叶黄素的制备方法

专利名称：叶黄素的制备方法
技术领域：
本发明涉及叶黄素的高效制备方法。
背景技术：
作为类胡萝卜素的一种的叶黄素(例如虾青素、鸡油菌黄质、玉米黄质、金盏花红质(adonirubin)、金盏花黄质(adonixanthin)、隐黄素等)被用于各种用途。例如虾青素，是一种红色的类胡萝卜素，已知具有强的抗氧化作用。因此，可作为食用色素、化妆品、保健食品、药品等使用。虾青素除了化学合成物之外，还可以来源于天然物质。来源于天然物质的虾青素，是从磷虾、甜虾等的虾类、法夫酵母、藻类等中提取的。但是，由于磷虾等的虾类或酵母中的虾青素含量低，所以虾青素不能被高效提取出来。
另一方面，藻类，例如红球藻，为适应外部环境变化而包囊化，从而在藻体内积累了虾青素。因此，开展了利用藻类制备虾青素的研究。
例如J.Fabregas et al.，J.Biotech.Vol.89，p66，(2001)报道了分2阶段培养红球藻来制备虾青素的方法。在该方法中，第1阶段在1天内交换10％-40％的培养液的同时(即，半分批培养)得到红球藻的营养细胞。第2阶段是进一步在15天内、在光照的同时进行分批培养，从而诱发营养细胞的细胞休眠化(即，包囊化)以及虾青素在细胞内的积累。
R.T.Lorenz et al.，TIBTECH，vol.18(April)，p160-167，(2000)报道了用于虾青素的商业生产的红球藻的2阶段培养法。在该方法中，第1阶段在密闭的生物反应器中一边进行光照一边培养红球藻来获得营养细胞。然后，在接下来的第2阶段，将该营养细胞移植到在培养基中缺乏氮和磷的室外培养池中，通过使培养池温度上升的同时增加照射光的强度来进行培养，或通过向室外培养池的培养基中添加氯化钠来进行培养，诱发营养细胞的细胞休眠化(即，包囊化)以及虾青素在细胞内的积累。
在特开2000-60532号公报中记载了一种方法，即第1阶段在密闭的生物反应器内一边进行光照一边培养红球藻来获得营养细胞，然后，在接下来的第2阶段，在室外培养池中使其转变为休眠细胞并诱发虾青素的生成、积累，在红球藻被捕食或寄生于红球藻的生物增殖之前，回收红球藻的方法。
但是，在如上述那样的2阶段的反应中，在第2阶段在水沟式大气开放型培养液等的开放情况或在室外培养池中进行培养的情况下，杂菌在培养基中繁殖的可能性高。因此，必须在短期间内进行包囊化，包囊化细胞的虾青素含量也低。为了提高虾青素的生产率，必须准备大量的营养细胞。
另一方面，在特开2004-129504号公报中，记载了通过在暗处或没有光照下、且需氧条件下培养红球藻，从而生产虾青素的方法，但存在虾青素的生产率低这样的问题。
因此，人们希望一种从藻类高效制备虾青素的方法。

发明内容
本发明提供一种从光合成微藻类制备叶黄素的方法，所述方法包含将含有叶黄素的光合成微藻类接种于培养基中并使其进行增殖的工序；和使该已增殖的微藻类进行包囊化的工序。
作为实施形态之一，上述含有叶黄素的光合成微藻类是已包囊化的光合成微藻类。
作为其他的实施形态，上述增殖工序和包囊化工序在同一培养槽内进行。
另外，作为其他的实施形态，上述微藻类的增殖和包囊化、上述增殖工序和包囊化工序，用低营养培养基进行。
进而，作为其他的实施形态，上述增殖工序和包囊化工序用分批培养进行。
进而，作为不同的实施形态，上述增殖工序和包囊化工序分别用不同的培养基进行。
作为其他的实施形态，上述增殖工序和包囊化工序分别用分批培养进行。
另外，作为实施形态之一，上述增殖工序和包囊化工序在光照下进行。
进而，作为其他的实施形态，上述微藻类是属于红球藻属的绿藻。
另外，作为其他实施的形态，上述绿藻为雨生红球藻进而，作为不同的实施形态，上述叶黄素为虾青素。
另外，本发明提供具有含叶黄素的孢子的光合成微藻类。


图1是接种于培养基中的红球藻的包囊化细胞的显微镜照片。
图2是培养开始第50小时的红球藻细胞的显微镜照片。
图3是培养开始第200小时的红球藻细胞的显微镜照片。
图4是培养开始第350小时的红球藻细胞的显微镜照片。
图5是在本发明的1阶段培养法中，显示藻类增殖以及虾青素含量的随时间变化的示意图。
具体实施例方式
本发明的方法，其特征在于，将含有叶黄素的光合成微藻类，优选已包囊化的光合成微藻类，接种于增殖培养基中使其增殖，然后使其进行包囊化。下面，在本说明书中将光合成微藻类简称为“微藻类”。
将含有叶黄素的微藻类，优选积累了很多叶黄素的、已包囊化的微藻类，接种于增殖培养基中使其增殖时，已包囊化的微藻类放出含有叶黄素的孢子。该孢子以含有叶黄素的状态而成为营养细胞。营养细胞进而以含有叶黄素的状态通过分裂进行增殖。因而，微藻类的数量与单纯通过细胞分裂的情况相比，更块增加。然后，通过将该已增殖(增加)的含有叶黄素的微藻类(营养细胞)进一步进行包囊化，使更多的叶黄素在微藻类内生成、积累。因此，在本发明方法中，在已包囊化的微藻类中，除原本存在的叶黄素之外，还含有新生成的叶黄素，所以与单纯利用微藻类的营养细胞来包囊化的情况相比，叶黄素含量变高。以下，对本发明进行详细说明。
(光合成微藻类)作为本发明中采用的光合成微藻类，只要是能进行光合作用、并且具有能生产叶黄素的能力的藻类，就没有特别限制。从叶黄素的制备方面考虑，优选使用绿藻类。
作为在本发明中使用的绿藻类，优选使用例如，属于红球藻属(Haematococcus)的单细胞藻类。作为优选的红球藻属的藻类，可列举出，雨生红球藻(H.pluvialis)、H.lacustris、H.capensis、H.droebakensi、H.zimbabwiensis等。作为雨生红球藻(H.pluvialis)，可列举出保存在独立行政法人国立环境研究所的NIES144株，保存在美国德克萨斯大学藻类保存机构的UTEX2505株、保存在丹麦哥本哈根大学斯堪的纳维亚文化中心藻类和原生动物植物研究所(Scandinavian Culture Center for Algaeand Protozoa，Botanical Institute)的K0084株等。
作为H.lacustris，可列举保存在ATCC的ATCC30402株及30453株，保存在东京大学应用微生物研究所的IAM C-392株、C-393株、C-394株以及C-339株，或UTEX 16株及294株等。
作为H.capensis，可列举UTEX LB1023株等。
作为H.droebakensi，可列举UTEX 55株。
作为H.zimbabwiensis，可列举UTEX LB1758株等。
在这其中，优选使用雨生红球藻。
(包囊化)在本发明中，将作为上述微藻类的、含叶黄素的微藻类，接种于培养基中。含叶黄素的微藻类，包含含叶黄素的营养细胞和进行了包囊化的微藻类。含叶黄素的微藻类的营养细胞是是指其微藻类已进行了包囊化(处于休眠状态)。
微藻类受到例如光照、营养饥饿状态、氧化物的存在等的来自生存环境的应激反应，在细胞内积累了叶黄素等，并进行休眠孢子化。进入这种休眠状态被称为包囊化。在本说明书中，包囊化包含从进入休眠状态并开始积累叶黄素的状态开始，直到成为完全包囊化的休眠孢子为止的任一状态。从提高叶黄素含量的观点出发，优选使用尽可能进行包囊化、并累积了较多叶黄素的微藻类。
(培养基)作为用于培养微藻类的培养基，并没有特别限制。一般使用含有在增殖中必需的氮、微量金属的无机盐(例如磷、钾、镁、铁等)、维生素类(例如，维生素B1等)等的培养基。例如VT培养基、C培养基、MC培养基、MBM培养基、MDM培养基等的培养基(以上参照藻类研究法 千原光雄·西泽一俊编写，共立出版(1979))、OHM培养基(参照非专利文献1)、BG-11培养基以及它们的改良培养基等。
这些培养基是以增殖为目的的培养基、以包囊化为目的培养基等，可根据用途来使用。以微藻类的增殖为目的的情况，使用可成为氮源的成分较多的培养基(富营养培养基含有大于等于0.15g/L氮的培养基)。以包囊化为目的的情况，使用几乎不含可成为氮源的成分的培养基(包囊化培养基氮含量小于0.02g/L)。或者也可以使用含上述中间浓度的氮源的培养基(低营养培养基氮含量0.02g/L～不足0.15g/L)。
培养基中的氮源浓度、磷浓度等，可根据接种的微藻类的数量来决定。例如，培养开始时的微藻类(红球藻)的浓度为105数量级的情况，如果使用低营养培养基，则达到一定程度为止微藻类进行增殖，但由于氮源的量少，所以增殖很快停止。这样的情况下，如后面所述的那样，低营养培养基是适用于用1阶段(分批地)连续进行增殖和包囊化的情况的培养基。进而，通过调整N/P比(摩尔比)为10～30，优选为15～20，可以顺利地诱导包囊化。
在培养开始时的微藻类浓度更高的情况下，可使用上述富营养培养基来进行上述培养。
这样，培养基的组成可考虑各种条件来决定。
另外，在本发明使用的培养基中，由于几乎不含醋酸、葡萄糖等的有机碳源，即使长时间培养，也几乎不会混入杂菌。
(培养装置)微藻类的培养装置，只要是可供给二氧化碳、并且能够对培养液进行光照的装置，就没有特别限制。例如小规模情况下，采用扁平培养瓶，大规模的情况下，可采用由玻璃制、塑料制等的透明板构成的平板培养槽、装备了照明器的带有搅拌器的箱型培养槽、管型培养槽、圆顶气室型培养槽、中空圆筒型培养槽等。另外，优选使用密闭容器。
(培养条件)培养条件没有特别限制，一般可以使用在微藻类培养中使用的温度和pH。微藻类的培养在例如15～35℃在进行，优选在20～25℃下进行。培养中的pH，优选保持在6～8。二氧化碳的供给，是将含有1～3v/v％浓度的二氧化碳气体，例如以达到0.2-2vvm的方式吹入。使用平板培养槽的情况，通过这些二氧化碳的供给，搅拌培养液并对微藻类进行均匀地光照。
(光照)在微藻类的培养中，通常以光合作用有效光量子束密度(PPFD)达到100μmol-photon/m2s(以下，将单位简略为μmol-p/m2s)的程度进行光照。但是，从增加叶黄素产量的观点出发，优选为大于等于300μmol-p/m2s，更优选为大于等于500μmol-p/m2s。通过用这样的PPFD值高的光对从培养开始直至包囊化为止的培养全过程进行照射，虾青素的产量会增大。另外，PPFD是使用LICOR-190SA平面光量子传感器(LICOR Inc.，Lincoln，USA)测定的光量子束密度，是在没有装入培养基的培养装置的中央部分设置传感器，进行光的照射所测定的值。在由玻璃、丙烯酸树脂等的透明板构成的培养装置的情况下，测定通过透明板的PPFD，可以决定光的照度或光源的距离、配置光源，从而达到规定的PPFD。
(培养方法)将上述培养基、培养装置、培养条件等进行适当选择、组合，在光照下进行培养。培养方法有两种，一种是1阶段培养法，即将已包囊化的微藻类接种于营养培养基内使其增殖、直至使其包囊化为止在同一个培养基内连续进行。另外一种方法是2阶段培养法，使已包囊化的微藻类增殖的培养基与包囊化培养基分离，分别进行增殖和包囊化的方法。
1阶段培养法是从接种已包囊化的微藻类开始到培养结束为止的期间，不更换培养基、连续进行培养的方法。即，在规定的培养基中、在同一培养槽内，进行微藻类的增殖和包囊化的方法。该1阶段培养法，不适合连续培养，优选分批进行。在该1阶段培养法中，微藻类一旦增殖，受到因培养基中的营养成分的消耗而造成的营养饥饿应激反应、因光照产生的应激反应、因高温产生的温度应激反应、因添加氯化钠带来的应激反应等，在增殖后会顺利地转变为包囊化状态。
如果将含有叶黄素的微藻类，优选为已包囊化的微藻类接种于营养培养基内，则会放出2n个(n＝1～4)含有叶黄素的孢子。由于这些孢子以含有叶黄素的状态变成营养细胞，因此含有叶黄素的营养细胞的数量增加(微藻类进行增殖)。进而，营养细胞通过细胞分裂进行增殖。通过将该含有叶黄素的营养细胞进行包囊化，在原本具有的叶黄素之外，积累了新生成的叶黄素，从而提高了叶黄素含量。
但是，考虑营养细胞持续增殖时，细胞内的叶黄素浓度会下降，所以优选在细胞内还残存叶黄素的状态下停止增殖。
在营养细胞增殖到一定程度的时间点，为了使微藻类的增殖停止，优选设计以使培养基成为营养饥饿状态。因此，在1阶段培养法中，作为培养基，优选使用氮源浓度低的培养基，例如上述低营养培养基。接种的包囊化细胞的数量较多时，如上述的那样，可以使用氮源浓度高的培养基，例如上述富营养培养基。
另外，在使用低营养培养基微藻类生长不充分的情况，也可以追加富营养培养基或低营养培养基，直到达到希望的浓度以使微藻类进行增殖。
另外，当使用低营养培养基时，如果调整N/P比(摩尔比)在10～30之间，则增殖后可顺利进行包囊化。
1阶段培养法具有以下优点，生产工序的管理简便，容易得到含有高浓度叶黄素的微藻类，由于不必转换到另外的培养槽，可防止杂菌的混入，只使用一个培养槽就可完成等。
2阶段培养法是使已包囊化的微藻类增殖，接着将其转移至包囊化培养基中进行包囊化的方法。即，2阶段培养法包括首先将包囊化的微藻类接种于富营养培养基或低营养培养基中，优选接种于富营养培养基中，使微藻类进行增殖的第一工序和回收该微藻类，再转移到几乎不含氮源的包囊化培养基中进行包囊化的第二工序。
在第一工序中，因为必须在营养细胞中残存有叶黄素的期间终止微藻类的增殖，所以在营养培养基中的培养在短时间内进行。如果在培养开始时使用富营养培养基进行培养，则营养细胞的增殖速度比用低营养培养基进行培养时的增殖速度快，因此优选使用富营养培养。增殖结束后，回收微藻类，再转移到包囊化培养基进行第二工序的包囊化。
上述第一工序和第二工序，可以分别使用不同的培养槽进行分批培养。也可以是在第一工序终止后，将已增殖的微藻类洗涤、回收，放回同一培养槽中进行第二工序。
通过该2阶段培养法，可得到叶黄素含量高的微细胞。该2阶段培养法与1阶段培养法相比，具有增殖工序在短时间内完成的优点，但是在中途必须进行将增殖的微藻类转移的操作。
将所得微藻类的一部分回收叶黄素，残余的一部分可用于再次接种在营养培养基中。
(叶黄素的回收)通过微藻类的包囊化，叶黄素在微藻类内积累，所以藻类回收后，可用常规方法回收叶黄素。例如，适合使用机械方式破坏微藻类后，通过有机溶剂进行提取等的方法。
(实施例)下面，列举实施例对本发明进行说明。但本发明不限于这些实施例。
另外，在这些实施例中，对叶绿素、叶黄素以及干燥藻体进行测定，其测定方法如下所述。
(叶绿素的测定)取5ml培养液，进行离心分离(3500rpm、5分钟)，回收微藻类。将微藻类进行涡旋分散，加入5ml二甲基亚砜(DMSO)并进行分散，遮光静置30分钟。其后，在70℃的恒温槽中进行10分钟加热处理，通过离心分离回收DMSO部分。在沉淀部分着色的情况下，进一步添加5ml的DMSO，重复进行上述操作。重复进行该操作直到细胞的颜色变为白色为止。将回收的DMSO部分合并，使用分光光度计(日立分光光度计U-3210)测定672nm处的吸光度。通过以下公式求出叶绿素浓度。
叶绿素浓度(μg/ml)＝13.9×稀释倍数×吸光度(叶黄素的测定)取5ml培养液，进行离心分离(3500rpm、5分钟)，回收微藻类。将微藻类进行涡旋分散，加入5ml含5质量％KOH的30(v/v)％的甲醇水溶液，将绿藻进行涡旋分散，在70℃恒温槽中进行10分钟处理。通过这样处理，使叶绿素分解。再次进行离心分离(3500rpm、5分钟)，回收沉淀。涡旋后，用酸(例如醋酸)中和残留的碱。中和后，加入5ml DMSO，遮光静置20分钟，进一步在70℃处理10分钟。通过离心分离(3500rpm、5分钟)，回收上清液。在沉淀部分着色的情况下，进一步添加5ml DMSO，重复上述操作。重复进行该操作直到细胞的颜色变为白色为止。将回收的DMSO部分合并，测定492nm处的吸光度。通过以下公式计算叶黄素浓度。
叶绿素浓度(μg/ml)＝4.5×稀释倍数×吸光度另外，以下实施例中使用的雨生红球藻所产生的叶黄素，大部分为虾青素，上述叶黄素的测定方法也适用于虾青素的测定。
(微藻类的干燥质量)取规定量的培养液，在GC50玻璃纤维滤纸(TOYO·ADVANTEC制)上进行吸滤，为了溶解无机盐类，用5ml pH4的盐酸水溶液洗涤2次。其后，将每张滤纸用105℃的恒温干燥机干燥3小时，在真空干燥器中干燥1小时，冷却至室温，测量干燥质量。另外，将GC50玻璃纤维滤纸预先用上述恒温干燥机在105℃下干燥1小时，测定了其质量。
(实施例1)(前培养获得用于增殖的包囊化细胞)使用产生作为叶黄素中的一种的虾青素的雨生红球藻K0084株(以下简称K0084株)。在1.5L、光径为25mm的密闭式扁平培养瓶中，装入1L的下表1所示的MBG-11培养基，以初始浓度为0.6g/L来接种K0084株。另外，MBG-11培养基的N/P比为20。
表1

以600ml/分钟的速度(即，0.6vvm)通入含3容积％CO2的气体，同时在培养温度25℃、pH6～8之间进行调整，在以下所示光照条件下培养5天。
使用作为光源的白色荧光灯(Nationgnal制、FL40SSW/37)进行光照。调整光照的强度，使光照的强度在使用LICOR-190SA平面光量子传感器测定的培养槽受光方向的PPFD为100μmol-p/m2s。
培养后的K0084株，由绿色变为茶色乃至棕色时，确认发生了包囊化。这些包囊化的K0084株，含有每单位干燥质量1.2％的虾青素。用该方法得到的接种于营养培养基时所用的包囊化细胞的显微镜照片示于图1。
(正式培养包囊化细胞的增殖和增殖细胞的包囊化)使用与上述同样的扁平培养瓶，在相同培养基(MBG-11培养基)中，以初始浓度为0.6g/L来接种已包囊化的K0084株，在与上述相同的培养条件下培养。
参照图1-4及图5说明培养过程。培养开始时的K0084株，如图1所示那样呈褐色，如上述那样虾青素的含量约为1.2％。培养开始后，如图5(c)及(d)所示的那样，一旦虾青素的含有率(每单位干燥藻体的虾青素含量)降低，则叶绿素的含有率(每单位干燥藻体的叶绿素含量)上升。因此，从大约第50小时开始，这种情况发生逆转。即第50小时以后，虾青素的含量变为上升，叶绿素的含量变为减少。认为第50小时是停止增殖、转为包囊化的时期。
第50小时的细胞的显微镜照片示于图2。如图2显示的那样，已包囊化的红球藻细胞含带有红色的孢子。还发现该孢子被放出并转化为营养细胞。即，发现在由孢子产生的细胞的细胞壁内侧有被认为是叶绿素积累的绿色的层。
进一步继续培养时，虾青素含有率缓慢上升，叶绿素减少。从培养开始的第200小时的细胞的显微镜照片如图3所示，第350小时的显微镜照片如图4所示。经过200小时的图3的细胞，在细胞的尺寸增大的同时，发现在细胞内侧形成的绿层(叶绿素层)的更内侧积累了褐色的虾青素。在第350小时，细胞体积进一步增大，发现细胞壁的内侧被红色内容物占据。这些过程与图5(A)所示的细胞浓度随着时间增加、图5(B)所示的虾青素浓度随着时间增加非常一致。第350小时的培养结果示于表2。
(比较例1)除了将K0084株的没有发生包囊化的营养细胞接种于MBG-11培养基以外，其余均与实施例1同样培养350小时。结果如表2所示。
表2

如表2所示的那样，发现与将营养细胞进行接种并使其增殖的情况相比，通过将已包囊化的微藻类(红球藻)接种并使其增殖、再进行包囊化，虾青素的浓度及含量变高。
(实施例2)对于使已包囊化的微藻类在营养培养基中增殖、然后转移到包囊化培养基的2阶段培养进行研究。
配制如下面表3所示的培养基。表3所示的BG-11培养基，是替代在实施例1的第1阶段培养时使用的MBG-11培养基的0.41g硝酸钾(KNO3)，而含1.5g/L硝酸钠的富营养培养基。另一方面，NBG-11培养基是不含硝酸钠或硝酸钾这样的氮源、另外也不含磷的包囊化培养基。
表3

使用与实施例1相同条件进行培养，回收已包囊化的K0084株，洗涤，以初始浓度为0.6g/L接种于表3所示的1L的BG-11培养基中，调整光照的强度使PPFD达到300μmol-p/m2s，除此以外，在与实施例1相同的培养条件下开始培养。120小时(5天)后回收K0084株，接种于NBG-11培养基(包囊化培养基)中，用相同的扁平培养瓶、在相同的培养条件下继续培养。培养400小时后的结果示于表4。
(实施例3)另一方面，使用作为培养基的MBG-11，调整光照的条件使PPFD达到300μmol-p/m2s，除此以外，在与实施例1同样的培养条件下，将包囊化细胞接种来进行1阶段培养。培养400小时后的结果示于表4。
(比较例2)除了将营养细胞接种于BG-11培养基中以外，与实施例2同样操作，进行2阶段培养。培养400小时后的结果如表4所示。
表4

*1)每单位干燥藻体的叶黄素含量该结果显示，通过使已包囊化的微藻类或含有虾青素的微藻类增殖、进行包囊化，可以获得虾青素含量高的微藻类。而且，结果显示1阶段培养法和2阶段培养法的任一种方法，作为得到虾青素含量高的微藻类的方法都是有用的。
工业可利用性本发明通过将含有叶黄素的微藻类，例如已包囊化的微藻类，进行接种、使其增殖，再使其包囊化，可得到含有高浓度叶黄素的、包囊化的微藻类。另外，所得包囊化的微藻类的一部分可用于下次的培养。因此，作为利用微藻类高效地培养制备叶黄素的方法，在产业上是有用的。
权利要求
1.一种从光合成微藻类制备叶黄素的方法，所述方法包含将含有叶黄素的光合成微藻类接种于营养培养基中使其增殖的工序；和使该已增殖的微藻类进行包囊化的工序。
2.如权利要求1所述的方法，上述含有叶黄素的光合成微藻类是已包囊化的光合成微藻类。
3.如权利要求1或2所述的方法，上述增殖工序和包囊化工序是在同一培养槽内进行。
4.如权利要求1～3的任一项所述的方法，上述增殖工序和包囊化工序是用低营养培养基进行的。
5.如权利要求1～4的任一项所述的方法，上述增殖工序和包囊化工序是用分批培养进行的。
6.如权利要求1或2的任一项所述的方法，上述增殖工序和包囊化工序是分别用不同的培养基进行的。
7.如权利要求6所述的方法，上述增殖工序和包囊化工序是分别用分批培养进行的。
8.如权利要求1～7的任一项所述的方法，上述增殖工序和包囊化工序是在光照下进行的。
9.如权利要求1～8的任一项所述的方法，上述微藻类是属于红球藻属的绿藻。
10.如权利要求1～9的任一项所述的方法，上述绿藻为雨生红球藻。
11.如权利要求1～10的任一项所述的方法，上述叶黄素为虾青素。
12.一种光合成微藻类，含有含叶黄素的孢子。
全文摘要
本发明提供一种从光合成微藻类制备叶黄素的方法，所述方法包含将含有叶黄素的光合成微藻类，优选已包囊化的微藻类，接种于营养培养基中使其增殖的工序，和将该已增殖的微藻类进行包囊化的工序。本方法适合使用1阶段培养法或2阶段培养法，所述1阶段培养法是用氮源浓度低的营养培养基连续进行增殖的工序以及包囊化的工序的方法，所述2阶段培养法是利用氮源浓度高的营养培养基进行增殖，然后移植到包囊化培养基中的方法。
文档编号C12N1/20GK1878872SQ20058000121
公开日2006年12月13日 申请日期2005年4月22日 优先权日2004年5月26日
发明者張凯 申请人:雅马哈发动机株式会社