专利名称：柞蚕溶菌酶的基因序列及其表达产物的制备方法
技术领域：
本发明涉及的是分子生物学、酶学、基因工程技术领域。特别是柞蚕溶菌酶基因序列及利用基因工程技术表达并制备成熟柞蚕溶菌酶多肽的方法。
背景技术：
溶菌酶(Lysonzyme，EC 3.2.1.17)最早由英国科学家Alexander Fleming于1922年在蛋清中发现，是一种广泛存在于各种动植物中的糖苷水解酶。溶菌酶能够与细菌细胞壁结合，作用于N-乙酰氨基葡萄糖和N-乙酰胞壁酸之间的β-1，4键。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由胞质壁和磷酸质组成，其胞质壁又是由杂多糖与多肽组成的糖蛋白，而这种杂多糖正是由N-乙酰胞壁酸和乙酰氨基葡萄糖以β-1，4糖苷键连结的，所以溶菌酶对革兰氏阳性细菌有很强的杀伤力，而对人和动物无毒副性作用。溶菌酶已在医药、食品工业、化妆品及畜牧业等领域得到应用。
由于溶菌酶的用途广泛，用量大，而不同物种中存在的溶菌酶其作用有一定差异，因此开发新的溶菌酶资源仍是目前研究的热点。对昆虫中的家蚕溶菌酶的研究表明，昆虫溶菌酶的核心结构与蛋清溶菌酶和α-乳清蛋白非常相似，但暴露的环区与这两种蛋白有很大不同。家蚕溶菌酶的催化残基与鸡蛋清溶菌酶相比是保守的，暗示这两种酶的催化机制可能是相同的，但结合底物的非催化残基有所不同，它们在底物的结合特性及活力水平上有细微的差别。抗体免疫分析表明，鸡蛋清溶菌酶与家蚕溶菌酶无交叉反应。抑菌活性分析表明，家蚕溶菌酶对革兰氏阳性菌的溶菌作用较鸡蛋清溶菌酶强，尤其在温度较低的情况下(如15-30℃)，对温度的适应范围宽(15-60℃)，而且家蚕溶菌酶作用的最适pH值和温度都较鸡蛋清溶菌酶低，推测昆虫溶菌酶具有鸡蛋清溶菌酶所没有的共同结构域。研究结果表明，昆虫溶菌酶具有潜在的应用价值。
柞蚕(Antheraea pernyi，Ap)是在我国北方野外饲养的经济昆虫，具有较强的抗病和抗寒能力。其体内的溶菌酶是主要的杀菌蛋白成分之一，具有实际应用价值。早期是利用柞蚕蛹，通过诱导，分离蛹血淋巴，适度加热除去大分子蛋白，再经过分子筛凝胶柱层析，离子交换柱层析等方法纯化柞蚕溶菌酶[吕建秋、陈凤珍、黄自然，蚕业科学，1990，16(4)。
罗立新、姚汝华、黄自然，工业微生物，1997，27(1)]。由于原料来源的限制，以及生产工艺复杂等，其应用受到限制。特别是至今对柞蚕溶菌酶基因序列缺乏深入研究，更无对其基因工程表达产物制备的报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是用切实可靠的方法研究并得出柞蚕溶菌酶基因的全序列，同时还提供柞蚕溶菌酶基因在酵母菌中的表达和表达产物的制备方法。
本发明的技术方案是用大肠杆菌诱导柞蚕蛹，2天后，取柞蚕蛹脂肪体，提取总RNA，反转录成cDNA。根据已知不同生物种类的溶菌酶基因的序列，设计简并引物。用RLM-RACE方法分别分析柞蚕溶菌酶基因5’端和3’端非编码区的序列，根据序列分析的结果，设计一对特异性引物，通过PCR扩增得到柞蚕溶菌酶基因编码区片段。进一步分析获得柞蚕溶菌酶基因cDNA的全序列aaaatacgtctaacgacatcgacgcaggtgacacgcgtttaaaaATGTTCAAGTATATTGTTTTGTTTGCCGTTTTGGCTCTGTCTTTGCATAATTGCGAGGGGAAATGGTTTACCAAATGTGGGCTAGTGCACGAGCTGAGGAGACAAGGCTTCGACGAGAGCCTAATGCGGGACTGGGTCTGTCTCGTTGAGAACGAAAGCAGCCGTTATACTAATAAAATCGGTAAAGTGAATAAGAATGGCTCACGAGACTACGGCCTCTTCCAGATCAATGACAAATATTGGTGTAGTAAGACCTCCACCCCCGGAAAGGATTGCAATGTGACTTGTAATCAGCTCTTGACTGACGATATTACAGTCGCGGCGACCTGCGCGAAAAAGATTTACAAACGCCATAAGTTTAACGCTTGGTACGGATGGTTAAACCACTGCCAACACTCTCTTCCAGACATTAGCGACTGTTAAgaaaacgcttgtggaagcaaactaagtaaatctcgttatttcatctctgaaaataaaagaagtaatattacaaaagaatgctctcgaaaaacaaaatttaactattatttcgtgtttacattgtgatagatattgttattatttaaacacaaagccttttctacttttttacatatgagaaataaagacttcataacaaaaaa
注大写字母表示柞蚕溶菌酶基因编码区的碱基序列，其中有下划线的部分为柞蚕溶菌酶信号肽碱基序列，黑体大写字母部分为柞蚕溶菌酶成熟肽碱基序列。其余小写字母部分分别为柞蚕溶菌酶基因的5’端和3’端非编码区碱基序列。
并推测出编码的氨基酸序列M F K Y I V L F A V L A L S L H N C EG K W F T K C G L V H E L R R Q G F DE S L M R D W V C L V E N E S S R Y TN K I G K V N K N G S R D Y G L F Q IN D K Y W C S K T S T P G K D C N V TC N Q L L T D D I T V A A T C A K K IY K R H K F N A W Y G W L N H C Q H SL P D I S D C注前20个氨基酸序列为柞蚕溶菌酶信号肽氨基酸序列，黑体大写字母部分为柞蚕溶菌酶成熟肽氨基酸序列。
柞蚕溶菌酶基因的编码区核酸序列为420bp，编码140个氨基酸，其中前20个氨基酸为信号肽序列，成熟肽部分为120个氨基酸。预测柞蚕溶菌酶成熟肽的分子量为13,986，等电点为pI8.46。在柞蚕溶菌酶氨基酸序列中，第51位至53位氨基酸的排列是天冬酰胺(N)51-谷氨酸(E)52-丝氨酸(S)53[Asn51-Glu52-Ser53]氨基酸序列，预测是可能的一个糖基化位点，这一序列在人、蛋清和家蚕溶菌酶氨基酸序列中是不存在的。
将柞蚕溶菌酶成熟肽部分的120个氨基酸的基因片段克隆至酵母表达载体pPIC9K中，并转化至酵母菌GS115(或KM71)中。经过MD培养基和高浓度G418(4mg/ml)筛选，得到高拷贝的转化菌株，用MM培养基确定菌株的表型为Muts。用混有溶壁微球菌的BMMY固体培养基筛选高活性的柞蚕溶菌酶表达菌株。含柞蚕溶菌酶基因的酵母菌株先在BMGY液体培养基中，30℃发酵培养，当OD值在9.0左右时，更换为BMMY培养基，继续培养，保持甲醇浓度在0.5％，100小时后结束培养，收集培养液上清，用于重组柞蚕溶菌酶的纯化。
用截流分子量30KD的超滤器，超滤上清液，浓缩液经过CMSepharose-CL 6B离子交换层析柱，连续洗脱留取活性峰液，经透析后分装冻干。鉴定蛋白质分子量和活性单位。产品可用于杀灭或抑制革兰氏阳性细菌和部分革兰氏阴性细菌。
Schiff试剂染色及Endo H酶解实验证明，在酵母中表达的柞蚕溶菌酶是经过糖基化修饰的。
本发明首次提供了柞蚕溶菌酶基因cDNA的克隆方法、cDNA全序列及其所编码的氨基酸序列，同时还提供了柞蚕溶菌酶基因在酵母菌中的表达和表达产物的制备方法。
以下用具体施例作进一步的说明。
附图1为柞蚕溶菌酶3’RACE cDNA片段，约440bp(碱基对)。
附图2为柞蚕溶菌酶5’RACE cDNA片段，约330bp(碱基对)。
附图3为柞蚕溶菌酶基因cDNA序列和推测的编码氨基酸序列。
附图4为柞蚕溶菌酶基因酵母表达载体构建。
具体实施例方式
实施例1柞蚕溶菌酶基因的克隆和序列分析(1)用大肠杆菌(E.coli，K12)诱导柞蚕蛹，2天后，取柞蚕蛹脂肪体，用试剂TRIZOLReagent(GIBCOLBRL)提取总RNA。用RLM-RACE(FirstChoiceTMRLM-RACE Kit，Ambion)方法分别合成3’RLM-RACE cDNA和5’RLM-RACE cDNA。根据已知不同生物种类的溶菌酶基因的序列，设计简并引物，序列如下Ply05’-TTCCAGATCAACG(A)ACAA(G)A(G)TAT(C)TGGTG-3’以上述合成的3’RLM-RACE cDNA为模板，用引物Ply0和试剂盒中的3’RACE Outer引物进行第一次PCR扩增。反应条件为94℃，3分钟；94℃，30秒，55℃，30秒，72℃，1分钟，35个循环；72℃，7分钟。
取1μl第一次PCR扩增产物，用引物Ply0和试剂盒中的3’RACE Inner引物进行第二次PCR扩增。反应条件同上。取10μl PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，低熔点琼脂糖回收约500bp的特异性片段，并克隆至pMDT18载体中(TaKaRa)，进行序列分析。得到柞蚕溶菌酶基因编码区部分序列和全部3’端非编码区序列(见附图1)。
(2)根据所测定的柞蚕溶菌酶基因序列，设计下列两条引物，用于分析柞蚕溶菌酶基因5’端非编码区序列。
Ply5-15’-GACTGTAATATCGTCAGTCA-3’Ply5-25’-CAAGTCACATTGCAATCCTT-3’以合成的5’RLM-RACE cDNA为模板，用引物Ply5-1和试剂盒中的5’RACE Outer引物进行第一次PCR扩增。反应条件为94℃，3分钟；94℃，30秒，55℃，30秒，72℃，1分钟，35个循环；72℃，7分钟。
取1μl上述PCR扩增产物，用引物Ply5-2和试剂盒中的5’RACE Iuter引物进行第二次PCR扩增。反应条件同上。取10μl PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，低熔点琼脂糖回收约300bp的特异性片段，并克隆至pMDT18载体中(TaKaRa)，进行序列分析。得到柞蚕溶菌酶基因部分编码区序列和全部5’端非编码区序列(见附图2)。
测定的柞蚕溶菌酶基因cDNA的全序列为675bp，其中编码区碱基序列为420bp，共编码140个氨基酸，其中前20个氨基酸为信号肽序列，成熟肽部分为120个氨基酸(见附图3)。预测柞蚕溶菌酶成熟肽部分分子量为13,986，等电点为pI8.46。在柞蚕溶菌酶氨基酸序列中，第51位至53位氨基酸的排列是天冬酰胺(N)51-谷氨酸(E)52-丝氨酸(S)53[Asn51-Glu52-Ser53]氨基酸序列，预测是可能的一个糖基化位点，这一序列在人、蛋清和家蚕溶菌酶氨基酸序列中是不存在的。
实施例2柞蚕溶菌酶基因酵母表达载体构建及转化根据柞蚕溶菌酶基因的序列，设计下列两条引物。
Ply-pic25’-GCTCTCGAGAAAAGAAAATGGTTTACCAAATGTGG-3’Ply3’5’-CTCGAATTCTTAACAGTCGCTAATGTCTG-3’通过PCR扩增，得到柞蚕溶菌酶编码区成熟肽段(120个氨基酸)基因片段。用限制性内切酶XhoI和EcoRI酶解这一基因片段，与用同样酶酶解的酵母表达载体pPIC9K相连接(见附图4)。筛选重组质粒。
提取质粒DNA，用Bgl II酶解质粒DNA。用电击法将质粒DNA转化至酵母菌GS115中(如用Sal I酶解质粒DNA，可将质粒DNA转化至酵母菌KM71)，涂布于MD固体培养板中，置30℃中培养2-3天。将长出的菌落转至含有高浓度G418(4mg/ml)的YPD固体培养基上进一步筛选，得到高拷贝的转化菌株。用MM培养基确定这些高拷贝菌株的表型为Muts。将此类酵母菌株接种至混有溶壁微球菌的BMMY固体培养基中，30℃培养一周左右，观察不同菌株对溶壁微球菌的抑菌活性，筛选高活性的柞蚕溶菌酶表达菌株。
实施例3重组柞蚕溶菌酶的纯化含柞蚕溶菌酶基因的酵母菌株先在BMGY液体培养基中，30℃摇瓶培养，250转/分钟。当OD值在9.0左右时，更换培养基，用原培养物1/10体积的BMMY培养基，继续培养。每24小时添加甲醇，保持甲醇浓度在0.5％。100小时后结束培养，收集培养液上清，用于重组柞蚕溶菌酶的纯化制备。
用截流分子量30KD的超滤器，超滤上清液，浓缩液经过CMSepharose-CL 6B离子交换层析柱。用50mM磷酸钠缓冲液(pH7.2)清洗层析柱至检测不到蛋白为止。用50mM磷酸钠缓冲液(pH7.2)/0.5M氯化钠溶液连续洗脱，留取活性峰液。纯化得到的样品用无菌的去离子水透析，然后分装冻干。15％SDS-PAGE蛋白质凝胶电泳鉴定蛋白质。在摇瓶培养条件下，重组柞蚕溶菌酶的表达量约为10mg/L菌液。
实施例4重组柞蚕溶菌酶活性测定溶菌酶活性测定采用浊度法。一般情况下，溶壁微球菌(Micrococcus luteus1.634，购自中国科学院微生物研究所)用50mM，pH6.2的磷酸缓冲液配制一定浊度(A450＝0.6～0.7)作为底物，取0.1mL酶液加入2.5mL底物(20℃)中，在波长450nm处读取反应体系1分钟内的吸光度。以ΔA450/min变化0.001个吸光度值为一个活性单位。
在不同的温度和pH值条件下，对重组柞蚕溶菌酶的活性进行了分析，其最适作用的pH值为5.2，最适的作用温度在26-27℃。纯化的重组柞蚕溶菌酶的比活可达100,000u/mg。
实施例5重组柞蚕溶菌酶糖基化性质分析(1)Schiff试剂染色法纯化的柞蚕溶菌酶，经15％SDS-PAGE凝胶电泳后，置12.5％三氯醋酸(trichloracefic acid)中浸泡30分钟，然后用蒸馏水清洗。再将凝胶浸于1％的过碘酸(periodic acid)溶液中，50分钟。用蒸馏水清洗凝胶五至六次。将凝胶浸在品红-亚硫酸盐染色液中，在暗处染色，至蛋白条带显出红色为止。
(2)Endo H酶解法纯化的重组柞蚕溶菌酶溶解在0.5％SDS/40mM DTT溶液中(2mg/ml)，煮沸10分钟。冷却后，取90μl，加入10μl 0.5M sodium citrate溶液(pH 5.5)和5μl Endo H酶(BioLab，1000u/μl)。37℃，酶解过夜。经15％SDS-PAG凝胶电泳后，考马斯亮蓝染色检验酶解后的重组柞蚕溶菌酶，其分子量变小。
权利要求
1.一种溶菌酶基因序列，其特征在于是柞蚕溶菌酶基因序列，其完整的cDNA序列为aaaatacgtctaacgacatcgacgcaggtgacacgcgtttaaaaATGTTCAAGTATATTGTTTTGTTTGCCGTTTTGGCTCTGTCTTTGCATAATTGCGAGGGGAAATGGTTTACCAAATGTGGGCTAGTGCACGAGCTGAGGAGACAAGGCTTCGACGAGAGCCTAATGCGGGACTGGGTCTGTCTCGTTGAGAACGAAAGCAGCCGTTATACTAATAAAATCGGTAAAGTGAATAAGAATGGCTCACGAGACTACGGCCTCTTCCAGATCAATGACAAATATTGGTGTAGTAAGACCTCCACCCCCGGAAAGGATTGCAATGTGACTTGTAATCAGCTCTTGACTGACGATATTACAGTCGCGGCGACCTGCGCGAAAAAGATTTACAAACGCCATAAGTTTAACGCTTGGTACGGATGGTTAAACCACTGCCAACACTCTCTTCCAGACATTAGCGACTGTTAAgaaaacgcttgtggaagcaaactaagtaaatctcgttatttcatctctgaaaataaaagaagtaatattacaaaagaatgctctcgaaaaacaaaatttaactattatttcgtgtttacattgtgatagatattgttattatttaaacacaaagccttttctacttttttacatatgagaaataaagacttcataacaaaaaa其中大写字母表示柞蚕溶菌酶基因编码区的碱基序列有下划线的部分为柞蚕溶菌酶信号肽碱基序列，黑体大写字母部分为柞蚕溶菌酶成熟肽碱基序列；其余小写字母部分分别为柞蚕溶菌酶基因的5’端和3’端非编码区碱基序列。
2.根据权利要求1所述溶菌酶基因序列，其特征在于其编码的氨基酸序列为M F K Y I V L F A V L A L S L H N C EG K W F T K C G L V H E L R R Q G F DE S L M R D W V C L V E N E S S R Y TN K I G K V N K N G S R D Y G L F Q IN D K Y W C S K T S T P G K D C N V TC N Q L L T D D I T V A A T C A K K IY K R H K F N A W Y G W L N H C Q H SL P D I S D C编码区核酸序列为420bp，编码140个氨基酸，其中前20个氨基酸序列为柞蚕溶菌酶信号肽氨基酸序列，黑体大写字母部分为柞蚕溶菌酶成熟肽氨基酸序列，成熟肽部分为120个氨基酸；预测分子量为13,986，等电点为pI8.46。
3.根据权利要求2所述柞蚕溶菌酶氨基酸序列，其特征在于柞蚕溶菌酶氨基酸序列中含有天冬酰胺(N)51-谷氨酸(E)52-丝氨酸(S)53[Asn51-Glu52-Ser53]氨基酸序列。
4.根据权利要求2所述柞蚕溶菌酶氨基酸序列，其特征在于该序列在酵母菌中表达的过程中，被糖基化修饰。
5.一种柞蚕溶菌酶基因表达产物的制备方法，其特征在于制备工艺为(1)用大肠杆菌诱导柞蚕蛹，2天后，取柞蚕蛹脂肪体，提取总RNA，反转录成cDNA；根据己知不同生物种类的溶菌酶基因的序列，设计简并引物，用RLM-RACE方法分别分析柞蚕溶菌酶基因5’端和3’端非编码区的序列，根据序列分析的结果，设计一对特异性引物，通过PCR扩增得到柞蚕溶菌酶基因编码区片段；进一步分析获得柞蚕溶菌酶基因cDNA的全序列；并推测出编码的氨基酸序列；(2)通过PCR反应及限制性内切酶Xho I和EcoR I酶解获得柞蚕溶菌酶成熟肽部分的120个氨基酸的基因片段，将该片段与用同样酶酶解的酵母表达载体pPIC9K相连接(见附图4)，筛选重组质；提取质粒DNA，用Bgl II酶解质粒DNA；用电击法将质粒DNA转化至酵母菌GS115(如用Sal I酶解质粒DNA，可将质粒DNA转化至酵母菌KM71)中，经过MD培养基和高浓度G418(4mg/ml)筛选，得到高拷贝的转化菌株；用MM培养基确定菌株的表型为Muts；用混有溶壁微球菌的BMMY固体培养基筛选高活性的柞蚕溶菌酶表达菌株；(3)含柞蚕溶菌酶基因的酵母菌株先在BMGY液体培养基中，30℃发酵培养，当OD值在9.0左右时，更换培养基，用原培养物1/10体积的BMMY培养基，继续培养，保持甲醇浓度在0.5％，100小时后结束培养；收集培养液上清，用于重组柞蚕溶菌酶的纯化；用截流分子量30KD的超滤器，超滤上清液，浓缩液经过CM Sepharose-CL 6B离子交换层析柱，连续洗脱留取活性峰液，经透析后分装冻干。
全文摘要
柞蚕溶菌酶基因是用大肠杆菌诱导柞蚕蛹，取柞蚕蛹脂肪体，提取总RNA，反转录成cDNA。根据已知溶菌酶基因的序列，设计简并引物，用RLM－RACE方法分别获得柞蚕溶菌酶基因5’端和3’端非编码区基因片段，并进行序列分析。根据测序结果，设计引物，通过PCR扩增得柞蚕溶菌酶基因编码区片段，并推测出编码的氨基酸序列。柞蚕溶菌酶基因编码区核酸序列为420bp，编码140个氨基酸，其中前20个氨基酸为信号肽序列，成熟肽部分为120个氨基酸；预测分子量为13,986，等电点为pI8.46。120个氨基酸的基因片断经克隆、转化、筛选、培养、分离和层析纯化得到其表达产物。
文档编号C12N9/36GK1873009SQ20051013092
公开日2006年12月6日 申请日期2005年12月8日 优先权日2005年12月8日
发明者范琦, 张波, 王林美, 李树英, 叶博 申请人:辽宁省农业科学院大连生物技术研究所