专利名称：单个颗粒的冷冻乳酸菌培养物的制作方法
技术领域：
本发明涉及市售相关包装的颗粒状冷冻乳酸菌(LAB)培养物，该包装具有至少重50g的冷冻物质，其中所述冷冻物质以单个颗粒的形式存在，特征在于，当贮藏在低于培养物起始融解温度(Tm’)如-46℃下7-14天时，所述冷冻培养物的单个颗粒并不粘在一起，因此基本上保持为单个颗粒。
背景技术：
微生物涉及包括大多数乳制品在内的食品及饲料产品的制造。细菌培养物，特别是一般分类为乳酸菌的细菌培养物是制造所有发酵乳制品、干酪和黄油所必不可少的。这样的细菌培养物可称为起子培养物，它们通过执行许多功能以赋予各种乳制品之独特性质。
乳制品起子培养物一般由乳酸菌组成。在本发明上下文中，措辞“乳酸菌”(LAB)指一组革兰氏阳性的、过氧化氢酶阴性的、非运动性的、不形成孢子的、微需氧的或厌氧的细菌，其发酵糖产生有机酸，包括作为主要产物的乳酸、甲酸和丙酸。在本发明上下文中乳酸菌包括厚壁菌(Firmicutes)门中的许多细菌属。肉杆菌属(Carnobacterium)、肠球菌属(Enterococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、乳球形菌属(Lactosphaera)、明串珠菌属(Leuconostoc)、蜜蜂球菌属(Melissococcus)、酒球菌属(Oenococcus)、片球菌属(Pediococcus)、链球菌属(Streptococcus)、四联球菌属(Tetragenococcus)、漫游球菌属(Vagococcus)和魏斯氏菌属(Weissella)被认为是LAB。同样，属于放线菌(Actinobacteria)门产乳酸的革兰氏阳性菌，例如气球菌属(Aerococcus)、细杆菌属(Microbacterium)和丙酸菌属(Propionibacterium)以及双歧杆菌属(Bifidobacterium)在本发明上下文中也被认为是LAB。工业上最有用的乳酸菌存在于乳球菌(Lactococcusspp.)、链球菌(Streptococcus spp.)、肠球菌(Enterococcus spp.)、乳杆菌(Lactobacillus spp.)、明串珠菌(Leuconostoc spp.)、双歧杆菌(Bifdobacteriumspp.)和片球菌(Pediococcus spp.)中。除用于乳品加工业之外，乳酸菌培养物也可广泛用于肉类加工业及许多其它加工业。
市售起子培养物可作为冷冻培养物来经销。高浓缩冷冻培养物在市场上十分受欢迎，因为这样的培养物能直接接种到发酵培养基(如乳品或肉类)中，无需居间转移。换句话说，这样的高浓缩冷冻培养物所包含的细菌量足够最终用户制造生产用起子培养物所需。在此“生产用起子”定义为在食品加工厂用于发酵培养基接种的繁殖用起子培养物。高浓缩培养物可称为槽内直接凝固(direct vat set)(DVS)-培养物。为了在最终用户处包含足够量用作为DVS-培养物的细菌，浓缩的冷冻培养物一般至少重50g，并且含有至少109个菌落形成单位(CFU)/克的活细菌。
在使用冷冻培养物实践中，关键在于要方便培养物的实际操作。虽然培养物“整体”冷冻难以操作，但是对于生产者和消费者来说，已发现培养物颗粒冷冻是十分容易操作的。
因此，高浓缩颗粒冷冻培养物，即已成形的所谓冷冻的槽内直接凝固(F-DVS)-培养物十分畅销。
出现了许多与冷冻培养物活性有关的出版物。
Chavarri等.(1988)描述了冷冻的纯乳酸链球菌(Streptococcus lactis)培养物的活性可通过添加5％乳糖或5％蔗糖而得到改善。
Cárcoba等.(2000)描述了冷冻的纯乳酸乳球菌乳亚种(Lactococcuslactis subsp.lactis)培养物的活性可通过添加不同的低温防护剂例如糖类(乳糖、蔗糖和海藻糖)、谷氨酸和明胶而得到改善。
US 4.140.800(Kline)描述了冻干培养物的活性可通过添加不同的低温保护剂而得到改善。也讨论了添加了乳糖、蔗糖或麦芽糖的冷冻培养物的活性。
WO 00/39281(Kringelum等.)描述了非冷冻的液体起子培养物的活性可通过添加不同的低温保护剂而得到改善，以及WO 2004/065584 A1(Bisgaard-Frantzen)描述了高浓缩冷冻起子培养物的活性可通过添加不同的低温保护剂而得到改善。
只有WO 2004/065584A1描述了颗粒状冷冻培养物，其它上述出版物则没有涉及贮藏过程中颗粒状冷冻培养物的物理稳定性。
发明概要市售颗粒状冷冻乳酸菌(LAB)培养物通常以合适的包装(如2L四角纸盒)提供。一般贮藏在约-46℃的贮藏温度下，冷冻物质以相对小重量的单个颗粒形式存在。
在本发明之前，本发明人认为就贮藏上述市售相关颗粒状冷冻乳酸菌(LAB)培养物来说，并不存在明显的困难。
然而，基于不同的研究，本发明人确定当许多市售相关培养物在约-46℃下贮藏7天或更久时，单个颗粒粘在一起并形成较大的凝块。在工业生产中，调节颗粒凝块造成了处理上的困难。比如当培养物凝结成块时，显然从培养物包装中就很难给予适当的用量。甚至还很难以便利的方法将凝结成块的培养物从包装中取出。
进一步的研究确定“出问题的”培养物的特征可能在于颗粒状冷冻乳酸菌(LAB)培养物的Tm’值(冰开始融解，如Roos(1995)所定义的)低于约-46℃的贮藏温度。该Tm’值是食品工业及其它工业所使用的标准物理化学术语。Tm’通常用Roos(1991)描述的差示扫描量热法(DSC)技术测定。其与食品(在此为冷冻LAB培养物)开始融解的温度有关。有关详情请见作为参考文献的教科书“Food Chemistry”Fennema(1996)和“PhaseTransition in Foods”Roos(1995)。
不受理论所限，相信当冷冻培养物具有低于其贮藏温度如约-46℃的Tm’值时，出现初相转变(融解)，造成了单个颗粒粘在一起并形成较大的凝块。
总之，本发明人的工作已确定了迄今尚未认识到的贮藏问题，这些问题与某些类型市售相关高浓缩颗粒状冷冻乳酸菌培养物的物理性质相关。一旦确定了此问题，本发明人就能开始尝试解决该问题。
不依赖于任何可能的理论解释，本发明人确定通过添加某些相关的添加剂化合物到出问题的颗粒状冷冻培养物中，就能获得在-46℃下贮藏7-14天后不会形成单个颗粒凝块的颗粒状冷冻培养物。这样的培养物特征在于，冷冻培养物的单个颗粒并不粘在一起，因此基本上保持为单个颗粒，甚至在约-46℃下长期贮藏后亦然。
大体说来，相关的添加剂化合物特征在于，它们能增加冷冻培养物Tm’值至高于贮藏温度如-46℃的值，例如将-70至-46℃的Tm’值增加到-45至-15℃。
在此指导性的例子描述的是合适的添加剂化合物的优选例子。所述化合物包括海藻糖、麦芽糖糊精、环糊精、喷胶(spray gum)、鱼胶粉和麦芽糖醇。基于本领域技术人员的常识，完全能确定其它能增加冷冻培养物Tm’值至高于贮藏温度如-46℃的值的相关添加剂化合物。
如上所述，为了包含足够的细菌，市售相关高浓缩冷冻培养物一般重至少50g且活细菌量至少为109个菌落形成单位(CRU)/克。Chavarri(1988)和Carcoba(2000)文章中所描述的培养物并不涉及颗粒状冷冻培养物的物理稳定性，而且在其上下文中市售相关高浓缩冷冻培养物并不考虑冷冻细菌的活性，因为它们量很少且包含的是克数明显较小的冷冻培养物，此外所述培养物也不是颗粒状冷冻的培养物。同样，Chavarri(1988)和Carcoba(2000)所描述的培养物根本就不涉及颗粒状冷冻培养物的物理稳定性，反而涉及的是冷冻细菌的活性。
因此，本发明第一方面涉及市售相关包装的颗粒状冷冻乳酸菌(LAB)培养物，该包装具有至少重50g的冷冻物质，其中冷冻物质以单个颗粒的形式存在，含有至少109个菌落形成单位(CFU)/克冷冻物质的活细菌，并包含占冷冻物质0.5％-13％w/w量的添加剂化合物。
所述添加剂化合物选自一化学物组，其通过使用占冷冻物质10％w/w量的添加剂化合物能增加冷冻乳酸菌(LAB)培养物的Tm’(冰融解开始温度)，所含有的添加剂化合物能将Tm’值从-70℃至-46℃增加到-45至-15℃(通过DSC测定)。
此外，所述冷冻乳酸菌(LAB)培养物特征在于，当贮藏在约-46℃下7-14天时，该冷冻培养物的单个颗粒并不粘在一起，因此基本上保持为单个颗粒，在此是通过下列测试来测定的冷冻培养物的单个颗粒在液氮中颗粒状冷冻，将100个单个颗粒(约5-100g的颗粒)倒入培养皿中，从而形成了松散的、单个颗粒的薄层，该薄层特征在于，大多数颗粒与其相邻的一个或多个颗粒直接接触，在约-46℃下放置7-14天并检查颗粒是否仍然松散或颗粒是否凝结成块或粘在一起，其中对于冷冻培养物的单个颗粒基本上保持为单个颗粒的判断标准是至少100个单个颗粒中的80个保持为松散的单个颗粒。
然而，包含能利用蔗糖的LAB的冷冻乳酸菌(LAB)培养物，且其中所包含的低温保护剂化合物选自占冷冻物质2％-13％w/w量的蔗糖；和占冷冻物质4％-6％w/w量的海藻糖；以及占冷冻物质12％-14％w/w量的海藻糖/蔗糖混合物的培养物，均明确地从本发明第一方面中排除。
在第一方面结尾处所描述的“放弃”涉及PCT申请WO 2004/065584A1。该申请是在2004年1月19日提交的。在本申请优先权提交之时，PCT申请WO 2004/065584A1尚未公开。
WO 2004/065584A1涉及在冷冻培养物贮藏过程中改善其活性。其没有描述本发明的“颗粒粘性”问题。大体上，主权利要求1涉及“包含能利用蔗糖的LAB的冷冻乳酸菌(LAB)培养物，具有至少重50g的冷冻物质并含有至少109个菌落形成单位(CFU)/克冷冻物质的活细菌，其特征在于，所述冷冻培养物包含占冷冻物质0.5％-80％w/w量的低温保护剂。”虽然WO 2004/065584A1中描述了具有低温保护剂的颗粒状冷冻的培养物，但是可将本领域技术人员不可避免地得到的落入WO 2004/065584A1范围的结果排除在外，因为WO 2004/065584A1仅明确要求保护能利用蔗糖的培养物。
关于本发明的冷冻培养物，所述添加剂化合物应当优选在它们冻结之前能添加到活细菌中。
因此，本发明第二方面涉及制造在此描述的本发明第一方面和实施方案的颗粒状冷冻乳酸菌(LAB)培养物的方法，包括如下步骤(i)添加添加剂化合物到活细菌中以使至少50g的物质含有至少109个菌落形成单位(CFU)/克物质的活细菌，所添加的添加剂化合物占所述物质的0.5％-13％w/w量，(ii)冷冻所述物质以获得颗粒状冷冻的物质，和(iii)以合适的方式包装所述冷冻物质以获得包装的在此描述的本发明第一方面和实施方案的颗粒状冷冻乳酸菌(LAB)培养物。
本发明第三方面涉及通过本发明第二方面的制造颗粒状冷冻乳酸菌(LAB)培养物的方法获得的颗粒状冷冻乳酸菌(LAB)培养物。
本发明第四方面涉及上述颗粒状冷冻乳酸菌(LAB)培养物在制造食品或饲料产品方法中的应用。
定义在详细讨论本发明具体实施方案之前，提供了与本发明主要方面相关的特定术语定义。
术语“能利用蔗糖的LAB”指能发酵蔗糖产生酸的LAB。其与PCT申请号WO 2004/065584A1中的定义相同。
术语培养“物质”指培养相关物质，包括活细菌和低温保护剂。并不包括可能存在的包装。因此，培养物的物质重量不包括可能存在的包装的重量。
术语“包装(packing)”或“包装(package)”应作广义理解。其指颗粒状冷冻乳酸菌(LAB)培养物应当包装以便提供给用户，其可包装在瓶、四角纸盒容器等中。
术语“添加剂化合物”在本发明上下文中可以是一种特定的添加剂化合物或可以是两种或更多种不同的添加剂化合物。因此，培养物中添加剂化合物的w/w％应当理解为添加剂化合物量之和。优选地，该术语涉及发酵后添加到培养物中的化合物。因此，其可以是不以显著量存在于培养物发酵液自身中的化合物。
术语“颗粒状冷冻的”和“颗粒状冷冻培养物”指通过利用能产生冷冻培养物颗粒或微粒的方法冻结的培养物。颗粒状冷冻培养物可方便地通过将培养物逐滴地添加到液氮中形成冻结的培养物颗粒而制得。一般地，但不是必要的，该处理在常用的工业冻干装置塔盘上进行。
术语“颗粒(pellets)”或“微粒(granula)”指通过冷冻液体形成的小固体，平均尺寸为0.1-10mm。
本发明的实施方案描述如下，仅作为举例。
图1从该图中可见冰融解开始发生的温度Tm’与添加的二糖量之间的相关性。有关详情见实施例3。打点线表示为贮藏温度，-46℃。
图2许多培养物冰融解开始的温度(Tm’)(Y-轴)作为麦芽糖糊精(Glucidex 12)浓度(％w/w)(X-轴)的函数。培养物名称后跟随“A”表示已将甘油添加到培养物中，跟随B表示在颗粒冻结前没有将甘油添加到培养物中。
发明详述Tm’值如上所述，Tm’值是已知的标准物理化学术语，描述的是冰融解开始发生时的温度。在本发明上下文中，Tm’指冷冻LAB培养物开始发生融解时的温度。
优选地，通过利用DSC方法测定Tm’值，该方法描述于本文实施例1中名为“Tm的测定”的段落。
颗粒凝结测试根据本发明第一方面的解释，该测试要分析的是颗粒状冷冻乳酸菌(LAB)培养物是否这样的培养物，即该培养物特征在于当贮藏在约-46℃下(在当前情况下预调至-50℃的冷冻机具有-46℃的样品温度)7-14天时，在测试中冷冻培养物的单个颗粒并不粘在一起，因此基本上保持为单个颗粒，包括如下冷冻培养物的单个颗粒在液氮中颗粒状冷冻，将100个单个颗粒(约5-100g的颗粒)倒入培养皿中，从而形成了松散的、单个颗粒的薄层，该薄层特征在于，大多数颗粒与其相邻的一个或多个颗粒直接接触，在约-46℃下放置7-14天并检查颗粒是否仍然松散或颗粒是否凝结成块或粘在一起，其中对于冷冻培养物的单个颗粒基本上保持为单个颗粒的判断标准是至少100个单个颗粒中的80个保持为松散的单个颗粒。优选至少100个单个颗粒中的90个保持为松散的单个颗粒，更优选至少100个单个颗粒中的95个保持为松散的单个颗粒。
可目测检查并计数保持为松散单个颗粒的单个颗粒。以一贯的方法进行目测是落在本领域技术人员能力范围之内的，所得到的结果在正常的技术偏差限度内应当是一致且可重复的。本文的实施例1提供了更多的技术细节。
颗粒状冷冻乳酸菌(LAB)培养物优选地，术语“冷冻乳酸菌(LAB)培养物”在此指不包含所添加的添加剂化合物的培养物，如在此描述的具有-70至-46℃的Tm’值的培养物。该培养物可以颗粒或微粒的形式冻结，形成“颗粒状冷冻乳酸菌(LAB)培养物”。颗粒状冷冻乳酸菌(LAB)培养物可通过将培养物逐滴添加到液氮中形成冻结的培养物颗粒或微粒而方便地制得。
培养物的LAB可以是任意的LAB，特别是根据国际IDF标准146A1998“Identification of Characteristic Microorganisms”使用适当的API检测试剂盒(bioMérieux SA，Lyon，France)测定的不利用蔗糖的市售相关LAB。对于大多数LAB属使用API试剂盒“rapid ID 32STREP”和“50CHLMedium”确定蔗糖利用情况。
优选地，LAB是选自双歧杆菌(Bifdobacterium spp.)、短杆菌(Brevibacterium spp.)、丙酸杆菌(Propionibacterium spp.)、乳球菌(Lactococcus spp.)包括乳酸乳球菌乳亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)和乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcus lactis subsp.cremoris)、乳杆菌(Lactobacillus spp.)包括嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、链球菌(Streptococcus spp.)、肠球菌(Enterococcus spp.)、片球菌(Pediococcus spp.)、明串珠菌(Leuconostoc spp.)、酒球菌(Oenococcus spp.)和真菌包括青霉菌(Pencillium spp.)、隐球菌(Cryptococcus spp.)、Debraryomyces spp.、Klyveromyces spp.和酵母菌(Saccharomyces spp.)所组成的组。
即使这些属中某些种被描述为能利用蔗糖突变体，但其不能利用蔗糖已分离或能持续地得到分离。无论这样的突变体是否分离或获得，它们依然是本发明的一方面。
工业上最有用的乳酸菌存在于乳球菌(Lactococcus spp.)、链球菌(Streptococcus spp.)、肠球菌(Enterococcus spp.)、乳杆菌(Lactobacillusspp.)、明串珠菌(Leuconostoc spp.)和片球菌(Pediococcus spp.)中。
术语“混合乳酸菌(LAB)培养物”指包含两种或更多种不同LAB的混合培养物。术语“纯乳酸菌(LAB)培养物”指仅包含一种LAB的纯培养物。
在此描述的培养物可以是嗜温培养物，由具有约为30℃最适生长温度的嗜温细菌组成。“嗜温培养物”是包含两种或更多种不同的嗜温LAB的培养物。
属于嗜温群的典型微生物包括乳酸乳球菌乳亚种(Lactococcus lactissubsp.lactis)、乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcus lactis subsp.cremoris)、肠系膜明串珠菌乳脂亚种(Leuconostoc mesenteroides subsp.cremoris)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)、Lactococcus lactis subsp.lactis biovar.diacetylactis和干酪乳杆菌干酪亚种(Lactobacillus casei subsp.casei)。嗜热乳酸菌包括例如嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillusdelbrueckii subsp.bulgaricus)和嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)。
在此描述的培养物可包含不能利用蔗糖的LAB。所谓的氧-培养物(O-culture)用来制造不带孔洞的干酪(切达干酪、柴郡干酪、羊奶干酪)且一般包括一种或多种选自乳酸乳杆菌乳亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)和乳酸乳杆菌乳脂亚种(Lactococcus lactis subsp.cremoris)的微生物。通常氧-培养物被认为是不利用蔗糖的。
高浓缩颗粒状冷冻乳酸菌培养物在此描述的冷冻培养物在食品工业中可称为高浓缩颗粒状冷冻乳酸菌培养物。为了包含足够的细菌，这样的培养物应当相对大(具有足够的重量)以及具有相对高的活细菌浓度。显然如果要求相对多的细菌，那么活细菌的重量和/或浓度就要增加。
优选地，在此描述的颗粒状冷冻乳酸菌(LAB)培养物具有至少100g重的冷冻物质，更优选地具有至少250g重的冷冻物质，还优选地具有至少500g重的冷冻物质，以及最优选地具有至少900g重的冷冻物质。优选地，冷冻物质的重量小于500kg。
优选地，在此描述的颗粒状冷冻乳酸菌(LAB)培养物含有至少5×109个菌落形成单位(CFU)/克冷冻物质的活细菌，更优选地含有至少1010个菌落形成单位(CFU)/克冷冻物质的活细菌，以及最优选地含有至少2×1010个菌落形成单位(CFU)/克冷冻物质的活细菌。
用于LAB的发酵和合适的发酵培养基为本领域所公知，并且本领域技术人员能选择与特定LAB相关的合适的培养基和发酵条件。在本文的实施例部分中给出了合适的培养基和发酵。
为了得到足够量的细菌，在本发明上下文中优选在合适的大发酵罐中进行相对大规模的发酵。发酵罐优选至少50L，更优选至少90L，还优选500L或更大的。
在合适的发酵后，优选通过除去发酵培养基的液体(上清液)(如通过离心)分离获得活细菌。所分离的活细菌可称为分离生物量。该分离的活细菌应优选含有至少109个菌落形成单位(CFU)/克冷冻物质的活细菌，更优选含有至少5×109个菌落形成单位(CFU)/克冷冻物质的活细菌，以及最优选含有至少1010个菌落形成单位(CFU)/克冷冻物质的活细菌。
在添加剂化合物(见以下)添加到浓缩培养物中后。培养物可方便地通过将混合物逐滴地添加到液氮中形成冻结的混合物颗粒或微粒而冻结。一种可行的冷冻方法描述于DE2805676和FR2393251中。
然后以合适的方式包装颗粒状冷冻培养物以便提供给用户。
添加剂化合物如上所述，优选地相关的添加剂化合物特征在于，它们能增加冷冻培养物的Tm’值至高于贮藏温度如-46℃的值，例如使Tm’值达到-45℃至-15℃，更优选地使Tm’值达到-43℃至-15℃，以及还优选地使Tm’值达到-39℃至-15℃。
本文实施例2举例说明了一种用于鉴定相关添加剂化合物的快速实验策略。添加不同的相关化合物(10％W/W)到具有低于-46℃的Tm’值的“模式”冷冻培养物(在实施例2中，“模式”培养物具有-54℃的Tm’值)中，并在添加前后通过DSC测定Tm’值。
实施例2的“模式”培养物和该实施例2的测试方法优选地用于评估是否特定的目的添加剂化合物其特征在于，即能增加冷冻培养物的Tm’值至高于-46℃，例如使Tm’值达到-45℃至-15℃，更优选使Tm’值达到-43℃至-15℃，还优选使Tm’值达到-39℃至-15℃。
在实施例2中，可见环糊精增加Tm’至-44℃，麦芽糖醇增加Tm’至-42℃，海藻糖增加Tm’至-38℃，鱼胶增加Tm’至-37℃，麦芽糖糊精增加Tm’至-32℃以及喷胶增加Tm’至-31℃。
优选地，添加剂化合物是分子量(MW)在150-100000g/mol，更优选地在250-100000g/mol，还优选地在300-40000g/mol以及最优选地在500-15000g/mol的化合物。
在优选的实施方案中，所述添加剂化合物也是低温保护剂。
术语“低温保护剂”指能改善冷冻培养物贮藏稳定性的物质，该贮藏稳定性测自培养物的活性。在本发明上下文中，其可以是一种特定的低温保护剂或可以是两种或更多种不同的低温保护剂。因此，在培养物中的低温保护剂w/w％应当理解为低温保护剂量之和。
优选地，低温保护剂可选自蛋白质或蛋白质水解产物。优选的合适例子包括选自麦芽提取物、脱脂奶粉、乳清粉、酵母提取物、谷蛋白、胶原蛋白、明胶、弹性蛋白、角蛋白和白蛋白的水解产物所组成的组。
更优选地，低温保护剂是碳水化合物或涉及核酸生物合成的化合物。优选的合适碳水化合物包括选自戊糖(如核糖、木糖)、己糖(如果糖、甘露糖、山梨糖)、二糖(如蔗糖、海藻糖、蜜二糖、乳果糖)、寡糖(如棉子糖)、低聚果糖(Oligofrutoses)(如Actilight、Fribroloses)、多糖(如麦芽糖糊精、黄原胶、果胶、藻酸盐、微晶纤维素、葡聚糖、PEG)以及糖醇(山梨糖醇、甘露醇)所组成的组。最优选地，所述碳水化合物为分子量(MW)在150-100000g/mol，更优选在250-100000g/mol，还优选在300-40000g/mol以及最优选在500-15000g/mol。
在特别优选的实施方案中，所述添加剂化合物为选自环糊精、麦芽糖醇、鱼胶、麦芽糖糊精(优选为麦芽糖糊精DE2至麦芽糖糊精DE 19)、喷胶(如喷胶IRX 51693)、肌苷-5’-一磷酸(IMP)以及肌苷所组成的组。
冷冻培养物包含占冷冻物质0.5％-13％w/w量的添加剂化合物，优选包含占冷冻物质1％-12％w/w量的添加剂化合物，更优选包含占冷冻物质2％-10％w/w量的添加剂化合物，以及还优选包含占冷冻物质5％-10％w/w量的添加剂化合物。
可通过在合适的温度下将固体添加剂化合物与生物量混合如30分钟，以将添加剂化合物，也可以是低温保护剂，在发酵后添加到分离的活细菌(生物量)中。如果添加剂化合物是例如麦芽糖糊精的，则合适的温度可以是室温。或者，添加剂化合物的无菌溶液可与生物量混合。
制备颗粒状冷冻乳酸菌(LAB)培养物的方法如上所述，本发明第二方面涉及制造本发明第一方面的颗粒状冷冻乳酸菌(LAB)培养物的方法，包括如下步骤(i)添加添加剂化合物到活细菌中以使至少50g的物质含有至少109个菌落形成单位(CFU)/克物质的活细菌，所添加的添加剂化合物占所述物质的0.5％-13％w/w量，
(ii)冷冻所述物质以获得颗粒状冷冻的物质，和(iii)以合适的方式包装所述颗粒状冷冻物质。
如上所述，在此最相关的“出问题的”培养物是颗粒状冷冻乳酸菌(LAB)培养物，其并不包含在此所述添加的添加剂化合物，具有-70℃至-46℃的Tm’值。
因此，在一个优选的实施方案中，在根据上述步骤(i)添加添加剂化合物之前，测定不含添加剂化合物的冷冻乳酸菌(LAB)培养物的Tm’值并确定其具有-70℃至-46℃或更低的Tm’值。
在根据上述步骤(i)添加添加剂化合物之前，进行颗粒凝结测试(见上)并确定冷冻培养物的单个颗粒在-46℃下贮藏时粘在一起。
优选地，在添加了添加剂化合物后，测定包含添加剂化合物的冷冻的乳酸菌(LAB)培养物的Tm’值，并证实Tm’值高于-46℃，优选在-45℃至-15℃，更优选在-43℃至-15℃，以及还优选在-39℃至-15℃。
最后，在添加了添加剂化合物后，培养物呈颗粒状冷冻，并进行颗粒凝结测试(见上)确保至少100个单个颗粒中的80个保持为松散的、单个颗粒。
冷冻乳酸菌(LAB)培养物的应用根据现有技术，在此描述的冷冻的乳酸菌(LAB)培养物可用于加工制造食品或饲料产品过程。
具体实施例方式
实施例1R604-E(一种市售冷冻氧-培养物，Chr.Hansen A/S，Denmark)在冷冻贮藏过程中倾向于形成粘性颗粒。在本发明研究中，该问题是通过在更详细地观察融解温度并设法通过添加酪蛋白酸盐、蔗糖或麦芽糖糊精以增加融解温度而得到处理的。
目的评估通过使用添加剂是否能增加F-DVS R604-E的融点。
评估了使用添加剂增加R604-E融点的效果目测，以及通过DSC对每个所测试的制剂测定Tm’。
i)材料2千克的市售培养物F-DVS R 604-E(Chr.Hansen A/S，Hoersholm，Denmark，批次2441258，产品编号616581)。
ii)用于增加制剂融点的添加剂溶液50％(w/w)蔗糖溶液(Danisco，Denmark).
10％(w/w)酪蛋白酸钠盐溶液(Arla，Denmark).
30％(w/w)麦芽糖糊精DE 10溶液(Glucidex 10，Roquette Frères，Lestrem，France).
30％(w/w)麦芽糖糊精DE 2溶液(Glucidex 2，Roquette Frères，Lestrem，France)。
iii)F-DVS R604-E制剂配方将冷冻的浓缩物解冻并根据表1与添加剂混合。
表1.R604-E制剂
*)g干物质添加剂/g浓缩物目测评估F-DVS R604融点6种F-DVS R-604E制剂在液氮中呈颗粒状冷冻，并将100个单个颗粒(约20-30g)的颗粒物倒入培养皿中，从而形成了松散的、单个颗粒的薄层。
将每种制剂的一个样品置于预调为-50℃的冷冻机中，样品的实际温度为-46℃。贮藏7天后，检查样品是否仍然松散或是否颗粒已经凝结成块或看上去有粘性，以及如果在有粘性的情况下能否通过振动自发地再成为松散颗粒。
表2.目测冷冻颗粒物并测定Tm’
-＝凝结成块、结块或带粘性。(100个单个颗粒中不到20个保持为松散单个颗粒)+＝部分松散的颗粒。(100个单个颗粒中不到60个保持为松散单个颗粒)++＝几乎是松散的颗粒。(100个单个颗粒中至少80个保持为松散单个颗粒)+++＝松散的颗粒(100个单个颗粒中至少90个保持为松散单个颗粒)Tm’的测定在100μL氧化铝坩埚中制备样品并在液氮中冻结。将每种制剂的一个样品以及F-DVS R604置于-46℃下6天。
在带有100μL氧化铝坩埚的Mettler Toledo 822e差示扫描量热仪(aDSC)上测定相变，温度程序，放入温度-90℃，扫描温度程序5℃/min.-130℃至0℃。
测定Tm’值(冰融解开始，如Roos(1995)所定义的)。结果示于表2中。
我们观察到使用＞6％蔗糖和6％麦芽糖糊精(2或10)增加了冷冻颗粒的Tm’值。对于酪蛋白酸钠盐没有观察到任何效果。根据目测，10％蔗糖和两种不同的麦芽糖糊精显示出抗形成粘性颗粒倾向的积极效果。
实施例2目的进行筛选研究以确定何种添加剂能增加冷冻培养物的融点。测试了如下添加剂海藻糖、麦芽糖糊精12、环糊精、喷胶、PEG、鱼胶、麦芽糖醇、氯化钠、甘油i)材料F-DVS R 604-E(批次2471755，产品编号616581)，详细资料请见实施例1。
ii)用于制剂以增加融点的添加剂溶液50％(w/w)海藻糖30％(w/w)麦芽糖糊精DE 12(Glucidex 12，Roquette Frères，Lestrem，France)30％(w/w)环糊精30％(w/w)喷胶(CNI的IRX 51693)30％(w/w)PEG(PEG 6000，Merck，Germany)30％(w/w)鱼胶粉200(SKW Biosystems，France)30％(w/w)麦芽糖醇30％(w/w)氯化钠
30％(w/w)甘油iii)F-DVS R604-E制剂配方将冷冻的F-DVS R604-E浓缩物解冻并与占最终制剂10％(W/W)的不同添加剂混合。
Tm’的测定在100μL氧化铝坩埚中制备样品并在液氮中冻结。在Mettler Toledo822e差示扫描量热仪记录9种制剂的相变曲线并与参考样品(无添加剂的R604E)比较。样品在-90℃下放入DSC，并运行在温度程序放入温度-90℃；温度扫描7℃/min从-130℃至0℃下。
结果获得相变曲线，利用Roos(1991)所述的方法测定了Tm’值，并在下表3中给出表3.观测到的Tm’(℃)
参考样品的Tm’为-54℃(冰融解的开始)。
如下添加剂增加了Tm’PEG(-53℃)，，环糊精(-44℃)，麦芽糖醇(-42℃)，海藻糖(-38℃)，
鱼胶(-37℃)，麦芽糖糊精12(-32℃)，喷胶(-31℃)甘油和氯化钠并没有增加冷冻培养物颗粒的融点。
实施例3该试验主要评估了添加剂量和在DSC上测定的Tm’增加之间的关系。
i)材料F-DVS CH N 19(批次2421868)(市售冷冻的LD-培养物，Chr.HansenA/S，Denmark)。
表4.利用蔗糖和海藻糖作为添加剂的CH N19制剂
ii)用于制剂以增加融点的添加剂溶液每克生物量的蔗糖浓度在3％(w/w)至13％(w/w)之间。仅测试5％(w/w)水平的海藻糖。所有的蔗糖浓度从添加到生物量的50％(w/w)蔗糖溶制备。
海藻糖浓度从40％(w/w)溶液制备。
Tm’的测定将冷冻的F-DVS R604-E浓缩物解冻并与表4中所显示的不同添加剂混合。然后将样品转移到100μL氧化铝坩埚中并在液氮中冻结，在分析前贮藏在-46℃下。在DSC上对8种制剂记录相变曲线并与参考样品(无添加剂的R604E)比较。样品在-90℃下放入DSC，并利用温度程序运行放入温度-90℃温度扫描5℃/min.-130℃至0℃下。
根据Tm’的这些相变曲线。Tm’和添加的二糖量之间的关系可见于图1。
根据图1，可见8％及更多的蔗糖能保证在-46℃下贮藏的冷冻培养物不发生融解。
实施例4在添加麦芽糖糊精(Glucidex 12，购自Roquette Frères，Lestrem，France)前后，分析购自Chr.Hansen A/S，Denmark的市售培养物(HP，HPS，HP-1，LP，LL-2)的初始融点。该产品是以冷冻颗粒物出售的，保证其初始融点高于贮藏温度，因此应当保持松散。
目的本研究的目的在于增加初始融点以高于贮藏温度，以便获得松散的颗粒。
材料和方法i)材料Glucidex 12(Roquette Frères，Lestrem，France)用作为添加剂化合物。
使用了100g的列于表5中的每种培养物。B表示没有添加甘油到培养物中，而A表示在颗粒冻结前已添加了10％v/v甘油。
表5.使用的培养物
ii)样品制剂配方将冷冻的浓缩培养物解冻并与占最终制剂3.5％至10.1％(W/W)的不同量的Glucidex 12溶液混合。
所述不同的制剂列于表6。
iii)Tm’的测定在100μL氧化铝坩埚中制备样品。在Mettlet DSC上对所有的制剂记录相变曲线。样品在-90℃下放入DSC。扫描温度程序7℃/min.-100℃至0℃。
iiii)目测评估F-DVS R604的融点制剂在液氮中呈颗粒状冷冻，并将100个单个颗粒(约20-30g)颗粒物倒入培养皿中，从而形成了松散的、单个颗粒的薄层。将每种制剂的一个样品置于-46℃下。贮藏14天后，检查样品是否仍然松散或颗粒是否凝结成块或看上去有粘性，以及如果在有粘性的情况下能否通过振动自发地再成为松散颗粒。
结果添加不同量麦芽糖糊精(Glucidex 12)到不同培养物中的结果如图1所示。很清楚麦芽糖糊精浓度增加，Tm’也增加。表2中列出了评估粘性/凝结成块的结果。具有高于-46℃贮藏温度的Tm’的样品是松散的颗粒，而具有低于-46℃贮藏温度的Tm’的样品则粘在一起。
表6样品制剂、起始融解温度(Tm’)以及冷冻颗粒目测结果
表格注释-表示凝结成块、结块或带粘性(100个单个颗粒中不到20个保持为松散单个颗粒)。
+++表示松散的颗粒(100个单个颗粒中至少90个保持为松散单个颗粒)。
结果阐明于表6和图2中，表明麦芽糖糊精能有效地增加含10％v/v甘油培养物(A-系列)和不含甘油培养物(B-系列)的Tm’。该实验进一步证明了众所周知的低温保护剂(即甘油)在颗粒状冷冻的培养物贮藏过程中并不能用于增加其物理稳定性。
参考文献Carcoba，R.等，“Influence of cryoprotectants on the viability and acidifyngactivity of frozen and freeze-dried cells of the novel starter strain Lactococcuslactis subsp.lactis CECT 5180”，Eur Food Res Technol(2000)211，433-437Chavarri，F.J.等，“Cryoprotective agents for frozen concentrated starters fromnon-bitter Streptococcus Lactis strains”，Biotechnology letters，vol 10，1，11-16(1988)DE2805676，(Jespersen等)，1978年8月18日Fennema O.R.(编)Food Chemistry，第3版.Marcel Dekker，1067pp.(ISBN0-8247-9346-3)，1996.
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Roos，Y.和M.Karel(1991)Phase transitions of amorphous sucrose and frozensucrose solutions.J.Food Science，56266-267.
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US 4,140,800(Leo Kline)1979年2月20日WO 00/39281(Kringelum等)2000年7月6日WO 2004/065584A1(Bisgaard-Frantzen等)2004年8月5日(与国际申请号PCT/DK2004/000025同族)
权利要求
1.一种市售相关包装的颗粒状冷冻乳酸菌(LAB)培养物，所述包装具有至少重50g的冷冻物质，其中冷冻物质以单个颗粒的形式存在，含有至少109个菌落形成单位(CFU)/克冷冻物质的活细菌，并包含占冷冻物质0.5％-13％w/w量的添加剂化合物，其中所述添加剂化合物选自化合物组，通过使用占冷冻物质10％w/w量的添加剂化合物能增加冷冻乳酸菌(LAB)培养物的Tm’(冰融解开始温度)至高于-46℃，例如-45至-15℃(通过DSC测定)，所述冷冻乳酸菌(LAB)培养物不含有添加剂化合物，具有-70℃至-46℃的Tm’值，以及其中所述冷冻乳酸菌(LAB)培养物其特征在于，当贮藏在约-46℃下7-14天时，所述冷冻培养物的单个颗粒并不粘在一起，因此基本上保持为单个颗粒，在此是通过下列测试来测定的冷冻培养物单个颗粒在液氮中颗粒状冷冻，将100个单个颗粒(约5-100g的颗粒)倒入培养皿中，从而形成了松散的、单个颗粒的薄层，该薄层特征在于，大多数颗粒与其相邻的一个或多个颗粒直接接触，在约-46℃下放置7-14天并检查颗粒是否仍然松散或颗粒是否凝结成块或粘在一起，其中用于冷冻培养物的单个颗粒基本上保持为单个颗粒的判断标准是至少100个单个颗粒中的80个保持为松散的单个颗粒，排除了包含能利用蔗糖的LAB的冷冻乳酸菌(LAB)培养物，其中培养物包含的低温保护剂化合物选自占冷冻物质2％-13％w/w量的蔗糖，和占冷冻物质4％-6％w/w量的海藻糖，以及占冷冻物质13％w/w量的海藻糖/蔗糖混合物所组成的组。
2.权利要求1所述的颗粒状冷冻培养物，其中所述培养物是由具有在约30℃最适生长温度的嗜温细菌组成的混合的嗜温培养物。
3.权利要求1或2所述的颗粒状冷冻培养物，其中所述LAB是选自包括双歧杆菌(Bifdobacterium spp.)、短杆菌(Brevibacterium spp.)、丙酸杆菌(Propionibacterium spp.)、乳球菌(Lactococcus spp.)包括乳酸乳球菌乳亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)和乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcuslactis subsp.cremoris)、乳杆菌(Lactobacillus spp.)包括嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、链球菌(Streptococcus spp.)、肠球菌(Enterococcusspp.)、片球菌(Pediococcus spp.)、酒球菌(Oenococcus spp.)和真菌包括青霉菌(Pencillium spp.)、隐球菌(Cryptococcus spp.)、Debraryomyces spp.、Klyveromyces spp.和酵母菌(Saccharomyces spp.)的组。
4.前述权利要求任一所述的颗粒状冷冻培养物，其中根据权利要求1不含有添加剂化合物的所述冷冻乳酸菌(LAB)培养物具有-70℃至-46℃的Tm’值。
5.前述权利要求任一所述的颗粒状冷冻培养物，其中所述冷冻乳酸菌培养物包含占冷冻物5％-10％w/w量的添加剂化合物。
6.前述权利要求任一所述的颗粒状冷冻培养物，其中所述添加剂化合物选自环糊精、麦芽糖醇、海藻糖、鱼胶、麦芽糖糊精、酵母提取物和喷胶所组成的组。
7.一种制造权利要求1-6任一所述的颗粒状冷冻乳酸菌(LAB)培养物的方法，包括如下步骤(i)添加添加剂化合物到活细菌中以使至少50g的物质含有至少109个菌落形成单位(CFU)/克物质的活细菌，所添加的添加剂化合物占所述物质的0.5％-13％w/w量；(ii)冷冻所述物质以获得颗粒状冷冻物；和(iii)以合适的方式包装所述冷冻物以获得包装的如权利要求1-6任一所述的颗粒状冷冻乳酸菌(LAB)培养物。
8.权利要求7所述的方法，其中在根据权利要求7步骤(i)添加添加剂化合物之前，测定不含添加剂化合物的冷冻乳酸菌(LAB)培养物的Tm’值并确定其具有-70℃至-46℃的Tm’值；以及在添加了添加剂化合物后，测定包含添加剂化合物的冷冻乳酸菌(LAB)培养物的Tm’值，并证实Tm’值在-49℃至-15℃，更优选在-39℃至-15℃。
9.一种通过权利要求7或8所述制造冷冻乳酸菌(LAB)培养物的方法获得的颗粒状冷冻乳酸菌(LAB)培养物。
10.权利要求1-6和9任一所述的颗粒状冷冻乳酸菌(LAB)培养物在制造食品或饲料产品方法中的应用。
全文摘要
一种市售相关包装的颗粒状冷冻乳酸菌(LAB)培养物，该包装具有至少重50g的冷冻物质，其中冷冻物质以单个颗粒的形式存在，特征在于，当在－46℃下贮藏7－14天时，冷冻培养物的单个颗粒并不粘在一起，因此基本上保持为单个颗粒。
文档编号C12N1/04GK1922305SQ200580005638
公开日2007年2月28日 申请日期2005年2月24日 优先权日2004年2月24日
发明者里克·斯达温斯伯格, 英吉·奈普, 汉斯·比斯哥德－弗兰森 申请人:科·汉森有限公司