的方法收获栽培石斛的茎，即剪去二年或三年生的茎，保存一年或二年以下的幼茎；或采用“存二去三或存三去四”的方法收获栽培石斛的茎，即剪去三年或四年生的老茎，保存二或三年以下的幼茎；收获的新鲜石斛茎直接加工成产品，或阴干，或60℃以下烘干。
9.如权利要求1-8所述的方法，其特征在于4种菌根真菌的液体培养物或固体培养物，在用于与石斛的共生栽培时，可以单独使用，或分别培养后任意选择两种或两种以上共同使用。
10.用于任一权利要求1-9所述方法的菌根真菌为小菇属真菌石斛小菇MD-1(Mycenadendrobii)，保藏编号CGMCC No.0685，紫萁小菇MO-1(Mycena osmundicola)，保藏编号CGMCC No.0689，兰小菇MO-2(Mycena orchidicola)，保藏编号CGMCC No.0688，和开唇兰小菇MA-1(Mycena anoectochila)，保藏编号CGMCC No.0687。
全文摘要
一种菌根真菌在石斛大面积栽培中的应用技术，所用的4种菌根真菌为小菇属真菌石斛小菇(Mycena dendrobii)，紫萁小菇(Mycen osmundicola)，兰小菇(Mycena orchidicola)，开唇兰小菇(Mycena anoectochila)；先分别培养菌根真菌和石斛苗，当石斛苗移栽到大田时加入菌根真菌共生栽培。采用该项新技术，可以大大缩短石斛的生长周期，提高石斛药材的产量和有效成分的含量。该项技术栽培方法简单、易于大面积推广、投资少、不施任何化学肥料、激素和农药，生产出的石斛药材为绿色产品。
文档编号C12N1/14GK1961652SQ20051011770
公开日2007年5月16日 申请日期2005年11月7日 优先权日2005年11月7日
发明者郭顺星, 陈晓梅, 宋经元, 王春兰, 孟志霞, 肖培根 申请人:中国医学科学院药用植物研究所