鉴定具有淀粉磷酸化酶促活性的蛋白质的方法

专利名称：鉴定具有淀粉磷酸化酶促活性的蛋白质的方法
技术领域：
本发明涉及鉴定淀粉磷酸化相关蛋白质及其编码核酸的方法。本发明还涉及蛋白质活性增强的植物细胞和植物，所述蛋白质可用本发明的方法鉴定。此类植物细胞和植物合成改性的淀粉。因此，本发明还涉及由本发明的植物细胞和植物合成的淀粉，以及制备该淀粉的方法；还涉及制备该改性淀粉的淀粉衍生物。
当前，对作为可再生原材料来源的植物成分日趋重视，生物技术研究的任务之一是努力使这些植物原材料满足加工业的要求。此外，为了使再生的原材料能用于尽可能多的应用领域，有必要获得很多种材料。
多糖淀粉由化学上一致的基本组分葡萄糖分子组成，但是构成具有不同分子形式的复合混合物，所述混合物在聚合及分支程度上都有差异，因而彼此间的物理化学特性也有很大不同。直链淀粉和支链淀粉之间存在差别，前者是由α-1，4-糖苷键连接的葡萄糖单位组成的基本不分支的聚合物；而后者则为支化聚合物，其中通过另外的α-1，6-糖苷键形成支链。直链淀粉和支链淀粉之间的另一本质差别在于分子量。根据淀粉的来源，直链淀粉的分子量为5×105～106Da，而支链淀粉的分子量则处于107～108Da之间。这两种大分子可通过它们的分子量和不同的物理化学特性来区分，而其不同的物理化学特性最易见于它们不同的碘结合特性。
一直认为直链淀粉是由α-1，4-糖苷键连接的α-D-葡萄糖单体组成的线性聚合物。然而近来的研究显示其中存在α-1，6-糖苷分支点(约0.1％)(Hizukuri和Takagi，Carbohydr.Res.134，(1984)，1-10；Takeda等人，Carbohydr.Res.132，(1984)，83-92)。
淀粉的功能特征(如溶解度、老化行为、水结合能力、成膜特性、粘性、糊化特性、冻融稳定性、酸稳定性、凝胶强度和淀粉颗粒大小等)受到直链淀粉/支链淀粉比例、分子量、侧链分布模式、离子强度、脂质和蛋白质含量、平均淀粉颗粒大小、淀粉颗粒形态等的影响。淀粉的功能特征也受其中的非碳成分——磷酸酯含量的影响。此处需区分以单酯形式与淀粉葡萄糖分子共价连接的磷酸酯(下文称为淀粉磷酸酯(starchphosphate))和以磷脂形式与淀粉相连的磷酸酯。除了磷酸酯的含量，这种情况下，淀粉的功能特征还受磷酸酯在淀粉中的出现形式(淀粉磷酸酯或磷脂)的影响(Jane等人，1996，Cereal Foods World 41(11)，827-832)。
淀粉磷酸酯的含量随植物种系的不同而不同。因此，如某些玉米突变体合成淀粉磷酸酯含量升高的淀粉(糯玉米0.002％，高直链淀粉玉米0.013％)，而常规类型的玉米只含有微量的淀粉磷酸酯。同样，小麦中含有少量的淀粉磷酸酯(0.001％)，而燕麦和高粱中则检测不到淀粉磷酸酯。与传统稻种系(0.013％)相比，稻突变体中同样也含更少的淀粉磷酸酯(糯米0.003％)。在块茎或根贮存淀粉的合成植物中可检测到大量淀粉磷酸酯，如木薯(0.008％)、甘薯(0.011％)、竹芋(0.021％)或马铃薯(0.89％)。上文引用的淀粉磷酸酯含量的百分比值均以各例的淀粉干重表示，已由Jane等人确定(1996，Cereal Foods World 41(11)，827-832)。
淀粉磷酸酯可以以单酯的形式出现在聚合葡萄糖单体的C-2、C-3或C-6位(Takeda和Hizukuri，1971，Starch/Strke 23，267-272)。植物合成淀粉中淀粉磷酸酯的磷酸酯分布一般可以如下鉴别，即约30％至40％磷酸酯残基共价连接到葡萄糖分子的C-3位，而约60％至70％磷酸酯残基共价连接到C-6位(Blennow等人，2000，Int.J.of Biological Macromolecules27，211-218)。Blennow等人(2000，Carbohydrate Polymers 41，163-174)已经确定多种淀粉中连接到葡萄糖分子C-6位上的淀粉磷酸酯的含量，例如马铃薯淀粉(根据种类不同，介于每毫克淀粉7.8至33.5nMol之间)、多种姜黄(Curcuma)属的淀粉(每毫克1.8至63nMol)、木薯淀粉(每毫克2.5nMol)、稻淀粉(每毫克1.0nMol)、绿豆淀粉(每毫克3.5nMol)和高粱淀粉(每毫克0.9nMol)。这些作者尚未能在大麦淀粉及不同糯玉米突变体的淀粉中发现任何连接到C-6位上的淀粉磷酸酯。迄今为止还不能在植物的基因型及其淀粉磷酸酯含量之间建立联系(Jane等人，1996，Cereal Foods World 41(11)，827-832)。因此，目前还不可能通过育种的手段影响植物中的淀粉磷酸酯含量。
转基因植物的贮存淀粉中淀粉磷酸酯的含量各不相同。因此，与相应的野生型植物的淀粉相比，可溶性淀粉合酶III(Abel等人，1996，The PlantJournal 10(6)，9891-991)、分支酶I(BEI)(Safford等人，1998，CarbohydratePolymers 35，155-68)、分支酶II(BEII)(Jobling等人，1999，The PlantJournal 18，163-171)、BEI和BEII(Schwall等人，2000，NatureBiotechnology 18，551-554)、歧化酶(WO 9627673)或歧化酶和BEI(WO95 07355)活性降低的马铃薯植物的贮存淀粉中淀粉磷酸酯含量增加。然而这些植物中淀粉磷酸酯含量的改变并非由其中活性降低的蛋白质所致，所述蛋白质直接参与向淀粉内引入磷酸酯残基。因此，相关转基因植物中淀粉磷酸酯含量的提高并非原发效应，而是由于相应蛋白质减少所导致的继发效应。改变所述蛋白质的活性导致淀粉磷酸酯含量提高的原因目前还不清楚。因此，不可能通过修饰只能继发性影响淀粉磷酸酯含量的蛋白质活性来特异性改变淀粉磷酸酯的含量。此外，修饰继发性影响植物中淀粉磷酸酯含量的蛋白质活性的同时，也会进一步修饰淀粉，例如，直链淀粉/支链淀粉的比例和/或支链淀粉侧链长度的改变，这些构成了此类蛋白质活性改变的原发效应。
过去只描述了一种介导磷酸盐残基与淀粉葡萄糖分子间共价键形成的蛋白质。该蛋白质在科学文献中通常被称为R1，与马铃薯块茎贮存淀粉的淀粉颗粒相连(Lorberth等人，1998，Nature Biotechnology 16，473-477)，并具有α-葡聚糖水双激酶(alpha-glucan water dikinase)的酶活性(E.C.02.07.09.4)。在由R1催化的反应中，离析物α-1，4-葡聚糖(淀粉)、腺苷三磷酸(ATP)和水转化为产物葡聚糖磷酸(磷酸化淀粉(phosphorylated starch))、一磷酸和腺苷一磷酸。其中，ATP的γ-磷酸酯残基被转移给水，而ATP的β-磷酸酯残基则转移到葡聚糖(淀粉)。R1在体外可以将ATP的β-磷酸酯残基转移到α-1，4-葡聚糖的葡萄糖分子的C-6和C-3位上。体外反应得到的C-6磷酸酯和C-3磷酸酯的比例与植物中分离的淀粉比例一致(Ritte等人，2002，PNAS 99，7166-7171)。由于马铃薯淀粉中约70％的淀粉磷酸酯连接于淀粉葡萄糖单体的C-6位，而约30％连接于C-3位；这就意味着R1优选磷酸酯化葡萄糖分子的C-6位。此外使用玉米支链淀粉显示，R1还能够磷酸酯化尚不含有共价连接磷酸酯的α-1，4-葡聚糖(Ritte等人，2002，PNAS 99，7166-7171)，即R1能够在α-1，4-葡聚糖中从头引入磷酸酯。
R1的氨基酸序列中含有结构域，所述结构域与已知丙酮酸磷酸双激酶(PPDK结构域)和已知丙酮酸水双激酶(PPS结构域)具有高度同源性，并含有在PPDK和PPS结构域中保守的组氨酸残基。在将ATP的磷酸酯残基转移至α-1，4-葡聚糖(淀粉)的过程中，形成磷酸酯化R1蛋白质作为中间产物，其含有与PPDK或PPS结构域中保守组氨酸残基共价连接的磷酸酯残基(Mikkelsen等人，2004，Biochemical Journal 377，525-532)。
已经描述了多个种系中编码R1蛋白质的核酸序列和对应的氨基酸序列，例如马铃薯(WO 97 11188，GenBank Acc.AY027522，Y09533)、小麦(WO 00 77229，US 6,462,256，GenBank Acc.AAN93923，GenBank Acc.AR236165)、稻(GenBank Acc.AAR61445，GenBank Acc.AR400814)、玉米(GenBank Acc.AAR61444，GenBank Acc.AR400813)、大豆(GenBankAcc.AAR61446，GenBank Acc.AR400815)、柑桔(GenBank Acc.AY094062)和拟南芥(GenBank Acc.AF312027)。
WO 02 34923中描述了由于过表达马铃薯R1基因而致R1蛋白质活性增强的小麦植物。与检测不到淀粉磷酸酯的相应野生型植物相比，这些植物合成的淀粉在葡萄糖分子C-6位上具有大量的淀粉磷酸酯。
目前尚未描述其他催化向淀粉中引入共价连接的磷酸酯基的反应的蛋白质。也不明确优选向淀粉的葡萄糖分子的C-3位和/或C-2位上引入磷酸酯基的酶。因此，除了提高植物中淀粉磷酸酯含量外，没有什么可用的方法能特异地影响植物淀粉的磷酸酯化、改变植物合成的淀粉中磷酸酯的分布和/或进一步提高淀粉磷酸酯的含量。
因此，本发明的目的在于提供制备植物的方法和手段，所述植物能够合成磷酸酯含量提高和/或磷酸酯分布改变的改性淀粉，还在于提供合成该改性淀粉的植物细胞和/或植物。
这一问题的解决可见权利要求书中的实施方案。
因此，本发明涉及鉴定对磷酸酯化α-1，4-葡聚糖的结合活性比对非磷酸酯化α-1，4-葡聚糖的结合活性增强的蛋白质的方法，其中a)在彼此分离的制备物中将蛋白质提取物与以下物质温育i磷酸酯化α-1，4-葡聚糖。和ii非磷酸酯化α-1，4-葡聚糖，b)特异结合于i步骤a)i中的磷酸酯化α-1，4-葡聚糖蛋白质，和ii特异结合于步骤a)ii中的非磷酸酯化α-1，4-葡聚糖的蛋白质溶解于彼此分离的制备物中，并c)鉴定蛋白质，所述蛋白质与步骤b)i中所用的磷酸酯化α-1，4-葡聚糖的结合活性相对于其与步骤b)ii中所用的非磷酸酯化α-1，4-葡聚糖的结合活性增强。
本发明用于鉴定对磷酸酯化α-1，4-葡聚糖的结合活性比对非磷酸化α-1，4-葡聚糖的结合活性增强的蛋白质的方法的另一实施方案中，所述与之结合活性更高的磷酸化α-1，4-葡聚糖为淀粉，优选颗粒淀粉。
本发明用于鉴定相对于非磷酸化α-1，4-葡聚糖，对磷酸化α-1，4-葡聚糖的结合活性增强的蛋白质的方法的另一实施方案涉及鉴定蛋白质，其氨基酸序列的分子量为120kDa至145kDa，优选120kDa至140kDa，尤其优选125kDa至140kDa，特别优选130kDa至135kDa。
在另一实施方案中，本发明的方法涉及鉴定相对于非磷酸化α-1，4-葡聚糖，对磷酸化α-1，4-葡聚糖的结合活性增强的蛋白质，其中对磷酸化α-1，4-葡聚糖的结合活性与其对非磷酸化α-1，4-葡聚糖的结合活性相比，提高至少3倍，优选至少4倍，尤其优选至少5倍，而特别优选至少6倍。
可以通过如免疫学方法确定结合于磷酸化α-1，4-葡聚糖或非磷酸化α-1，4-葡聚糖的蛋白质的量，如Western印迹分析、ELISA(酶联免疫吸附测定)或RIA(放射性免疫测定)。
制备可与某一蛋白质特异性反应(即可与所述蛋白特异性结合)的抗体的方法为本领域技术人员所公知(例如见Lottspeich和Zorbas(编著)，1998，Bioanalytik，Spektrum akad，Verlag，Heidelberg，柏林，ISBN3-8274-0041-4)。一些公司可以以协议服务提供此类抗体的制备(如Eurogentec，Belgium)。制备可与本发明的蛋白质特异性反应的抗体的可能方法之一描述于下文(见实施例11)。
比较实施本发明用于鉴定相对于非磷酸化α-1，4-葡聚糖，对磷酸化α-1，4-葡聚糖的结合活性增强的蛋白质的方法所得的溶解的磷酸化α-1，4-葡聚糖结合蛋白质与所得的溶解的非磷酸化α-1，4-葡聚糖结合蛋白质，可以鉴定对磷酸化α-1，4-葡聚糖的结合活性比对非磷酸化α-1，4-葡聚糖结合活性增强的蛋白质。
在本发明用于鉴定相对于非磷酸化α-1，4-葡聚糖，对磷酸化α-1，4-葡聚糖的结合活性增强的蛋白质的方法的另一个实施方案中，将根据步骤a)i温育蛋白质提取物和磷酸化α-1，4-葡聚糖所得的磷酸化α-1，4-葡聚糖蛋白质复合体，以及根据步骤a)ii温育蛋白质提取物和非磷酸化α-1，4-葡聚糖所得的非磷酸化α-1，4-葡聚糖蛋白质复合体，从不与相关α-1，4-葡聚糖结合的蛋白质中分离。其中，在步骤a)i或步骤a)ii之后分别分离相应的各温育溶液。
在本发明用于鉴定相对于非磷酸化α-1，4-葡聚糖，对磷酸化α-1，4-葡聚糖的结合活性增强的蛋白质的方法的另一个实施方案中，将步骤b)i或步骤b)ii的溶解蛋白质与本发明方法步骤a)i或步骤a)ii中使用的α-1，4-葡聚糖分离。
在本发明用于鉴定相对于非磷酸化α-1，4-葡聚糖，对磷酸化α-1，4-葡聚糖的结合活性增强的蛋白质的方法中，根据步骤b)i所得的溶解蛋白质可能含有单个蛋白质或多个蛋白质。根据步骤b)ii的溶解蛋白质也可能含有单个蛋白质或多个蛋白质。如果溶解的磷酸化α-1，4-葡聚糖结合蛋白质或溶解的非磷酸化α-1，4-葡聚糖结合蛋白质均含有多个不同的蛋白质，必要时应将它们彼此分离。
在本发明用于鉴定相对于非磷酸化α-1，4-葡聚糖，对磷酸化α-1，4-葡聚糖的结合活性增强的蛋白质的方法的另一个实施方案中，当实施本发明方法时，将根据步骤b)i的溶解的磷酸化α-1，4-葡聚糖结合蛋白质或根据步骤b)ii溶解的非磷酸化α-1，4-葡聚糖结合蛋白质彼此分离。
可以通过本领域技术人员已知的方法分离溶解的磷酸化α-1，4-葡聚糖结合蛋白质或溶解的非磷酸化α-1，4-葡聚糖结合蛋白质，例如，凝胶过滤、层析法、电泳等。优选通过SDS丙烯酰胺凝胶电泳、特别优选使用下文所述的方法(见一般方法第9条)，将磷酸化α-1，4-葡聚糖结合的溶解蛋白质或非磷酸化α-1，4-葡聚糖结合的溶解蛋白质彼此分离。
本发明的另一目的涉及鉴定具有α-1，4-葡聚糖磷酸化酶促活性且需要以磷酸化α-1，4-葡聚糖做为底物的蛋白质的方法，其中a)蛋白质提取物与磷酸化α-1，4-葡聚糖温育，b)溶解步骤a)中特异结合于磷酸化α-1，4-葡聚糖的蛋白质，c)在彼此分离的制备物中步骤b)中获得的蛋白质分别与以下物质温育i)ATP和磷酸化α-1，4-葡聚糖，以及ii)ATP和非磷酸化α-1，4-葡聚糖，d)检测步骤c)i或步骤c)ii中温育后所得的相应α-1，4-葡聚糖中引入的其他磷酸酯基，且e)鉴定蛋白质，其在步骤c)i的温育制备物中向α-1，4-葡聚糖引入了大量的磷酸酯基，而在步骤c)ii的温育制备物中并未向α-1，4-葡聚糖引入大量的磷酸酯基。
结合本发明，术语“结合活性增强”应当理解为，蛋白质对于第一种底物的亲和力比对第二种底物的亲和力增强，表现为对第一种底物的结合活性增强，即在相同温育条件下与第二种底物相比，蛋白质与第一种底物结合的量增加。
结合本发明，术语“α-1，4-葡聚糖”应当理解为主要由α-1，4-连接的葡萄糖结构单元组成的葡聚糖，但其中也可含有α-1，6-连接的分支。α-1，4-葡聚糖优选含有至多15％，尤其优选至多10％，特别优选至多5％的α-1，6-连接。
结合本发明，术语“淀粉磷酸酯”应当理解为共价连接于α-1，4-葡聚糖的葡萄糖分子上的磷酸酯基。
结合本发明，术语“非磷酸化α-1，4-葡聚糖”应当理解为不含可检测量的淀粉磷酸酯的α-1，4-葡聚糖。
结合本发明，术语“磷酸化α-1，4-葡聚糖”或“P-α-1，4-葡聚糖”应当理解为含有淀粉磷酸酯的α-1，4-葡聚糖。
基本而言，可用本发明方法鉴定的蛋白质可以来源于任何生物。该蛋白质优选来自植物生物，优选来自贮存淀粉的植物(玉米、稻、小麦、黑麦、燕麦、大麦、木薯、马铃薯、甘薯、西米、绿豆、香蕉、豌豆、拟南芥、姜黄或高粱)，尤其优选马铃薯、大麦、甜菜、拟南芥或稻植物，而特别优选拟南芥或稻植物。
在本发明方法的另一个实施方案中，蛋白质提取物来自真核细胞，优选来自植物细胞，尤其优选来自贮存淀粉的植物(玉米、稻、小麦、黑麦、燕麦、大麦、木薯、马铃薯、甘薯、西米、绿豆、香蕉、豌豆、拟南芥、姜黄或高粱)的细胞。
基本而言，所有非磷酸化α-1，4-葡聚糖均适用于实施本发明方法中的温育蛋白质提取物与非磷酸化α-1，4-葡聚糖。优选使用的是非磷酸化的植物淀粉，尤其优选小麦淀粉，特别优选拟南芥突变体sex1-3中的颗粒叶淀粉(Tien-Shin Yu等人，2001，Plant Cell 13，1907-1918)。
从植物中分离淀粉的方法为如本领域技术人员所公知。所有本领域技术人员公知的方法基本均适用于从适当的植物种系中分离非磷酸化淀粉。优选使用下文描述的方法分离非磷酸化α-1，4-葡聚糖(见一般方法第2条)。
基本而言所有含有淀粉磷酸酯的α-1，4-葡聚糖均适用于实施本发明方法中的温育蛋白质提取物与磷酸化α-1，4-葡聚糖。此处也可以使用化学磷酸化的淀粉。优选用于与蛋白质提取物温育的为植物磷酸化α-1，4-葡聚糖，尤其优选随后酶促磷酸化的植物淀粉，特别优选从拟南芥sex1-3突变体中分离的随后酶促磷酸化的植物颗粒淀粉。
可使用任何通过引入共价键向非磷酸化α-1，4-葡聚糖转移磷酸酯残基的酶，来进行随后对非磷酸化α-1，4-葡聚糖的酶促磷酸化。优选用于这一目的的是具有水葡聚糖双激酶活性的酶(R1蛋白质，E.C.02.07.09.4)(Ritte等人，2002，PNAS 99，7166-7171；Mikkelsen等人，2004，BiochemicalJournal 377，525-532)。优选用于随后非磷酸化α-1，4-葡聚糖的酶促磷酸化使用的是纯化的R1蛋白质，特别是在大肠杆菌(E.coli)中异源性表达产生的马铃薯R1蛋白质。
纯化在大肠杆菌中表达的重组产生R1蛋白质的方法见于Ritte等人(2002，PNAS 99，7166-7171)和Mikkelsen等人(2003，BiochemicalJournal 377，525-532)。
实施本发明方法时，通过将蛋白质提取物和磷酸化α-1，4-葡聚糖和/或非磷酸化α-1，4-葡聚糖共同温育，使蛋白质结合于磷酸化α-1，4-葡聚糖，可形成磷酸化α-1，4-葡聚糖-蛋白质复合体；而通过蛋白质与非磷酸化α-1，4-葡聚糖的结合可形成非磷酸化α-1，4-葡聚糖-蛋白质复合体。
实施本发明方法时，溶解磷酸化α-1，4-葡聚糖-蛋白质复合体或非磷酸化α-1，4-葡聚糖-蛋白质复合体中的蛋白质，即破坏蛋白质与相应α-1，4-葡聚糖之间的结合。从而得到溶解的磷酸化α-1，4-葡聚糖-结合蛋白质和/或溶解的非磷酸化α-1，4-葡聚糖-结合蛋白质。基本而言，所有可阻断蛋白质-α-1，4-葡聚糖相互作用存在的物质，均可用于破坏相关α-1，4-葡聚糖与结合其上的蛋白质间的结合。优选用于这一目的的是含有去污剂的缓冲溶液，尤其优选含有十二烷基硫酸钠(SDS)的缓冲溶液，特别优选下文所述的缓冲溶液(见一般方法第8条)。
可以使用任何能使α-1，4-葡聚糖与溶解物质(如蛋白质，又如温育制备物中的ATP)分离的方法，将α-1，4-葡聚糖与ATP和/或蛋白质分离。如果实施本发明方法时，将可溶性α-1，4-葡聚糖用于温育蛋白质提取物和α-1，4-葡聚糖，则该分离可包括如沉淀该α-1，4-葡聚糖，优选使用合适的溶剂进行沉淀，尤其优选使用醇进行沉淀。通过使之结合于可选择性结合α-1，4-葡聚糖的物质(如Concavalin A)的α-1，4-葡聚糖的分离也适用于将溶液中的α-1，4-葡聚糖与物质分离。
此处优选用过滤分离α-1，4-葡聚糖，尤其优选离心，特别优选为下文所述的方法(见一般方法第8条)。
实施本发明方法时，基本而言可以使用任何本领域技术人员公知的方法将可溶性蛋白质与α-1，4-葡聚糖分离，如层析法，例如沉淀及随后离心α-1，4-葡聚糖、酶消化α-1，4-葡聚糖、凝胶过滤等，这些可使可溶性蛋白质与α-1，4-葡聚糖分离的方法。优选通过离心将溶解的磷酸化α-1，4-葡聚糖-结合蛋白质和/或溶解的非磷酸化α-1，4-葡聚糖-结合蛋白质与本发明所用的α-1，4-葡聚糖分离。
在实施本发明方法的另一本发明实施方案中，通过使用Percoll垫(pad)的离心，将磷酸化α-1，4-葡聚糖-蛋白质复合体与不含于相关复合体内的蛋白质分离。
此处优选使用下文描述的方法(见一般方法第8条)，分离不与α-1，4-葡聚糖结合的蛋白质。使用Percoll垫进行离心后，不与磷酸化α-1，4-葡聚糖或不与非磷酸化α-1，4-葡聚糖结合的蛋白质位于离心基质的上清液中，而磷酸化α-1，4-葡聚糖-蛋白质复合体或非磷酸化α-1，4-葡聚糖-蛋白质复合体则位于底部的沉淀中。弃去离心基质的上清液，并洗涤沉淀(优选使用用于进一步纯化磷酸化α-1，4-葡聚糖-蛋白质复合体或非磷酸化α-1，4-葡聚糖-蛋白质复合体的温育的缓冲液)。优选洗涤沉淀一次，尤其优选洗涤两次。
基本而言，所有类型的蛋白质提取物均可用于实施本发明的鉴定具有α-1，4-葡聚糖磷酸化酶促活性并需要以磷酸化α-1，4-葡聚糖做为底物的蛋白质的方法。此处可包括所谓的蛋白质粗提取物和部分或完全纯化的蛋白质提取物。因此，例如，使用本发明用于鉴定对磷酸化α-1，4-葡聚糖的结合活性比其对非磷酸化α-1，4-葡聚糖的结合活性增强的蛋白质的方法鉴定的蛋白质更有利。使用本发明用于鉴定对磷酸化α-1，4-葡聚糖的结合活性比其对非磷酸化α-1，4-葡聚糖的结合活性增强的蛋白质的方法鉴定的蛋白质，可用于如在本发明鉴定具有α-1，4-葡聚糖磷酸化酶促活性并需要以磷酸化α-1，4-葡聚糖做为底物的蛋白质的方法中，略去步骤a)和b)而直接用于步骤c)。
基本而言，所有本领域技术人员公知的一般方法均适用于从原核或真核细胞中制备蛋白质提取物，以实施本发明方法，例如述于Scopes(1993，Protein PurificationPrinciples & Practice，ISSN038794072)。然而优选用于实施该方法的是分离植物蛋白质的方法(例如述于Bollag等人，1996，″Protein Methods″，第二版，Wiley，ISBN0-471-11837-0；Dennison，2003，“A Guide to Protein Isolation”第二版，Kluwer Academic Publishers，ISBN 1-4020-1224-1)，尤其优选下文所述的方法(见一般方法第1条)。
在分离制备物中将用于实施本发明方法的蛋白质提取物与磷酸化α-1，4-葡聚糖或非磷酸化α-1，4-葡聚糖共同温育。实施整个方法的过程中，磷酸化α-1，4-葡聚糖或非磷酸化α-1，4-葡聚糖的相关制备物分开处理。此处，分别用等量蛋白质提取物分别与等量磷酸化α-1，4-葡聚糖或非磷酸化α-1，4-葡聚糖进行温育。优选分别用1-10mg、尤其优选3-7mg、特别优选4-6mg的蛋白质提取物与磷酸化α-1，4-葡聚糖或非磷酸化α-1，4-葡聚糖进行温育。磷酸化α-1，4-葡聚糖或非磷酸化α-1，4-葡聚糖的用量优选分别为10-100mg，尤其优选30-70mg，特别优选45-55mg。
实施本发明方法时，可以使用多种缓冲液温育蛋白质提取物和磷酸化α-1，4-葡聚糖。基本而言，所有能使待鉴定蛋白质与相关物质结合的缓冲液都适用。优选使用下文所述的缓冲液(见一般方法第1条)。
结合本发明，术语“具有α-1，4-葡聚糖磷酸化酶促活性并需要以磷酸化α-1，4-葡聚糖做为底物的蛋白质”应当理解为，可以向磷酸化α-1，4-葡聚糖中共价引入磷酸酯残基、并以磷酸化α-1，4-葡聚糖为转移磷酸酯残基的底物的蛋白质，而非磷酸化α-1，4-葡聚糖并不能被所述蛋白质磷酸化，即，非磷酸化α-1，4-葡聚糖不能作为磷酸化反应的底物。
本发明鉴定具有α-1，4-葡聚糖磷酸化酶促活性并需要以磷酸化α-1，4-葡聚糖做为底物的蛋白质的方法的另一实施方案中，涉及鉴定以ATP为另一底物的蛋白质。
在本发明的该实施方案中，ATP可作为具有α-1，4-葡聚糖磷酸化酶促活性并需要以磷酸化α-1，4-葡聚糖做为底物的蛋白质的另一底物(辅被用物)，即，所述蛋白质将磷酸酯残基从ATP中转移到已经磷酸化的磷酸化α-1，4-葡聚糖上。
通过使用含有标记磷酸酯残基的ATP(标记的ATP)，可以证实以ATP为辅被用物，将磷酸酯残基转移至磷酸化α-1，4-葡聚糖的蛋白质的活性。优选特异性标记β位磷酸酯残基的ATP，即其中仅有β位的磷酸酯残基具有标记。优选使用放射性标记的ATP，尤其优选其中放射性特异性标记β位磷酸酯残基的ATP，特别优选其中β位磷酸酯残基以33P特异性标记的ATP。如果在标记ATP存在时，磷酸化α-1，4-葡聚糖磷酸化的蛋白质与磷酸化α-1，4-葡聚糖温育，则可以检测到与磷酸化α-1，4-葡聚糖共价连接的标记磷酸。此处用于磷酸化反应的磷酸化α-1，4-葡聚糖可以为含有淀粉磷酸酯的植物淀粉的形式(马铃薯淀粉、Curcuma armada、莪术(C.zedoaria)、姜黄(C.longa)、稻、绿豆、木薯等来源的淀粉)，也可以是酶促磷酸化的磷酸化α-1，4-葡聚糖或化学磷酸化的磷酸化α-1，4-葡聚糖。优选使用拟南芥叶中的淀粉，尤其优选使用由R1蛋白质酶促磷酸化的拟南芥sex1-3突变体的淀粉。
可以证实可以被蛋白质引入磷酸化α-1，4-葡聚糖中的标记磷酸酯残基，例如将标记磷酸化α-1，4-葡聚糖从剩余的反应混合物中分离(例如，通过用乙醇沉淀α-1，4-葡聚糖、过滤、层析法、离心等)，随后检测相关磷酸化α-1，4-葡聚糖级分中的标记磷酸酯残基。同时，可以通过如确定磷酸化α-1，4-葡聚糖级分中存在的放射性的量(如通过闪烁计数法)，来证实与磷酸化α-1，4-葡聚糖级分结合的标记磷酸酯残基。
在另一个实施方案中，本发明鉴定具有α-1，4-葡聚糖磷酸化酶促活性并需要以磷酸化α-1，4-葡聚糖做为底物的蛋白质的方法涉及一种方法，其中具有α-1，4-葡聚糖磷酸化酶促活性的蛋白质以磷酸化淀粉为底物。尤其优选从拟南芥sex1-3突变体中分离之后被酶促磷酸化的淀粉。因此，为实施本发明方法的这一优选实施方案，将磷酸化淀粉用于步骤c)i而非磷酸化淀粉用于步骤c)ii中。
因此，可以鉴定能磷酸化磷酸化淀粉的蛋白质。该类蛋白质特别适用于通过对合适植物进行遗传操作来修饰该植物生物中的淀粉。
本发明鉴定具有α-1，4-葡聚糖磷酸化酶促活性并需要以磷酸化α-1，4-葡聚糖做为底物的蛋白质的方法另一个实施方案中，涉及鉴定蛋白质的方法，其中该蛋白质为将磷酸酯残基转移至磷酸化α-1，4-葡聚糖过程中的磷酸化中间产物。所述中间产物优选为所述蛋白质自磷酸化形成的。
可如Ritte等人(2002，PNAS 99，7166-7171)关于R1蛋白质的描述，确定作为蛋白质介导的磷酸化α-1，4-葡聚糖磷酸化的中间产物的磷酸化蛋白质。
为了检测自磷酸化中间产物的存在，首先在不含葡聚糖的标记ATP(优选不含β磷酸位点特异性标记的ATP，尤其优选不含33P特异性标记β磷酸位点的ATP)的反应制备物1中温育蛋白质15至45分钟，尤其优选20至40分钟，特别优选25至30分钟；与之类似，反应制备物2中则含有相应量的非标记ATP以代替标记ATP，在其他条件不变的情况下温育。随后向反应混合物1中加入过量的非标记ATP，向反应混合物2中加入非标记ATP和标记ATP的混合物(其中含有与前述反应混合物1中等量的标记ATP，以及与过量加入反应混合物1中的等量非标记ATP)，再温育1-5分钟，优选再温育2-5分钟，尤其优选再温育3分钟；随后向反应混合物1的A部分(1A部分)或反应混合物2的A部分(2A部分)中加入磷酸化α-1，4-葡聚糖。通过使蛋白质变性，终止剩余1B部分和2B部分反应混合物中的反应。可以通过本领域技术人员已知的可使蛋白质变性的方法来终止反应混合物B部分，优选通过加入十二烷基硫酸钠(SDS)。再温育反应混合物的1A部分和2A部分至少10分钟后也终止其反应。将各个反应混合物的A部分或B部分中存在的α-1，4-葡聚糖与相应反应混合物的剩余部分分离。如果通过离心分离各α-1，4-葡聚糖，则离心完成后，各反应混合物中A部分或B部分中的α-1，4-葡聚糖见于沉淀颗粒中，而相应反应混合物中的蛋白质则见于各离心上清液中。然后分析反应混合物中1A部分或2A部分以及1B部分或2B部分的上清液，例如可分别进行变性丙烯酰胺凝胶电泳，随后对所得的丙烯酰胺凝胶进行放射自显影。可以使用本领域技术人员公知的如所谓“感光成像(phospho-imaging)”方法，定量通过丙烯酰胺凝胶电泳法分离的放射性标记的蛋白质。如果对反应混合物1B部分的离心上清液中的蛋白质的放射自显影或“感光成像”法分析显示，其信号相对于反应混合物1A部分离心上清液的信号显著增强，则表明介导α-葡聚糖磷酸化的蛋白质作为自磷酸化中间产物。反应混合物2的A部分和B部分用作对照，因此其离心上清液的放射自显影或“感光成像仪”分析不应当表现出显著增强的信号。
此外，必要时可在涤相应的α-1，4-葡聚糖之后，检查保留在相应沉淀颗粒中的反应混合物1和2中对应A部分的α-1，4-葡聚糖中是否存在淀粉磷酸酯，所述淀粉磷酸酯与所用的标记ATP之间有显著的对应关系。如果反应混合物1A部分的α-1，4-葡聚糖中含有标记的磷酸酯残基，且如果反应混合物1B部分的离心上清液的放射自显影相对于反应混合物1A部分的离心上清液的放射自显影信号显著增强，则表明存在作为自磷酸化中间产物的介导α-葡聚糖磷酸化的蛋白质。反应混合物2的A部分和B部分作为对照，因此其含有α-1，4-葡聚糖的沉淀颗粒内不应当表现出显著增强的33P标记的α-1，4-葡聚糖信号。
本发明鉴定具有α-1，4-葡聚糖磷酸化酶促活性并需要以磷酸化α-1，4-葡聚糖做为底物的蛋白质的方法另一个实施方案，涉及鉴定蛋白质的方法，所述蛋白质优选向磷酸化α-1，4-葡聚糖的葡萄糖分子的C-2位或C-3位引入磷酸单酯键，尤其优选C-3位。
通过如Ritte等人所述(2002，PNAS 99，7166-7171)分析由蛋白质或蛋白质提取物磷酸化的磷酸化α-1，4-葡聚糖，可以确定磷酸化α-1，4-葡聚糖中葡萄糖单体的哪一个碳原子位点(C-2、C-3或C-6)为蛋白质或蛋白质提取物的优选磷酸化位点。为此，使用酸水解被蛋白质或蛋白质提取物再度磷酸化的磷酸化α-1，4-葡聚糖，然后通过阴离子交换层析进行分析。
优选通过NMR分析由蛋白质磷酸化的磷酸化α-1，4-葡聚糖，以确定磷酸化α-1，4-葡聚糖中葡萄糖单体的哪一个碳原子位点(C-2、C-3或C-6)被磷酸化。
根据步骤b)得到的本发明鉴定具有α-1，4-葡聚糖磷酸化酶促活性并需要以磷酸化α-1，4-葡聚糖做为底物的蛋白质方法中的蛋白质，在本发明方法的步骤c)中温育于含有ATP和磷酸化α-1，4-葡聚糖或ATP和非磷酸化α-1，4-葡聚糖的分离制备物中。为实施本发明方法，优选使用含有标记的磷酸酯残基的ATP，尤其优选含有β位点的磷酸酯残基特异性标记的ATP，特别优选含有β位点的磷酸酯残基特异性放射标记的ATP。
优选在20℃至30℃的温度下、尤其优选23℃至27℃、特别优选24℃至26℃下，将本发明的溶解蛋白质与ATP及本发明方法的步骤c)i的磷酸化α-1，4-葡聚糖或本发明方法的步骤c)ii的非磷酸化α-1，4-葡聚糖共同温育至少15分钟、优选至少20分钟、尤其优选至少30分钟，其中所述方法为本发明鉴定具有α-1，4-葡聚糖磷酸化酶促活性并需要以磷酸化α-1，4-葡聚糖做为底物的蛋白质方法。用于此处的ATP的量优选至少为0.05μM、尤其优选至少3μM、特别优选至少5μM。用于此处的磷酸化α-1，4-葡聚糖或非磷酸化α-1，4-葡聚糖浓度优选为至少1mg/ml、尤其优选至少10mg/ml、特别优选至少25mg/ml。在温育完成后，可以终止蛋白质提取物与磷酸化α-1，4-葡聚糖或非磷酸化α-1，4-葡聚糖的反应。可以通过本领域技术人员已知的可使蛋白质变性的方法来分别终止反应混合物，优选通过加入十二烷基硫酸钠(SDS)并在95℃下加热5分钟来终止。当实施本发明鉴定具有α-1，4-葡聚糖磷酸化酶促活性并需要以磷酸化α-1，4-葡聚糖做为底物的蛋白质方法中的步骤c)i或c ii)时，温育蛋白质与磷酸化α-1，4-葡聚糖或非磷酸化α-1，4-葡聚糖时各温育制备物应当分别使用相同的温育条件。
实施本发明鉴定具有α-1，4-葡聚糖磷酸化酶促活性并需要以磷酸化α-1，4-葡聚糖做为底物的蛋白质方法后，对于根据步骤c)i得到的磷酸化α-1，4-葡聚糖或根据步骤c ii)得到的非磷酸化α-1，4-葡聚糖，分析额外磷酸酯残基的引入情况。为确定是否又有磷酸酯残基被引入步骤c)i或步骤c ii)中的相关α-1，4-葡聚糖，可以使用任何能特异检测出步骤c)i或步骤c ii)中所用的标记ATP中的标记的方法。例如，如果在步骤c)i或步骤c ii)中使用了放射性标记的ATP，则可通过本领域技术人员已知的检测放射性元素的方法进行检测，如放射自显影、通过适当的设备测量放射性(例如闪烁计数、“感光成像”等)。
可以通过本领域技术人员已知的方法，鉴定用于本发明鉴定具有α-1，4-葡聚糖磷酸化酶促活性并需要以磷酸化α-1，4-葡聚糖做为底物的蛋白质方法的步骤b)中的蛋白质；所述蛋白质在步骤c)i中向磷酸化α-1，4-葡聚糖中引入了大量的磷酸酯残基，而相比而言在步骤c ii)中却没有向非磷酸化α-1，4-葡聚糖中引入大量的磷酸酯残基。
结合本发明，术语“大量”应当理解为，比相应对照试验的定量高至少2倍、优选至少4倍、尤其优选至少6倍、特别优选至少8倍的量。
此处，可以使用含有完全失活的蛋白质提取物或用无蛋白质提取物代替天然蛋白质提取物的温育制备物作为对照试验。其中不能检测到α-1，4-葡聚糖磷酸化酶促活性的蛋白质提取物为“完全失活的”。
实施本发明用于鉴定相对于非磷酸化α-1，4-葡聚糖，对磷酸化α-1，4-葡聚糖的结合活性增强的蛋白质的方法时，可以使用本领域技术人员公知的方法鉴定蛋白质，例如使用包括Edmann降解、通过MALDI-TOF-MS(衬质辅助激光解吸与电离-飞行时间质谱学)进行质谱分析的方法确定相关蛋白质的氨基酸序列，随后与含有蛋白质质谱图的数据库进行比较；通过Q-TOF分析或TOF/TOF分析等进行氨基酸测序。优选通过Q-TOF-MS-MS分析鉴定相关蛋白质，尤其优选使用下文所述的方法鉴定该蛋白质(见一般方法第10条)。
如果通过MALDI-TOF-MS，然后与含有蛋白质质谱图的数据库进行比较确定蛋白质，则事先酶促消化相关蛋白质，随后通过MALDI-TOF-MS分析消化得到的蛋白质片断(肽)的单个质谱。从而得到相关蛋白质的质谱图。由于消化蛋白质用的是序列特异性的蛋白酶，该酶仅裂解处于特定氨基酸连续序列中的肽键，因此这些质谱图对于蛋白质而言非常特别。如果已知某一蛋白酶识别序列的特定氨基酸序列，那么通过计算特定蛋白酶消化其氨基酸序列后产生的肽的质量，可以从任一氨基酸序列出发建立理论性的质谱图。将使用MALDI-TOF-MS实际得到的未知蛋白质的质谱图与相应数据库中理论确定的质谱图进行比较，也可以由此确定氨基酸的序列。
在本发明鉴定具有α-1，4-葡聚糖磷酸化酶促活性并需要以磷酸化α-1，4-葡聚糖做为底物的蛋白质的方法的另一个实施方案中，将根据步骤a)温育蛋白质提取物与磷酸化α-1，4-葡聚糖而得到的磷酸化α-1，4-葡聚糖-蛋白质复合体，与未与相关α-1，4-葡聚糖结合的蛋白质分离开。
在本发明鉴定具有α-1，4-葡聚糖磷酸化酶促活性并需要以磷酸化α-1，4-葡聚糖做为底物的蛋白质的方法的另一个实施方案中，将根据本发明方法的步骤b)溶解的蛋白质，与步骤a)所用的磷酸化α-1，4-葡聚糖分开。
在本发明鉴定具有α-1，4-葡聚糖磷酸化酶促活性并需要以磷酸化α-1，4-葡聚糖做为底物的蛋白质的方法的另一个实施方案中，将实施本发明方法的步骤b)中得到的溶解的磷酸化α-1，4-葡聚糖-结合蛋白质彼此分开。
在本发明鉴定具有α-1，4-葡聚糖磷酸化酶促活性并需要以磷酸化α-1，4-葡聚糖做为底物的蛋白质的方法的另一个实施方案中，将根据步骤c)i将蛋白质提取物与磷酸化α-1，4-葡聚糖或根据步骤c)ii与非磷酸化α-1，4-葡聚糖共同温育得到的葡聚糖，与反应混合物中的蛋白质和/或反应混合物中的标记ATP分开。
此处用于分离α-1，4-葡聚糖的方法优选为过滤，尤其优选离心，特别优选下文所述的方法(见一般方法第8条)。在使用Percoll垫进行离心后，反应混合物中的可溶性物质留在离心介质的上清液中，而α-1，4-葡聚糖则位于沉淀颗粒中。
本发明鉴定具有α-1，4-葡聚糖磷酸化酶促活性并需要以磷酸化α-1，4-葡聚糖做为底物的蛋白质的方法的另一个实施方案，涉及鉴定蛋白质的方法，所述蛋白质的氨基酸序列分子量为120kDa至145kDa，优选120kDa至140kDa，尤其优选125kDa至140kDa，特别优选130kDa至135kDa。
在本发明用于鉴定蛋白质的另一实施方案中，鉴定相关蛋白质后，确定编码这些蛋白质的氨基酸序列。
根据本发明，可以使用任何本领域技术人员公知的方法确定氨基酸序列。此类方法详述于专业文献中(例如Protein Sequencing andIdentification Using Tandem Mass Spectrometry，2000，John Wiley & SonsInc，ISBN0-471-32249-0；Protein Sequencing Protocols，2002，Smith(编著)，第二版，Humana Press，ISBN0-89603-975-7)，且基本适用于实施本发明的方法。而且，很多公司也提供作为协议服务的蛋白质纯化和/或测序(如Eurogentec，Searing，Belgium)。
必要时，在确定其氨基酸序列之前，可以对本发明鉴定蛋白质方法中使用的蛋白质进行进一步的纯化和/或浓缩。纯化和/或浓缩蛋白质的方法详述于专业文献中(如Methods inEnzymologyGuide to ProteinPurification，第182卷1990，Deutscher，Murray P.(编著)，Academic Press，ISBN0-12-182083-1；Isolation and Purification of ProteinsHatti-Kaul，2003，Rajni(编著)；Mattiasson，Bo(编著)，Marcel Dekker Inc，ISBN0-8247-0726-5，Protein Purification TechniquesA Practical Approach.Roe，2001，Simon(编著).The Practical Approach Series，244.第二版.OxfordUniv Press，ISBN0-19-963673-7)，且基本适用于实施本发明的方法。
本发明用于鉴定蛋白质的另一实施方案中，使用了本发明鉴定编码氨基酸序列中含有磷酸组氨酸结构域的蛋白质的方法(Tien-Shin Yu等人，2001，Plant Cell 13，1907-1918)。该磷酸组氨酸结构域优选与拟南芥OK1蛋白质及稻(Oryza sativa)的磷酸组氨酸结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO5)具有至少50％的同一性，特别是至少60％，优选至少70％，尤其优选至少80％，特别优选至少90％的同一性。
本发明用于鉴定蛋白质的另一实施方案中，使用了本发明鉴定编码氨基酸序列中含有磷酸组氨酸结构域的蛋白质的方法(Tien-Shin Yu等人，2001，Plant Cell 13，1907-1918)，其中该磷酸组氨酸结构域含有两个组氨酸。
使用本发明方法，可以鉴定对磷酸化α-1，4-葡聚糖的结合活性比其对非磷酸化α-1，4-葡聚糖的结合活性增强的蛋白质。
使用本发明方法，可以鉴定具有α-1，4-葡聚糖磷酸化酶促活性并需要以磷酸化α-1，4-葡聚糖做为底物的蛋白质。
因此，通过本发明鉴定蛋白质的方法得到的蛋白质也是本发明的目的。
鉴定具有α-1，4-葡聚糖磷酸化酶促活性的蛋白质的编码核酸的方法是本发明的另一个目的，其中a)使用本发明鉴定蛋白质的方法鉴定蛋白质，b)确定步骤a)中所鉴定蛋白质的氨基酸序列，并c)使用步骤b)中确定的氨基酸，鉴定步骤a)中所鉴定蛋白质的编码核酸。
可以通过如上文所述的本领域技术人员公知的方法，确定使用本发明方法鉴定的蛋白质的氨基酸序列。
在根据本发明鉴定编码具有α-1，4-葡聚糖磷酸化酶促活性的蛋白质的核酸方法的步骤b)确定的氨基酸序列的基础上，可以鉴定具有α-1，4-葡聚糖磷酸化酶促活性的蛋白质的编码核酸。
可以通过例如搜索那些可用的数据库，来鉴定具有α-1，4-葡聚糖磷酸化酶促活性的蛋白质的编码核酸，例如通过EMBL(http://www.ebi.ac.uk/Tools/index.htm)或NCBI(National Center forBiotechnology Information，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。此处预先设置实施本发明方法时确定的一个或多个氨基酸序列为所谓的查询。随后通过统计学计算机程序将这一查询序列与所选数据库中的序列进行比较。该类数据库查询(例如blast或fasta查询)为本领域技术人员所公知，可通过很多提供者进行。
如果在如NCBI(National Center for Biotechnology Information，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上进行数据库查询，则应当使用具体比较特异要求的标准设置。对于蛋白质序列比较(blastp)的设置如下Limit entrez＝不活化(not activated)；过滤器(Filter)＝活化的低复杂性(low compexityactivated)；期望值(Expect value)＝10；字长(word size)＝3；矩阵(Matrix)＝BLOSUM62；缺口成本(Gap costs)存在(Existence)＝11，延伸(Extension)＝1。
在此类数据库查询中，可以使用如在实施本发明方法时，在本发明中确定的氨基酸序列作为查询序列，以鉴定编码具有α-1，4-葡聚糖磷酸化酶促活性的蛋白质的核酸分子。
使用所述的方法，也可以鉴定与使用本发明方法获得的编码具有α-1，4-葡聚糖磷酸化酶促活性蛋白质的核酸分子和/或蛋白质具有高度同一性的核酸分子和/或氨基酸序列。
从氨基酸序列出发鉴定其编码核酸的方法为本领域技术人员所公知(见如Sambrok等人，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第3版(2001)Cold Spring Harbour Laboratory Press，Cold Spring Harbour，NY.ISBN0879695773，Ausubel等人，Short Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons；第5版(2002)，ISBN0471250929)。从编码具有α-1，4-葡聚糖磷酸化酶促活性蛋白质的氨基酸序列出发，可以根据遗传密码得出编码该相关氨基酸序列的核酸。本领域技术人员公知，由遗传密码得到的简并寡核苷酸一般也可用于鉴定核酸。随后可以合成寡核苷酸，其组成来自实施本发明方法得到的氨基酸序列的序列。这些合成的寡核苷酸可以用于鉴定蛋白质的编码核酸，所述蛋白质的氨基酸序列即为相应寡核苷酸序列。通过如以所述合成寡核苷酸为标记探针，以杂交探针的形式搜索基因库可以达到此目的。另一种鉴定具有α-1，4-葡聚糖磷酸化酶促活性蛋白质的编码核酸的可能方法，包括使用实施本发明方法得到的氨基酸序列来源的合成寡核苷酸、通过采用基于PCR的方法搜索基因库，其中所述合成寡核苷酸用作所谓的“引物”。基因库可以如黏端质粒、噬粒(phagmid)、质粒、YAC或BAC的形式存在。DNA文库可含有基因组DNA及cDNA。对于使用所谓的RT(逆转录)PCR的基于PCR的搜索方法而言，也可以使用mRNA。此处用于实施本发明在基因库中鉴定核酸或mRNA形式核酸的方法的核酸，可以来自任何生物，优选来自真核生物，尤其优选来自植物，特别优选来自谷物。
对于实施本发明鉴定具有α-1，4-葡聚糖磷酸化酶促活性的蛋白质的编码核酸的方法，并不需要在本发明方法的步骤b)中确定编码相关蛋白质的全部氨基酸序列，只需要确定编码相关蛋白质的部分相关氨基酸序列。
本发明的另一实施方案涉及鉴定具有α-1，4-葡聚糖磷酸化酶促活性的蛋白质的编码核酸的方法，其中a)使用本发明鉴定蛋白质的方法鉴定蛋白质，b)确定步骤a)中鉴定的蛋白质的编码氨基酸序列，c)从步骤b)中确定的氨基酸序列开始合成寡核苷酸，且d)使用步骤c)中合成的寡核苷酸鉴定步骤a)中鉴定的蛋白质的编码核酸。
本发明的另一目的涉及鉴定具有α-1，4-葡聚糖磷酸化酶促活性的蛋白质的编码核酸的方法，其中a)使用本发明鉴定蛋白质的方法鉴定蛋白质，b)制备与步骤a)中鉴定蛋白质特异性反应的抗体，且c)使用根据步骤b)确定的抗体鉴定核酸。
制备可与某一蛋白质特异性反应的抗体(即可与所述蛋白质特异性结合)方法为本领域技术人员所公知(参见如Lottspeich和Zorbas(编著)，1998，Bioanalytik，Spektrum akad.Verlag，Heidelberg，柏林，ISBN 3-8274-0041-4)。一些公司(如Eurogentec，Belgium)以协议服务提供此类抗体的制备。
使用抗体鉴定核酸的方法在专业文献中常称为“免疫筛选”(见如Lottspeich和Zorbas(编著)，1998，Bioanalytik，Spektrum a kad.Verlag.，Heidelberg，柏林，ISBN 3-8274-0041-4)，为本领域技术人员公知并详细描述于文献中。如所谓的表达基因文库可用于实施此类方法，其中使用针对某一蛋白质的特异性抗体筛查得到的克隆，寻找该蛋白质的表达。可以购买制备此类表达基因文库的材料，包括有关制备和搜索此类表达基因文库的方法的说明书(如Stratagene)。
使用本发明方法可以鉴定相对于非磷酸化α-1，4-葡聚糖，对磷酸化α-1，4-葡聚糖的结合活性增强的蛋白质和/或具有α-1，4-葡聚糖磷酸化酶促活性并需要以磷酸化α-1，4-葡聚糖做为底物的蛋白质的编码核酸。
因此，根据本发明鉴定核酸的方法获得的核酸也是本发明的目的。
根据布达佩斯条约，含编码拟南芥来源的本发明蛋白质(A.t.-OK1)cDNA的质粒(A.t.-OK1-pGEM)，在2004年3月8日保藏在德意志微生物保藏中心(German Collection of Microorganism and Cell CulturesGmbH，Mascheroder Weg 1b，38124 Braunschweig，德国)，保藏号为DSM16264，含有编码稻来源的另一本发明的蛋白质(O.s.-OK1)的cDNA的质粒(pMI50)在2004年3月24日保藏在德意志微生物保藏中心，保藏号为DSM16302。
令人惊异的是，经遗传修饰而本发明蛋白质活性增强的植物细胞或植物可合成改性的淀粉，相对于野生型植物细胞或野生型植物合成的淀粉，所述淀粉的物理-化学特性、尤其是淀粉磷酸酯含量或磷酸酯的分布改变，因而其更适于特殊应用。
因此，本发明的另一目的涉及经遗传修饰的植物细胞或经遗传修饰的植物，其特征在于相对于其未经遗传修饰的相应野生型植物细胞或野生型植物而言，它们中本发明蛋白质的酶促活性增强。
此处的遗传修饰可以为任何可使本发明的至少一种蛋白质活性相对于未经遗传修饰的其相应野生型植物细胞或野生型植物增强的遗传修饰。
结合本发明，术语“野生型植物细胞”是指，以所述植物细胞作为制备本发明植物细胞的原材料，即，除了引入的遗传修饰，其遗传信息与本发明植物细胞相应。
结合本发明，术语“野生型植物”是指，以所述植物细胞作为制备本发明植物的原材料，即，除了引入的遗传修饰，其遗传信息与本发明植物相应。
结合本发明，术语“相应”是指在几种对象的比较中，相互比较的有关对象保持在相同条件下。结合本发明，术语“相应”与野生型植物细胞或野生型植物连用，表示这些互相比较的植物细胞或植物是在相同的培养条件下生长并具有相同的(培养)年龄。
本发明的术语“增强的活性”在此处是指编码本发明蛋白质的内源性基因表达增强和/或细胞中本发明的蛋白质的量增加和/或细胞中本发明蛋白质的酶促活性增强。
可以通过如测量编码本发明蛋白质的转录物的量，来确定表达的增强，例如使用Northern印迹分析或RT-PCR。此处优选使用本发明鉴定核酸的方法鉴定的核酸分子，以确定本发明中蛋白质表达的增强。此处的增强优选指相对于未经过遗传修饰的相应细胞而言，转录物的量增加了至少50％、尤其至少70％，优选至少85％、尤其优选至少100％。编码本发明蛋白质的转录物的量增加也指，无法检测到编码本发明蛋白质转录物量的植物经过本发明的遗传修饰后，其中编码本发明蛋白质转录物的量能够检测到。
本发明蛋白质的蛋白质量增加使相关植物细胞内该蛋白质的活性增强，可以通过如免疫学方法确定，如Western印迹分析、ELISA(酶联免疫吸附测定)或RIA(放射免疫测定)。用于通过免疫学方法测量蛋白质的量增加的抗体的制备的实例见于下文(见实施例11)。此处的增加优选指相对于未经过遗传修饰的相应细胞而言，本发明蛋白质的量增加了至少50％、尤其至少70％，优选至少85％、尤其优选至少100％。本发明蛋白质的量增加也指，不可检测到本发明蛋白质的量的植物经过本发明的遗传修饰后，其中本发明蛋白质的量能够检测到。
同样令人惊异的是，经过遗传修饰而本发明蛋白质活性降低的植物细胞或植物可以合成改性的淀粉，相对于野生型植物细胞或野生型植物合成的淀粉，所述淀粉的物理-化学特性、尤其是其中淀粉磷酸酯含量或磷酸酯的分布改变，因而其更适于特殊应用。
因此，本发明的另一目的涉及经遗传修饰的植物细胞或经遗传修饰的植物，其特征在于相对于其未经遗传修饰的相应野生型植物细胞或野生型植物而言，它们中本发明蛋白质的酶促活性降低。
本发明蛋白质活性降低的植物具有高淀粉(淀粉过量)表型。此外，本发明蛋白质活性降低的植物相对于野生型植物生长正常，即这些植物的生长并不因其内本发明蛋白质活性降低而受阻。因此，本发明蛋白质活性降低的植物适于农业培育，因为它们含有更多淀粉故而含有更多糖类，同时其生长速度并未降低。
因此，本发明也涉及本发明的淀粉过量表型的植物细胞和植物。在黑暗阶段结束时，本发明的植物细胞以及本发明的植物叶中的淀粉比相应野生型植物细胞或野生型植物中的高至少2倍、优选至少4倍、尤其优选至少6倍而特别优选至少8倍。
在光照阶段结束时，本发明的植物细胞以及本发明的植物叶中的淀粉比相应野生型植物细胞或野生型植物中的高至少1.2倍、优选至少1.5倍、尤其优选至少1.8倍而特别优选至少2倍。
可以通过多种本领域技术人员公知的方法制备本发明的植物细胞以及本发明的植物，所述植物细胞及植物中本发明蛋白质的活性降低。这些方法的实例包括，表达相应的反义RNA或双链RNA构建体、制备具有共抑制作用的分子或载体、表达相应构建的可特异性切割编码本发明蛋白质转录物的核酶，或所谓的“体内诱变”。此外，还可以通过同时表达需抑制的相应靶基因(优选OK1基因)的正义和反义RNA分子，降低植物细胞或植物中本发明蛋白质的活性。
此外也已知，植物内(in planta)合成启动子序列的反式双链RNA分子会导致该启动子同源拷贝的甲基化和转录失活(Mette等人，EMBO J.19，(2000)，5194-5201)。
降低植物细胞及植物中蛋白质酶促活性的另一种可能方法是所谓的免疫调节方法。已知可特异识别植物蛋白质的抗体在植物内的表达会导致蛋白质抗体复合体的形成，从而使相应植物细胞中相关蛋白质的活性降低(Conrad和Manteufel，Trends in Plant Science 6，(2001)，399-402；DeJaeger等人，Plant Molecular Biology 43，(2000)，419-428；Jobling等人，Nature Biotechnology 21，(2003)，77-80)。
所有这些方法都基于向植物细胞或植物的基因组中引入一个或多个外源性核酸分子，因此基本上适于制备本发明的植物细胞以及本发明的植物。
在本发明的另一实施方案中，本发明的植物细胞或本发明的植物包括贮存淀粉的植物的植物细胞或贮存淀粉的植物。贮存淀粉的植物的实例如玉米、稻、小麦、黑麦、燕麦、大麦、木薯、马铃薯、甘薯、西米、绿豆、香蕉、豌豆、拟南芥、姜黄或高粱植物。尤其优选稻，特别优选小麦植物。
本发明的另一实施方案涉及本发明的经遗传修饰的植物细胞或本发明的经遗传修饰的植物，其中遗传修饰包括向该植物基因组中引入至少一个外源性核酸分子。
本文中术语“遗传修饰”是指，向植物细胞基因组或植物基因组中引入同源性和/或异源性外源核酸分子，其中所述分子的引入导致本发明蛋白质活性的增强或降低。
通过引入外源性核酸分子，修饰本发明植物细胞或本发明植物的相关遗传信息。外源性核酸分子的存在或表达导致表型的改变。此处的“表型”改变优选指细胞的一项或多项功能的可测性改变。例如，由于引入核酸分子的存在或表达，本发明经遗传修饰的植物细胞或本发明经遗传修饰的植物中本发明蛋白质的活性增强或降低。
结合本发明，术语“外源性核酸分子”应理解为一种分子，所述分子不天然存在于相应野生型植物细胞内，或野生型植物细胞中不天然存在其特异空间排列，或其在野生型植物细胞基因组的定位不天然存在。优选的外源性核酸分子为重组分子，所述分子由不同元件组成，其组合或特异性空间排列不天然存在于植物细胞中。
原则上而言，外源性核酸分子可以为能够在物细胞或植物中造成本发明蛋白质活性增强的任何核酸分子。
结合本发明，术语“基因组”应理解为植物细胞中存在的遗传物质的总和。本领域技术人员公知，除了细胞核以外，其他区室内(如质体、线粒体)也含有遗传物质。
本发明的优选实施方案涉及本发明的经遗传修饰的植物细胞或本发明的经遗传修饰的植物，其中该遗传修饰包括向该植物基因组中引入至少一个外源性核酸分子，且该外源性核酸分子编码本发明的蛋白质。
本发明的另一实施方案涉及本发明的经遗传修饰的植物细胞或本发明的经遗传修饰的植物，其中该遗传修饰包括向该植物基因组中引入至少一个外源性核酸分子，且其中该外源性核酸分子包括本发明的核酸分子，优选从拟南芥中分离的本发明核酸分子，尤其优选从稻中分离的本发明核酸分子。
许多技术可用于向植物宿主细胞中引入DNA。这些技术包括，以根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或者发根土壤杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)为转化介质通过T-DNA转化植物细胞、原生质体融合、注射、DNA电穿孔、通过生物射弹方法引入DNA，以及其他方法。
使用土壤杆菌介导的植物细胞转化已经得到了深入研究，并详述于EP120516；Hoekema，The Binary Plant Vector System OffsetdrukkerijKanters B.V.，Alblasserdam(1985)，第五章；Fraley等人，Crit.Rev.PlantSci.4，1-46以及An等人.EMBO J.4，(1985)，277-287。转化马铃薯的实例可见Rocha-Sosa等人，EMBO J.8，(1989)，29-33。
基于土壤杆菌转化，通过载体的单子叶植物转化也已见描述(Chan等人，Plant Mol.Biol.22，(1993)，491-506；Hiei等人，Plant J.6，(1994)271-282；Deng等人，Science in China 33，(1990)，28-34；Wilmink等人，Plant Cell Reports 11，(1992)，76-80；May等人，Bio/Technology 13，(1995)，486-492；Conner和Domisse，Int.J.Plant Sci.153(1992)，550-555；Ritchie等人，Transgenic Res.2，(1993)，252-265).153(1992)，550-555；Ritchie等人，Transgenic Res.2，(1993)，252-265)。单子叶植物转化的另一个系统是通过生物射弹方法转化(Wan和Lemaux，Plant Physio.104，(1994)，37-48；Vasil等人，Bio/Technology 11(1993)，1553-1558；Ritala等人，Plant Mol.Biol.24，(1994)，317-325；Spencer等人，Theor.Appl.Genet.79，(1990)，625-631)、原生质体转化、电穿孔部分通透细胞以及通过玻璃纤维引入DNA。特别是玉米的转化已经在文献中多次描述(参阅，如W095/06128、EP0513849、EP0465875、EP0292435；Fromm等人，Biotechnology 8，(1990)，833-844；Gordon-Kamm等人，Plant Cell 2，(1990)，603-618；Koziel等人，Biotechnology 11(1993)，194-200；Moroc等人，Theor.Appl.Genet.80，(1990)，721-726)。
也已经描述了其他类型谷类的成功的转化，例如大麦(Wan和Lemaux，见上；Ritala等人，见上；Krens等人，Nature 296，(1982)，72-74)，及小麦(Nehra等人，Plant J.5，(1994)，285-297)。所有上述方法在本发明范围内均适用。
除了其他方法以外，由于本发明植物细胞和本发明植物含有非天然存在于野生型植物细胞或野生型植物中的外源性核酸分子；或者由于该分子整合在本发明植物细胞基因组或本发明植物基因组中的某一位点，而在野生型植物细胞或野生型植物中不会天然存在于此位点，即，处在不同的基因组环境中，可以将本发明植物细胞和本发明植物分别与野生型植物细胞和野生型植物区分开，此外，此类本发明的植物细胞和本发明的植物与野生型植物细胞和野生型植物的不同之处还在于，除了野生型植物细胞或野生型植物中该分子的天然拷贝外，它们还可能有至少一个拷贝的外源性核酸分子稳定整合于其基因组中。如果引入本发明植物细胞或本发明植物的该一个或多个外源性核酸分子分别为野生型植物细胞或野生型植物中已经天然存在分子的额外拷贝，则可以将本发明植物细胞和本发明植物分别与野生型植物细胞和野生型植物区分开，尤其是该一个或多个额外拷贝在基因组中的位置并非它或它们在野生型植物细胞或野生型植物中天然存在的位置的情况。这一点可以通过如Southern印迹分析证实。
此外，优选根据至少一条以下特征，将本发明植物细胞和本发明植物分别与野生型植物细胞和野生型植物区分开如果引入的外源性基因对于植物细胞或植物而言是异源性的，则本发明植物细胞和本发明植物中含有引入核酸分子的转录物。这些可以通过如Northern印迹分析或RT-PCR(反转录聚合酶链式反应)证实。本发明蛋白质活性增强的本发明植物细胞和本发明植物中优选含有由引入核酸分子编码的蛋白质。可以通过免疫学方法、特别是通过如Western印迹分析来证明。相对于未经遗传修饰的相应野生型植物细胞或野生型植物而言，本发明蛋白质活性降低的本发明植物细胞和本发明植物使用所述免疫学方法检测时，其相关蛋白质的量下降。
如果引入的外源性基因对于植物细胞或植物而言是同源的，则可以通过如引入的外源性核酸分子的额外表达将本发明植物细胞和本发明植物分别与野生型植物细胞和野生型植物区分开。本发明植物细胞和本发明植物优选含有外源性核酸分子的转录物。这一点可以通过如Northern印迹分析或所谓的定量PCR来证实。
在具体的实施方案中，本发明的植物细胞和本发明的植物分别为转基因植物细胞或转基因植物。
在本发明的另一实施方案中，相对于从野生型植物细胞或野生型植物中分离的未经遗传修饰的淀粉而言，本发明的植物细胞和本发明的植物合成改性的淀粉。
结合本发明，术语“改性的淀粉”是指该淀粉相对于自相应野生型植物细胞或野生型植物中得到的未经遗传修饰的淀粉而言，具有改变的物理-化学特性。
在另一实施方案中，本发明的植物细胞或本发明的植物合成改性的淀粉，所述淀粉与相应野生型植物细胞或野生型植物中分离的淀粉相比，其淀粉磷酸酯含量增加和/或磷酸酯分布改变。
在本发明方法的另一实施方案中，本发明的植物细胞或本发明的植物合成改性的淀粉，与相应的未经遗传修饰野生型植物细胞或未经遗传修饰的植物中的淀粉相比，所述淀粉的淀粉磷酸酯的C-3/C-6的比例改变。此处尤其优选淀粉，其中结合于C-3位的淀粉磷酸酯与结合于C-6位的淀粉磷酸酯的比例比未经遗传修饰的野生型植物细胞或未经遗传修饰的植物中的相应淀粉高。
结合本发明，术语“磷酸酯分布”应理解为，结合于葡萄糖分子C-2位、C-3位或C-6位的淀粉磷酸酯分别占α-1，4-葡聚糖的淀粉磷酸酯总含量的比例。
结合本发明，术语“C-2/C-3/C-6比例”应理解为，基于相关α-1，4-葡聚糖中淀粉磷酸酯的总含量(C-2位+C-3位+C-6位)，α-1，4-葡聚糖中分别结合于C-2位、C-3位或C-6位的淀粉磷酸酯所占的比例。
结合本发明，术语“C-3/C-6比例”应理解为，基于相关α-1，4-葡聚糖中结合于C-3位和C-6位的淀粉磷酸酯的总和(C-3位+C-6位)，α-1，4-葡聚糖中分别结合于C-3位和C-6位的淀粉磷酸酯所占的比例。
本发明的另一目的是合成改性淀粉的本发明的植物细胞或本发明的植物，其中该改性淀粉的特征在于，其中共价结合于淀粉中葡萄糖分子C-3位上的磷酸酯含量高于相应的野生型植物细胞或野生型植物中的淀粉。
本发明的另一目的是含有本发明植物细胞的植物。
序列描述SEQ ID NO 1含有拟南芥A.t.-OK1蛋白质编码区的核酸序列。该序列插入载体OK1-pGEM-T和OK1-pDESTTM17中。
SEQ ID NO 2编码拟南芥A.t.-OK1蛋白质的氨基酸序列。该序列可得自如SEQ ID NO 1所示的核酸序列。
SEQ ID NO 3含有稻(Oryza sativa)O.s.-OK1蛋白质编码区的核酸序列。该序列插入载体MI50中。
SEQ ID NO 4编码稻O.s.-OK1蛋白质的氨基酸序列。该序列可得自如SEQ ID NO 3所示的核酸序列。
SEQ ID NO 5编码拟南芥、稻和两色粟黍中OK1蛋白质的磷酸组氨酸结构域的肽序列。
SEQ ID NO 6编码大麦H.v-OK1蛋白质的氨基酸序列所含的肽序列。
SEQ ID NO 7编码大麦H.v-OK1蛋白质的氨基酸序列所含的肽序列。
SEQ ID NO 8编码大麦H.v-OK1蛋白质的氨基酸序列所含的肽序列。
SEQ ID NO 9编码大麦H.v-OK1蛋白质的部分核酸序列。通过TIGR数据库中的“Blast检索”功能，使用SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 7和SEQID NO 8所示的肽序列，已对该核酸序列进行了鉴定。
SEQ ID NO 10编码大麦H.v-OK1蛋白质的部分氨基酸序列。所示氨基酸序列可得自SEQ ID NO 9所示的核酸序列。
SEQ ID NO 11编码马铃薯S.t-OK1蛋白质的氨基酸序列所含的肽序列。
SEQ ID NO 12编码马铃薯S.t-OK1蛋白质的氨基酸序列所含的肽序列。
SEQ ID NO 13编码马铃薯S.t-OK1蛋白质的氨基酸序列所含的肽序列。
SEQ ID NO 14编码马铃薯S.t-OK1蛋白质的氨基酸序列所含的肽序列。
SEQ ID NO 15编码马铃薯S.t-OK1蛋白质的部分核酸序列。通过TIGR数据库中的“Blast检索”功能，使用SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 12、SEQ ID NO 13和SEQ ID NO 14所示的肽序列，已对该核酸序列进行了鉴定。
SEQ ID NO 16编码马铃薯S.t-OK1蛋白质的部分氨基酸序列。所示氨基酸序列可得自SEQ ID NO 15所示的核酸序列。
SEQ ID NO 17编码黍S.b-OK1蛋白质的氨基酸序列所含的肽序列。
SEQ ID NO 18编码黍S.b-OK1蛋白质的氨基酸序列所含的肽序列。
SEQ ID NO 19编码黍S.b-OK1蛋白质的氨基酸序列所含的肽序列。
SEQ ID NO 20编码黍S.b-OK1蛋白质的氨基酸序列所含的肽序列。
SEQ ID NO 21编码黍S.b-OK1蛋白质的部分核酸序列。通过TIGR数据库中的“Blast检索”功能，使用SEQ ID NO 17、SEQ ID NO 18、SEQID NO 19和SEQ ID NO 20所示的肽序列，已对该核酸序列进行了鉴定。
SEQ ID NO 22编码黍S.b-OKI蛋白质的部分氨基酸序列。所示氨基酸序列可得自SEQ ID NO 21所示的核酸序列。
SEQ ID NO 23编码小麦T.a-OK1蛋白质的氨基酸序列所含的肽序列。
SEQ ID NO 24编码小麦T.a-OK1蛋白质的氨基酸序列所含的肽序列。
SEQ ID NO 25编码小麦T.a-OK1蛋白质的部分核酸序列。通过TIGR数据库中的“Blast检索”功能，使用SEQ ID NO 23和SEQ ID NO24所示的肽序列，已对该核酸序列进行了鉴定。
SEQ ID NO 26编码小麦T.a-OK1蛋白质的部分氨基酸序列。所示氨基酸序列可得自SEQ ID NO 25所示的核酸序列。
附图描述

图1鉴定拟南芥蛋白质的变性丙烯酰胺凝胶，与磷酸化淀粉相比，该蛋白质优选结合非磷酸化淀粉。标准蛋白质分子量标准参照物以迹线“M”表示。温育来自实施例1d)中的对照制备物C后所得的蛋白质以迹线“_”表示。分离自拟南芥sex1-3突变体叶的非磷酸化淀粉温育后得到的拟南芥蛋白质提取物(制备物B，实施例1d))以迹线“K”表示。与分离自拟南芥sex1-3突变体叶的淀粉温育、然后由R1蛋白质在体外额外磷酸化得到的拟南芥蛋白质提取物(制备物A，实施例1d))，以迹线“P”表示。电泳结束后，用考马斯蓝对丙烯酰胺凝胶染色。
图2显示OK1蛋白质的自磷酸化活性。图2A)所示为电泳后考马斯蓝染色的变性(SDS)丙烯酰胺凝胶。图2B)所示为变性(SDS)丙烯酰胺凝胶的放射性自显影。在两种胶上分别加入等量的相同样品。M标准蛋白质分子量标准参照物；R1实施例7中反应容器1内的样品(将OK1蛋白质与ATP共同温育后)；R2实施例7中反应容器2内的样品(在OK1蛋白质与ATP共同温育后将蛋白质加热至95℃)；R3实施例7中反应容器3内的样品(OK1蛋白质与ATP共同温育后，于0.5M HCl中温育蛋白质)；R4实施例7中反应容器4内的样品(OK1蛋白质与ATP共同温育后，于0.5M NaOH中温育蛋白质)。
图3显示OK1蛋白质的淀粉磷酸化活性(见实施例6)。将OK1蛋白质与分离自拟南芥sex1-3突变体叶的非磷酸化淀粉(制备物A)，以及分离自拟南芥sex1-3突变体叶并由R1蛋白质在体外回溯性磷酸化的淀粉(制备物B)共同温育。制备物C与制备物B相同，只是该制备物C温育时无OK1蛋白质。对于每一制备物(A、B、C)进行两次独立测试(测试1和测试2)。引入非磷酸化淀粉(制备物A)和磷酸化淀粉(制备物B)的33p标记的磷酸的相应量，以cpm计(每分钟计数)显示如图。
图4淀粉葡萄糖分子内分别由R1蛋白质和OK1蛋白质磷酸化的C原子的位置的比较(见实施例9)。OK1蛋白质(制备物A)在33P标记的ATP中，与分离自拟南芥sex1-3突变体叶并由R1蛋白质在体外回溯性磷酸化的淀粉共同温育。R1蛋白质(制备物B)在33P标记的ATP中，与分离自拟南芥sex1-3突变体叶的淀粉共同温育。温育完成后对淀粉进行彻底水解，使用HPAE层析分离获得的水解产物。分离前向水解产物中加入葡萄糖-6-磷酸和葡萄糖-3-磷酸作为标准。通过HPAE层析分离的水解产物以单独级分收集。加入的葡萄糖-6-磷酸与级分15一同洗提，而加入的葡萄糖-3-磷酸与级分17一同洗提取。随后检查得到级分中是否存在放射性标记的磷酸。图示为各个级分中测得的由OK1蛋白质或R1蛋白质引入磷酸化淀粉水解产物中的33P标记的磷酸的量，以cpm(每分钟计数)表示。
图5显示OK1蛋白质的自磷酸化。图5A)显示Western印迹。图5B)显示变性(SDS)丙烯酰胺凝胶的放射自显影。向两块胶上加入等量的相同样品。OK1蛋白质与随机放射性标记的ATP或在γ位上特异性标记放射性的ATP共同温育。温育完成后，将蛋白质加热至30℃或95℃，或分别温育于0.5M NaOH或0.5M HCl中。
图6显示在OK1蛋白质催化的反应中ATP中β磷酸酯残基向淀粉的转移。在γ位用33P特异标记的ATP或者随机化的33PATP用于通过OK1蛋白质来磷酸化淀粉，该淀粉已经通过R1蛋白质在体外磷酸化并且从拟南芥sex1-3突变体的叶子分离。任何称为“对照”的试验中都不加入OK1蛋白质。每一制备物独立检测两次。所示为两次检测的结果。
图7使用抗拟南芥OK1蛋白质的抗体进行植物蛋白质提取物的Western印迹分析。显示了下列植物叶中的蛋白质提取物Ara，拟南芥；51、54、55、67、72、73、79、62、63、64、65、69、66、68为385JH转化株的独立种系；D，野生型马铃薯cv Désirée。
一般方法以下描述了可用于实施本发明方法的方法。这些方法组成了本发明的具体实施方案，但本发明并不仅限于这些实施方案。本领域技术人员知道，通过修饰所述方法和/或通过用所述方法的备选部分替换这些方法的各自部分，可以以相同方式完成本发明。
1.从植物组织制备蛋白质提取物a)从植物组织制备蛋白质提取物收集叶材料后立即在液氮中冷冻，随后在液氮条件下用研钵匀浆。研碎的叶材料与约3.5倍量(相对于所用叶材料的重量而言)的冷(4℃)结合缓冲液混合，并使用Ultraturrax(最高速)浸软2×10秒。在第一次用Ultraturrax处理后，将研碎的叶材料冰上冷却直至进行第二次处理。使处理后的叶材料通过100μm尼龙网，并离心20分钟(50ml离心试管，20,000×g，4℃)。
b)沉淀蛋白质提取物中所含的蛋白质移去根据步骤a)离心所得的上清液并测量其体积。为沉淀蛋白质，在冰上搅拌下30分钟内向上清液中连续硫酸铵至终浓度为75％(重量/体积)。随后将上清液在冰上搅拌下再温育1小时。从上清液沉淀的蛋白质以20,000×g在4℃下沉降10分钟，随后将沉淀溶解于5ml结合缓冲液中，即将沉淀中的蛋白质溶解。
c)沉淀蛋白质的脱盐在温度4℃下，使用填充Sephadex G25的PD10柱(AmershamBioscience，Freiburg，柱产品号17-0851-01，Sephadex G25-M产品号17-0033-01)使溶解的蛋白质脱盐，即将步骤b)中用于沉淀的硫酸铵从溶解蛋白质中分离出去。在加入如步骤b)中溶解的蛋白质之前，先用结合缓冲液平衡PD10柱。为此，每次使用5ml结合缓冲液分布全柱。然后向每柱中加入2.5ml如步骤b)得到的蛋白质溶液，随后用3.5ml结合缓冲液将蛋白质从柱上洗脱下来。
d)确定蛋白质浓度使用Bradford测定法(Biorad，Munich，产品号500-0006(Bradford，1976，Anal.Biochem.72，248-254))确定蛋白质浓度。
e)结合缓冲液的组分结合缓冲液50mM HEPES/NaOH(或KOH)，pH 7.21mMEDTA2mM二硫赤藓糖醇(DTE)2mM苯甲脒2mMε-氨基己酸0.5mM PMSF0.02％ Triton X-1002.分离叶淀粉a)从植物组织中分离淀粉颗粒收集叶材料后立即在液氮中冷冻。将叶材料按份在研钵中液氮下匀浆，并溶解于总体积为约2.5倍量(重量/体积)的淀粉缓冲液中。此外，在韦林氏搅切器中以全速再次匀浆该悬浮液20秒。使该匀浆通过尼龙网(网眼宽100μm)，并在1,000×g下离心5分钟。弃去含有可溶性蛋白质的上清液。
b)纯化从植物组织中分离的淀粉用淀粉缓冲液冲洗沉积于淀粉上的绿色材料将该绿色材料除去后，将由步骤a)得到的含淀粉的沉淀溶解于淀粉缓冲液中，并连续通过网眼大小不同的尼龙网(顺序为60μm、30μm、20μm)。使用10ml Percoll垫(cushion)(95％(v/v)Percoll(Pharmacia，Uppsala，Sweden)，5％(v/v)0.5M HEPES-KOH pH7.2)(Correx试管，15分钟，2,000×g)离心。将离心后得到的沉淀重悬浮于淀粉缓冲液1次，并再次离心(5分钟，1,000×g)。
c)除去结合于淀粉的蛋白质根据步骤b)得到了含有与淀粉结合蛋白质的淀粉颗粒。通过在室温下与0.5％SDS(十二烷基硫酸钠)共同温育4次、每次10-15分钟且搅拌，可以除去结合于淀粉颗粒表面的蛋白质。每次洗涤后都进行离心(5分钟，5,000×g)，以便从相应的洗涤缓冲液中分离淀粉颗粒。
d)纯化不含蛋白质的淀粉随后在室温下将步骤c)得到的不含结合于其表面蛋白质的淀粉与洗涤缓冲液共同温育4次、每次10-15分钟且搅拌。每次洗涤后都进行离心(5分钟，1,000×g)，以便从相应的洗涤缓冲液中分离淀粉颗粒。这些纯化步骤主要是为了除去步骤c)中温育使用的SDS。
e)确定分离淀粉的浓度通过光度法确定步骤d)中分离淀粉的量。经过适当稀释后，在波长600nm处测量淀粉悬浮液相对于标准曲线的光密度。标准曲线的线性范围在0和0.3消光单位之间。
为绘制标准曲线，将淀粉(例如分离自拟南芥sex1-3突变体叶中的淀粉)在真空中干燥、称量并溶解于确定量的水中。所得的悬浮液经过几步用水稀释(每次比例为1∶1)直至得到每毫升水约5μg淀粉的淀粉悬浮液。用光度计在波长600nm处测量每一步稀释得到的悬浮液。将每一悬浮液得到的吸收值对相应悬浮液中的淀粉浓度作图。得到的标准曲线在0μg淀粉/ml水至0.3μg淀粉/ml水的范围内应当符合线性数学函数。
f)贮存分离的淀粉淀粉可以不经贮存而直接使用于其他检测，也可以于-20℃等份贮存于1.5ml的Eppendorf管中。如果需要，对于本发明中描述的关于例如体外磷酸化和/或结合测试的方法，可以使用冷冻的淀粉和未贮存的、新鲜分离的淀粉。
g)所用缓冲液的成分1×淀粉缓冲液20mM HEPES-KOH，pH 8.00.2mM EDTA0.5％Triton X-100洗涤缓冲液50mM HEPES/KOH，pH 7.23.重组表达鉴定的淀粉-磷酸化蛋白质a)制备含有编码淀粉磷酸化蛋白质的cDNA的细菌表达载体例如，使用来自植物组织的mRNA或者多聚A-加-mRNA作为“模板”，通过聚合酶链式反应(PCR)，可以扩增编码淀粉磷酸化蛋白质的cDNA。为此，先用逆转录酶制备与编码淀粉磷酸化蛋白质的mRNA互补的cDNA链，再使用DNA聚合酶扩增相关cDNA链。含有底物、酶和进行PCR反应说明的“试剂盒”可以购买得到(如SuperScriptTMOne-Step RT-PCRSystem，Invitrogen，产品号10928-034)。然后可以将扩增的编码淀粉磷酸化酶的cDNA克隆入细菌表达载体如pDESTTM17(1nvitrogen)中。pDESTTM17内含可用于起始T7-RNA聚合酶转录的T7启动子。此外，表达载体pDESTTM17中沿T7启动子5′-方向含有Shine Dalgarno序列，随后为起始密码子(ATG)和所谓的His标签(tag)。该His标签由六个直接相连、均编码组氨酸氨基酸并位于所述起始密码子的阅读框内的密码子组成。在起始密码子、His标签和编码淀粉磷酸化蛋白质cDNA的密码子之间发生了翻译融合，从而在pDESTTM17中克隆编码淀粉磷酸化蛋白质。因此，在起始于T7启动子的转录及随后的翻译完成后，得到了淀粉磷酸化蛋白质，其N-末端具有内含His标志的附加氨基酸。
然而，适用于在微生物中表达的其他载体也可以用于表达淀粉磷酸化蛋白质。表达载体及其相关的表达株为本领域技术人员所公知，且可从合适的经销商处以合适的组合购买获得。
b)在大肠杆菌中制备表达克隆首先，使用步骤a)中制备的表达质粒转化合适的转化态大肠杆菌菌株，所述菌株可染色体编码T7-RNA聚合酶，然后在琼脂凝固的培养基上30℃培养过夜。合适表达菌株的实例如，可染色体编码IPTG-诱导性启动子(lacZ)调控下的T7-RNA聚合酶的BL21株(Invitrogen产品号C6010-03)。
通过本领域技术人员已知的方法，检查转化得到的细菌克隆中是否含有所需的含编码淀粉磷酸化蛋白质cDNA的表达质粒。同时得到表达克隆。
c)在大肠杆菌中表达淀粉磷酸化蛋白质首先制备预培养物(preliminary culture)。为此，将根据步骤b)得到的表达克隆接种于30ml含有选择表达质粒存在的抗生素的TerrificBroth(TB培养基)中，并在30℃下搅拌(250转/分钟)培养过夜。
然后制备淀粉磷酸化蛋白质的主要培养物(main culture)。为此，每次在含有预热至30℃的300ml TB培养基以及用于选择表达质粒存在的抗生素的1L锥形瓶中，各接种10ml适当的预培养物，并在30℃下搅拌(250转/分钟)下培养，直至其光密度(于波长600nm处测量(OD600)达约0.8。
如果用于表达淀粉磷酸化蛋白质的是表达质粒，且所述质粒中淀粉磷酸化蛋白质的表达通过可诱导系统起始(例如大肠杆菌菌株BL21中的表达载体pDESTTM17，IPTG可诱导)，则当到达OD600为约0.8时，向主要培养物中加入相关诱导物(例如IPTG)。加入诱导物后，在30℃搅拌(250转/分钟)下培养主要培养物，直至其OD600达到约1.8。然后将主要培养物冰上冷却30分钟，随后通过离心(4,000×g、4℃下10分钟)从培养基分离主培养物的细胞。
4.纯化淀粉磷酸化蛋白质a)破碎表达淀粉磷酸化蛋白质的细胞将一般方法第3条步骤c)中得到的细胞重悬浮于裂解缓冲液中。其中约每1g细胞中加入约4ml裂解缓冲液。然后重悬浮的细胞在冰上孵育30分钟后，在持续用冰冷却下用超声探头(Baudelin Sonoplus UW 2070，Baudelin electronic，Berlin，设置周期6，70％，1分钟)破碎细胞。此处的操作应当谨慎以确保超声处理时细胞悬浮液的温度不至于过高。离心超声处理后得到的悬浮液(20,000×g、4℃下12分钟)，并用孔径45μm的滤器过滤离心后获得的上清液。
b)纯化淀粉磷酸化蛋白质如果在大肠杆菌细胞中表达的淀粉磷酸化蛋白质为含有His标志的融合蛋白，则可以使用与His标签有更强结合亲和力的镍离子进行纯化。为此，将25ml步骤d)中得到的滤液与1ml Ni-琼脂糖浆(Qiagen，产品号30210)混合，并在冰上孵育1小时。随后将该Ni-琼脂糖浆和滤液的混合物上样在聚苯乙烯柱上(Pierce，产品号29920)。弃去通过柱得到的产物。然后加入8ml溶解缓冲液洗涤该柱，再次弃去通过柱的产物。向柱中分次加入1ml E1缓冲液2次，然后加入1ml E2缓冲液1次，随后加入1ml E3缓冲液5次，来洗脱淀粉磷酸化蛋白质。通过向柱上加入各自部分的合适洗脱缓冲液(E1、E2、E3缓冲液)，产生的穿过柱子的产物以单独的级分收集。这些级分的等分试样随后通过变性SDS丙烯酰胺凝胶电泳，通过考马斯蓝染色来分析。含有足够量和满意纯度的淀粉磷酸化蛋白质的级分借助于在4℃下加压过滤来纯化和浓缩。例如，可以借助于Amicon cell(AmiconUltrafiltration Cell，Model 8010，产品号5121)，使用Diaflo PM30膜(Millipore，产品号13212)在4℃进行加压过滤。然而，本领域技术人员已知的其他方法也可以用于浓缩。
c)所用缓冲液的组成裂解缓冲液50mM HEPES300mMNaCl10mM 咪唑pH 8.0 (用NaOH调节)1mg/ml 溶菌酶(使用缓冲液即刻前加入)
1/4片/10ml完全没有EDTA的蛋白酶抑制剂(Roche，产品号1873580)(使用缓冲液前即刻加入)洗脱缓冲液E150mM HEPES300mMNaCl50mM 咪唑pH 8.0(用NaOH调节)洗脱缓冲液E250mM HEPES300mMNaCl75mM 咪唑pH 8.0(用NaOH调节)洗脱缓冲液E350mM HEPES300mMNaCl250mM咪唑pH 8.0(用NaOH调节)5.重组表达R1蛋白质R1蛋白质的重组表达述于文献(Ritte等人，2002，PNAS 99，7166-7171；Mikkelsen等人，2004，Biochemical Journal 377，525-532)，但也可根据上文一般方法第3条所述的关于淀粉磷酸化蛋白质重组表达的方法进行。
6.纯化R1蛋白质R1蛋白质的纯化述于文献(Ritte等人，2002，PNAS 99，7166-7171；Mikkelsen等人，Mikkelsen等人，2004，Biochemical Journal 377，525-532)，但如果在大肠杆菌细胞中R1蛋白质表达产生的是含His标志的R1融合蛋白质，也可根据上文一般方法第4条所述的关于淀粉磷酸化蛋白质纯化的方法进行纯化。
7.体外由非磷酸化淀粉产生磷酸化淀粉a)体外磷酸化非磷酸化淀粉将不含有淀粉磷酸酯的淀粉(例如使用上文一般方法第2条所述方法从拟南芥sex1-3突变体叶中分离)与R1缓冲液和纯化R1蛋白质混合(每mg淀粉约0.25μg R1蛋白质)，以使淀粉含量为25mg/ml。在室温下搅拌温育该反应制备物过夜(约15小时)。该反应完成后，通过每次用约800μl0.5％SDS洗涤4次，除去结合于反应制备物内淀粉上的R1。然后每次用1ml洗涤缓冲液洗涤5次除去体外磷酸化淀粉上仍然存留的SDS。所有的洗涤步骤都在室温下搅拌进行10-15分钟。每次洗涤后都进行离心(10,000×g，2分钟)，以便从相应的SDS缓冲液或洗涤缓冲液中分离淀粉颗粒。
b)所用缓冲液的组成R1缓冲液50mM HEPES/KOH，pH 7.51mM EDTA6mM MgCl20.5mMATP洗涤缓冲液50mM HEPES/KOH，pH 7.28.蛋白质与磷酸化淀粉或非磷酸化淀粉的结合a)分离磷酸化淀粉蛋白质复合体或非磷酸化淀粉蛋白质复合体将约50mg磷酸化淀粉或约50mg非磷酸化淀粉分别重悬浮于约800μl蛋白质提取物的分离制备物中。蛋白质提取物中的蛋白质浓度均应为约4mg-5mg/ml。在室温下将磷酸化淀粉或非磷酸化淀粉与蛋白质提取物共同搅拌温育15分钟。温育完成后，使用Percoll垫(4ml)离心反应制备物(3500转/分钟、4℃下15分钟)。离心后，未与磷酸化淀粉(或P-淀粉)结合的蛋白质将在上清液中发现并且可以用巴氏滴管除去。弃去上清液。将离心后得到的含有磷酸化淀粉或非磷酸化淀粉、包括结合于相应淀粉的蛋白质(分别为磷酸化淀粉蛋白质复合体或非磷酸化淀粉蛋白质复合体)的沉淀颗粒洗涤2次，每次1ml洗涤缓冲液(见上，一般方法第7条b)4℃下搅拌温育3分钟。每次洗涤后都进行离心(4℃下台式离心机，HettichEBA 12R中8000转/分钟，5分钟)，以便从洗涤缓冲液分别分离磷酸化淀粉或非磷酸化淀粉。
b)分别溶解结合于磷酸化淀粉蛋白质复合体或非磷酸化淀粉蛋白质复合体内的蛋白质将步骤a)中分别得到的磷酸化淀粉蛋白质复合体或非磷酸化淀粉蛋白质复合体重悬浮于约150μl的SDS测试缓冲液中，并在室温下搅拌温育15分钟。然后通过离心(Eppendorf台式离心机13,000转/分钟、室温下1分钟)从溶解的蛋白质中分别分离磷酸化淀粉或非磷酸化淀粉。离心得到的上清液再次离心(Eppendorf台式离心机13,000转/分钟、室温下1分钟)，以便分别除去磷酸化淀粉或非磷酸化淀粉的任何残留并除之。结果得到分别结合于磷酸化淀粉或非磷酸化淀粉的溶解蛋白质。
c)所用缓冲液的组成SDS测试缓冲液187.5mM Tris/HCl pH 6.86％ SDS30％甘油～0.015％ 溴酚蓝60mMDTE(用时加入)Percoll用25mM HEPES/KOH，pH 7.0组成的溶液将Percoll透析过夜。
9.分离结合于磷酸化淀粉和/或非磷酸化淀粉的蛋白质将涉及蛋白质与磷酸化淀粉或非磷酸化淀粉结合的一般方法第8条步骤c)中得到的溶解蛋白质分别在95℃下温育5分钟，然后使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。其中，通过结合磷酸化淀粉得到的溶解蛋白质和通过结合非磷酸化淀粉得到的溶解蛋白质等量上样于丙烯酰胺凝胶上。至少以胶状考马斯(Roth，Karlsruhe，Roti-Blue Rod.No.Al52.1)染色电泳完成后得到的凝胶过夜，随后用30％甲醇、5％乙酸或25％甲醇脱色。
10.鉴定和分离结合于磷酸化淀粉和/或非磷酸化淀粉的蛋白质a)鉴定对磷酸化淀粉比对非磷酸化淀粉结合活性增强的蛋白质通过丙烯酰胺凝胶电泳分离及其后染色显现(见上文一般方法第9条)的蛋白质，与磷酸化淀粉结合后的信号相对于与非磷酸化淀粉结合后的相应信号增强，对磷酸化淀粉比对非磷酸化淀粉的结合活性增强。通过这一途径，可以鉴定对磷酸化淀粉比对非磷酸化淀粉结合活性增强的蛋白质。将对磷酸化淀粉比对非磷酸化淀粉的结合活性增强的蛋白质从丙烯酰胺凝胶上切割下来。
b)鉴定对磷酸化淀粉比对非磷酸化淀粉结合活性增强的蛋白质用胰蛋白酶消化步骤a)中鉴定的蛋白质，通过MALDI-TOF方法分析得到的肽确定所得肽的质量。胰蛋白酶是一种序列特异性的蛋白酶，即胰蛋白酶只在相关蛋白质中含有某一氨基酸序列时，才在特定位点切割该蛋白质。胰蛋白酶总是切割从N-末端开始前后相连的氨基酸精氨酸和赖氨酸间的肽键。这样，理论上可以确定胰蛋白酶消化氨基酸序列后产生的所有肽。根据理论上确定肽的氨基酸编码知识，也可以确定胰蛋白酶消化后理论上得到的肽的质量。因此，可以将含有胰蛋白酶消化后得到的理论肽质量相关信息的数据库(如NCBlnr http://prospector.ucsf.edu/ucsfht ml4.0/msfit.htm；Swissprot http://cbrg.inf.ethz.ch/Server/MassSearch.ht ml)，与用MALDI-TOF-MS得到的未知蛋白质的实际肽质量进行比较。在理论和/或实际胰蛋白酶消化后含相同肽质量的氨基酸序列被视为相同。相关数据库中既含有已知功能蛋白质的肽质量，也含有目前仅通过测序项目所得核酸序列对应的氨基酸序列衍生的假想存在的蛋白质的肽质量。因此很少显示该类假想蛋白质的实际存在和功能，即使其真有功能，往往也是建立在预测基础上而不是实际表现出来的功能。
将含有步骤a)所得蛋白质的条带从丙烯酰胺凝胶上切割出来；切小切下的丙烯酰胺条，并于37℃下在约1ml 60％50Mm NH4HCO3、40％乙腈中温育约半小时进行脱色。然后移去脱色溶液，将剩下的凝胶真空干燥(如Speedvac)。干燥后，加入胰蛋白酶溶液消化该凝胶条中所含的蛋白质。在37℃下消化过夜。消化后，加入少量乙腈(直至丙烯酰胺凝胶为白色)，并将制备物在真空中干燥(如Speedvac)。干燥完成后，加入恰好足以覆盖干燥成分的5％蚁酸，并在37℃下温育几分钟。再重复一次乙腈处理及其后的干燥。然后将干燥成分溶解于0.1％TFA(三氟乙酸，5μl至10μl)中，并取约0.5μl部分量滴于载体上。也将等量基质(s-腈基-4-羟基-肉桂酸)置于载体上。从基质中结晶析出后，通过MALDI-TOF-MS-MS(如Burker ReflexTM II，Bruker Daltonic，Bremen)的方法确定肽质量。根据所得的质量，搜索数据库寻找经过理论胰蛋白酶消化后具有相同质量的氨基酸序列。这样可以鉴定编码蛋白质的氨基酸序列，所述蛋白质优选结合于磷酸化α-1，4-葡聚糖和/或以磷酸化α-1，4-葡聚糖为底物。
11.证实蛋白质的淀粉-磷酸化活性的方法a)磷酸化淀粉和/或非磷酸化淀粉共同温育蛋白质为证实蛋白质是否具有淀粉磷酸化活性，可以将待研究蛋白质与淀粉及放射性标记的ATP共同温育。为此，室温下在500μl磷酸化缓冲液中将约5mg磷酸化淀粉或约5mg非磷酸化淀粉与待测蛋白质(每mg淀粉0.01μg至5.0μg)共同搅拌温育10分钟至30分钟。然后加入SDS至浓度为2％(重量/体积)终止反应。离心出相应反应混合物中的淀粉颗粒(13,000×g，1分钟)，并用900μl 2％SDS溶液洗涤1次、每次900μl 2mMATP溶液洗涤4次。每次洗涤都在室温下搅拌进行15分钟。每一洗涤步骤后通过离心(13,000×g，1分钟)从相应洗涤缓冲液中分离淀粉颗粒。
此外，当实施证明蛋白质淀粉磷酸化活性的试验时，应当将不含有蛋白质或失活蛋白质但其他处理都与反应制备物相同的另外的反应制备物作为对照。
b)确定由于酶活性而引入磷酸化淀粉和/或非磷酸化淀粉中的磷酸酯残基的量检查根据步骤a)得到的淀粉颗粒中是否存在放射性标记的磷酸酯残基。为此，将相应的淀粉重悬浮于100μl水中，并各与3ml闪烁混合物(例如ReadySafeTM，BECKMANN Coulter)混合，然后使用闪烁计数器(例如LS 6500 Multi-Purpose Scintillation Counter，BECKMANN COULTERTM)分析。
c)鉴定优选以磷酸化淀粉为底物的蛋白质如果根据步骤a)描述的方法将蛋白质在分离制备物中温育，一次与磷酸化淀粉而另一次与非磷酸化淀粉，则通过比较根据步骤b)所得的磷酸化淀粉的值，可以确定相关蛋白质在磷酸化淀粉中是否相对于非磷酸化淀粉引入了更多的磷酸。因此，也可以鉴定能向磷酸化淀粉中引入磷酸但不能向非磷酸化淀粉中引入的蛋白质，即可以鉴定需要已经磷酸化的淀粉为底物以进行进一步磷酸化反应的蛋白质。
d)所用缓冲液的组成磷酸化缓冲液50mM HEPES/KOH，pH 7.51mMEDTA6mMMgCl20.01到0.5mMATP0.2到2μCi/ml随机化的33P-ATP(备选地，也可以使用含有在γ位特异标记的磷酸酯残基的ATP)。
本发明中的术语“随机化ATP”是指在γ位和β位上都含有标记的磷酸酯残基的ATP(Ritte等人2002，PNAS 99，7166-7171)。随机化ATP在科学文献中也被称为β/γATP。下文描述为制备随机化ATP的方法。
i)制备随机化ATP此处描述的通过酶促反应制备随机化ATP的方法基于以下反应机理1.反应步骤1
()2.反应步骤2
()反应平衡取决处于产物一边，但是尽管如此，该反应还是会产生主要由β33P-ATP和一些γ33P-ATP组成的混合物。
ii)进行第1步反应将含有γ位用33P(Hartmann Analytic，10μCi/μl)标记的磷酸酯残基的ATP(100uCi，3000Ci/mmol)与2μl肌激酶(来自于兔肌肉的AMP-磷酸转移酶；SIGMA，产品号M30033.8mg/ml，1,626单位/mg)在90μl随机化缓冲液中37℃温育1小时。然后在95℃温育12分钟终止反应。随后用Microcon YM 10滤器(Amicon，Millipore产品号42407)以14,000xg离心过滤至少10分钟纯化反应制备物。
iii)进行第2步反应向步骤ii)中得到的滤液中加入2μl丙酮酸激酶(关于合适的溶液的制备见下文)和3μl 50mM PEP(磷酸烯醇丙酮酸)。在30℃下温育该反应混合物45分钟，随后在95℃下温育12分钟终止反应。然后离心反应混合物(Eppendorf台式离心机12,000转/分钟，2分钟)。离心后移去得到的含有随机化ATP的上清液，等分并贮存于-20℃。
制备丙酮酸激酶溶液离心出15μl丙酮酸激酶(来自兔肌肉，Roche产品号12815，10mg/ml，200单位/mg，25℃下)，弃去上清液，将沉淀溶于27μl丙酮酸激酶缓冲液中。
iv)所用缓冲液丙酮酸激酶缓冲液50mM HEPES/KOH pH 7.51mM EDTA随机化缓冲液100mM HEPES/KOH pH 7.5
1mM EDTA10％ 甘油5mM MgCl25mM KCl0.1mMATP0.3mMAMP12.证实蛋白质的自磷酸化为证实蛋白质是否具有自磷酸化活性，将待测蛋白质与放射性标记的ATP共同温育。为此，将待测蛋白质(50μg至100μg)在220μl磷酸化缓冲液中(见上，一般方法第12d)条)在室温下搅拌温育30分钟至90分钟。然后加入EDTA至终浓度为0.11M以终止反应。随后使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(7.5％丙烯酰胺凝胶)分离出约2μg至4μg蛋白质。将聚丙烯酰胺凝胶电泳得到的凝胶进行放射自显影。在放射自显影中显示出信号的蛋白质具有放射性磷酸酯残基。
13.鉴定α-1，4-葡聚糖的葡萄糖分子中由淀粉磷酸化蛋白质引入磷酸酯残基的C-原子位置在控制的条件下，水解通过适当蛋白质体外得到的磷酸化葡聚糖、然后分离水解得到的葡萄糖单体、再测量该葡萄糖分子某级分中由该蛋白质引入的磷酸，可以证实α-1，4-葡聚糖的葡萄糖分子中的哪些C原子位点被蛋白质磷酸化。
a)α-1，4-葡聚糖的完全水解离心含有α-1，4-葡聚糖的水悬浮液，然后将沉淀颗粒重悬浮于0.7MHCl内(Baker，分析用)，并在95℃下搅拌温育2小时。温育完成后，短暂冷却并离心样品(例如10,000×g，2分钟)。将得到的上清液转移到新的反应容器中，并加入2M NaOH(Baker，分析用)中和。如果存在沉淀，则将其重悬浮于100μl水中，确定其中标记的磷酸量作为对照。
随后在10kDa滤器内离心中和的上清液。通过测量得到的滤液的等份试样，可以使用如闪烁计数器确定滤液中标记的磷酸的量。
b)水解产物分级并确定磷酸化C-原子的位置通过如高压阴离子交换层析(HPAE)可以分离通过步骤a)得到的水解产物的中和滤液(使用放射性标记ATP时，约3000cpm)。可用H2O稀释中和滤液以得到HPAE所需的体积。此外，向适当的滤液中分别加入葡萄糖-6-磷酸(约0.15mM)和葡萄糖-3-磷酸(约0.3mM)作为内部对照。通过如Dionex DX 600Bio Lc系统，使用CarboPac PA 100柱(具有适当的预备柱)和脉冲电流检测器(ED 50)，可以通过HPAE进行分离。其中，在注射样品之前，先用99％的洗脱液C和1％的洗脱液D冲洗柱10分钟。然后注射60μl的样品量。样品的洗脱条件如下流速1ml/分钟梯度从0分钟到30分钟线性增加洗脱剂C 洗脱剂D0分钟 99％1％30分钟0％ 100％35分钟0％ 100％运行结束分别收集从柱中洗脱的各个级分的水解产物，每个级分1ml。由于分别向注射的水解样品中加入了未标记的葡萄糖-3-磷酸(Ritte等人.2002，PNAS 99，7166-7171)和未标记的葡萄糖-6-磷酸(Sigma，产品号G7879)作为内部标准，所以可以通过脉冲电流检测器确定含有葡萄糖-3-磷酸或葡萄糖-6-磷酸的级分。通过测量各个级分中标记的磷酸的量，并与含有葡萄糖-3-磷酸或葡萄糖-6-磷酸的级分相比较，可以确定那些含有标记的葡萄糖-3-磷酸或葡萄糖-6-磷酸的级分。确定相关级分中标记的磷酸的量。根据各个水解产物中测定的标记磷酸所得的葡萄糖-3-磷酸与葡萄糖-6-磷酸量的比例，可以确定哪个C-原子位点是α-1，4-葡聚糖磷酸化酶优选磷酸化的。
c)所用的缓冲液洗脱液C100mM NaOH洗脱液D100mM NaOH500mM 醋酸钠14.制备用Q-TOF-MS-MS测序的样品a)一般说明首先通过胰蛋白酶消化的方法，将亦可存在于聚丙烯酰胺凝胶中切出条带形式中的分离蛋白质切割成较小的片断。将形成的肽导入混合型质谱仪(hybrid mass spectrometer)中，所述混合质谱仪为飞行时间质谱仪(TOF)与四极式质谱仪的耦联。在测量的第一阶段，第一台质谱仪(四极式)为“关闭”状态，可由TOF质谱仪确定消化形成肽的质量。在第二阶段，用四极“滤出”选择的肽，即仅有该肽可以通过四极，所有其他的肽都不能。该肽随后在“碰撞室”中与带电的气体分子碰撞而被打断。此处的“打断”主要发生在肽键处。因此形成了或多或少质量不同，呈统计分布的肽片段。然后可通过“分类”这些片段以确定这些肽的氨基酸序列。如果得到重叠的肽，则可以获得蛋白质的氨基酸序列。质谱分析法在鉴定和测序中的应用为本领域技术人员所公知，并详细描述于专业文献中[例如P.Michael Conn(编著)，2003，Humana Press，New Jersey，ISBN1-58829-340-8]；J.R.Chapman(编著)，2000，Humana Press，SBN089603609X]。
b)还原并烷化蛋白质的半胱氨酸残基通过在分离蛋白质之前进行凝胶电泳，可以还原/烷基化含有半胱氨酸残基的待分析蛋白质氨基酸序列。为此，将待用凝胶电泳分离的蛋白质与SDS样品缓冲液(必须不含任何DTT或β-巯基乙醇)混合。然后向这些样品中加入新制备的DTT至终浓度为10mM，并将样品在95℃下温育3分钟。冷却样品至室温后，加入新制备的碘乙酰胺(iodacetamide)至终浓度为20mM。黑暗中室温温育样品20分钟。然后通过丙烯酰胺凝胶电泳的方法分离样品中所含的蛋白质。
c)将蛋白质从丙烯酰胺凝胶中分离使用尽可能“钝”的干净解剖刀切出含有待确定蛋白质序列的蛋白质条带，并切成小块(约1mm3-立方体)。将切小的凝胶片置于0.5ml或1.5ml的反应容器中，通过短暂离心沉淀。
d)脱色切出的凝胶条如果使用的是银离子染色的凝胶，用含有比例为1∶1的30mM氰铁酸钾和100mM硫代硫酸钠的溶液完全浸没根据步骤c)得到的凝胶片并搅拌(旋转)，直至凝胶片完全脱色。然后移去脱色溶液，用高纯水(传导率约18MOhm)洗涤凝胶片3次，每次200μl。
如果使用的是考马斯蓝染色的凝胶，则将根据步骤c)得到的凝胶片与含有比例为1∶1的高纯水和乙腈(纯度至少为HPLC纯净)的溶液搅拌温育2次，每次15分钟。脱色溶液的量应当为约两倍凝胶的量。每次洗涤过后移去洗涤溶液。
完成脱色后，将凝胶片与1倍体积(相对与凝胶片而言)的乙腈混合，在室温下搅拌温育15分钟。然后移去乙腈，将凝胶片与1倍体积的100mM碳酸氢铵混合并在室温下温育5分钟。然后加入乙腈使碳酸氢铵和乙腈量的比例为1∶1。在室温下再温育15分钟，然后移去溶液，在真空中(例如Speedvac)干燥留下的凝胶片。
e)胰蛋白酶消化凝胶片中的蛋白质将胰蛋白酶溶液(每μl 50mM碳酸氢铵中10ng胰蛋白酶)以10μl的量分次加入根据步骤d)得到的干凝胶片中。每次加入胰蛋白酶溶液后，都在冰上温育10分钟。分次加入胰蛋白酶直至凝胶片不再膨胀并完全为胰蛋白酶溶液浸没。然后移去胰蛋白酶溶液，在37℃下温育凝胶片过夜。
f)从丙烯酰胺凝胶中分离肽短暂离心根据步骤e)得到的样品，以收集反应容器中的液体，将该液体转移到新的反应容器中。用超声波(超声波水浴)处理凝胶片2分钟。然后将留下的凝胶片与等体积的25mM碳酸氢铵溶液混合并在搅拌下温育20分钟。随后加入乙腈使碳酸氢铵和乙腈量的比例为1∶1，并在室温下再搅拌温育15分钟。温育完成后，用超声波再次处理样品2分钟，然后移去液体并将之与前次移取的液体合并。将剩下的凝胶片与等体积含5％蚁酸和乙腈比例为1∶1的溶液混合，并在室温下搅拌温育15分钟。移去液体并将之与之前移取的液体合并。重复在5％蚁酸/乙腈(比例为1∶1)中温育凝胶片，得到的液体一样与之前移取的液体合并。60℃下在真空离心机(Speedvac)中将含有待测序肽的合并上清液浓缩至约15μl。在用Q-TOF分析前，将得到的肽贮存于20℃。用质谱分析测序蛋白质前，可以使用本领域技术人员公知的方法脱盐。
15.稻植物的转化可以根据Hiei等人(1994，Plant Journal 6(2)，271-282)描述的方法转化稻植物。
16.马铃薯植物的转化可以根据Rocha-Sosa等人(EMBO J.8，(1989)，23-29)描述的方法使用土壤杆菌转化马铃薯植物。
17.确定淀粉磷酸酯的含量a)确定C-6磷酸酯的含量淀粉中葡萄糖单体的C-2、C-3和C-6位点可以被磷酸化。为了确定淀粉中的C-6-磷酸酯的含量，将50mg淀粉500μl 0.7M HCl中95℃水解4小时。然后以在15,500g离心该制备物10分钟并移去上清液。取7μl上清液与193μl咪唑缓冲液(100mM咪唑，pH 7.4；5mM mgCl2，1mMEDTA和0.4mM NAD)混合。用光度计在340mm处进行测量。确立基线吸收值后，加入2单位葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(来自肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)，Boehringer Mannheim)开始酶促反应。吸收值的改变与淀粉中葡萄糖-6-磷酸浓度直接成比例。
b)确定总磷酸的含量使用Ames方法(Methods in Enzymology VIII，(1966)，115-118)确定总磷酸的含量。
将约50mg淀粉与30μl乙醇硝酸镁溶液混合，在500℃的隔焰炉中煅烧3小时。将残留物与300μl 0.5M盐酸混合，在60℃下温育30分钟。取其等分再加入300μl 0.5M盐酸，加入到含100μl 10％抗坏血酸和600μl0.42％钼酸铵的2M硫酸混合物中，并在45℃下温育20分钟。
c)确定C-6磷酸酯和C-3磷酸酯的含量为确定结合于α-1，4-葡聚糖葡萄糖分子C-6位和C-3位上的磷酸的含量，可以在用如一般方法第13条所述的方法完全水解后使用HPAE分离相关葡聚糖。通过积分HPEA分离后得到的各个峰值面积，可以确定葡萄糖-6-磷酸和葡萄糖-3-磷酸的量。对未知样品中得到的葡萄糖-6-磷酸和葡萄糖-3-磷酸峰值面积和已知量葡萄糖-6-磷酸和葡萄糖-3-磷酸用HPAE分离后得到的峰值面积进行比较，可以确定待测样品中葡萄糖-6-磷酸和葡萄糖-3-磷酸的量。
实施例1.从拟南芥(Arabidopsis thaliana)分离蛋白质，与对非磷酸化的淀粉相比，其对P-淀粉有增加的结合活性a)从拟南芥制备蛋白质提取物根据一般方法第1条所述的方法，从约7g拟南芥(kotyp Columbia，Col-O)的叶(鲜重)制备蛋白质提取物。
b)从拟南芥sex1-3突变体叶中分离淀粉颗粒根据一般方法第2条所述的方法，从约20g拟南芥sex1-3突变体叶(鲜重)中分离淀粉颗粒。
c)用纯化的R1蛋白质将从拟南芥sex1-3突变体分离的淀粉的体外磷酸化根据一般方法第7条所述的方法，用大肠杆菌中重组表达并纯化的R1蛋白质磷酸化约30mg从拟南芥sex1-3突变体中分离的非磷酸化淀粉。R1蛋白质在大肠杆菌中表达及其后的纯化用Ritte等人(2002，PNAS99，7166-7171)描述的方法进行。
d)分离结合于磷酸化淀粉和/或非磷酸化淀粉的蛋白质使用根据一般方法8a)条中描述的方法，在制备物A中将根据步骤a)得到的拟南芥蛋白质提取物与50mg根据步骤c)制备的体外磷酸化淀粉共同温育并洗涤。
使用根据一般方法8a)条中描述的方法，在第二种制备物B中将根据步骤a)得到的拟南芥蛋白质提取物与50mg根据步骤b)制备的非磷酸化淀粉共同温育并洗涤。
然后，根据一般方法第8条b)所述的方法，溶解制备物A的结合于磷酸化淀粉的蛋白质和制备物B的结合于非磷酸化淀粉的蛋白质。
在第三种制备物C内，使用一般方法第8条a)所述的方法温育并洗涤50mg根据步骤c)制备的体外磷酸化的淀粉。然而制备物C中不含有蛋白质提取物。
e)通过丙烯酰胺凝胶电泳分离根据步骤d)得到的蛋白质使用一般方法第9条所述的方法通过9％丙烯酰胺凝胶在变性条件(SDS)下分离步骤d)中得到的制备物A、B和C中的蛋白质。染色凝胶如图1所示。可以清楚地看到参照蛋白质标准参照物(迹线M)，在变性丙烯酰胺凝胶中具有约130kDa分子量的蛋白质与非磷酸化的淀粉(K)相比优选结合磷酸化的淀粉(迹线P)。
f)鉴定与非磷酸化淀粉相比优选结合于磷酸化淀粉的蛋白质将步骤e)中鉴定的分子量为约130kDa的蛋白质条带从凝胶中切出。然后根据一般方法10b)所述将蛋白质从丙烯酰胺中释放出来，用胰蛋白酶消化，以MALD-TOF-MS方法确定得到的肽质量。将通过MALDI-TOF-MS得到的所谓“指纹”与数据库中理论消化的氨基酸分子的指纹(Mascothttp://www.matrixscience.com/search_form_select.html；ProFoundhttp://129.85.19.192/profound_bin/WebProFound.exe；PepSeahttp://195.41.108.38/PepSealntro.ht ml)进行比较。由于此类指纹对于蛋白质非常特异，可以因此鉴定氨基酸分子。使用该氨基酸分子序列，可以从拟南芥中分离出编码OK1蛋白质的核酸序列。用该方法鉴定的蛋白质命名为A.t.-OK1。分析拟南芥的氨基酸序列后，发现其与数据库中存在的序列(NP 198009，NCBI)有差异。SEQ ID No 2所示的氨基酸序列编码A.t.-OK1蛋白质。SEQ ID No 2与数据库中的序列(Acc.NP 198009.1，NCBI)相比有差异。数据库中存在的序列(ACC.NP 198009.1).NP 198009.1)内不含SEQ ID No 2中的氨基酸519至523(WRLCE)和762至766(VRARQ)。与数据库序列的版本2(Acc.NP 198009.2)相比，SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列含有额外的氨基酸519至523(WRLCE)。
2.克隆编码鉴定的OK1蛋白质的cDNA使用从拟南芥叶中分离的mRNA、通过反向PCR分离A.t.-OK1的cDNA。为此，通过逆转录酶方法合成cDNA链(SuperScriptTMFirst-StrandSynthesis System for RT PCR，Invitrogen产品号11904-018)，其然后使用DNA聚合酶(Expand High Fidelity PCR Systems，Roche产品号1732641)扩增。将从该PCR反应得到的扩增产物克隆入载体pGEM(-T(Invitrogen产品号A3600)内。得到的质粒命名为A.t.-OK1-pGEM-T，测定编码A.t.-OK1蛋白质的cDNA序列并如SEQ ID NO.1所示。
SEQ ID NO 1所示的序列与数据库中所含的序列不同。在论述编码A.t.-OK1蛋白质的氨基酸序列时已经讨论过该问题了。
用于扩增编码A.t.-OK1蛋白质的cDNA的条件合成第一链使用制备商指定的条件和缓冲液。此外，合成第1条链的反应制备物中含有以下物质3μg 总RNA5μM 3′-引物(OK1 rev15′-GACTCAACCACATAACACACAAAGATC)0.83μM dNTP混合物将反应制备物在75℃下温育5分钟，然后冷却至室温。
然后加入第一链缓冲液、RNA酶抑制备物和DTT，并在42℃下温育2分钟，随后加入1μl Superscript RT DNA聚合酶并在42℃温育反应制备物50分钟。
通过PCR扩增第一链的条件1μl合成第一链的反应制备物0.25μM 3′引物(OK1 rev25′-TGGTAACGAGGCAAATGCAGA)0.25μM 5′引物(OK1 fwd25′-ATCTCTTATCACACCACCTCCAATG)反应条件步骤1 95℃2分钟步骤2 94℃20秒步骤3 62℃30秒步骤4 68℃4分钟步骤5 94℃20秒步骤6 56℃30秒步骤7 68℃4分钟步骤8 68℃10分钟先根据步1至4进行反应。在步骤4和步骤2之间进行10次重复(循环)，每个循环后步骤3的温度减小0.67℃。随后用步骤5到8中指定的条件反应。在步骤7和步骤5之间进行25次重复(循环)，每个循环中步骤7的时间增加5秒。反应完成后，将反应物冷却至4℃。
3.制备重组表达OK1蛋白质cDNA的载体以质粒A.t.-OK1-pGEM为模板、使用Gateway Technology(Invitrogen)进行PCR方法扩增后，先将编码拟南芥OK1蛋白质的序列克隆入载体pDONORTM201(Invitrogen产品号11798-014)中。然后，通过序列特异性重组将该载体中得到的OK1蛋白质编码区克隆入表达载体pDESTTM17(Invitrogen产品号11803-014)中。得到的表达载体命名为A.t.-OK1-pDESTTM1。该克隆使编码A.t-OK1蛋白质的cDNA与表达载体pDESTTM17中存在的核苷酸发生了翻译融合。来自与编码A.t-OK1蛋白质的cDNA翻译融合的载体pDEST17TM17中的核苷酸，编码21个氨基酸。这21个氨基酸中除了其他还包括起始密码子(ATG)和His标签(6个直接相连的组氨酸残基)。翻译这些翻译融合序列后产生的A.t.-OK1蛋白质的N-末端含有来自所述载体的核苷酸编码的额外21个氨基酸。因此，由该载体产生的重组A.t.-OK1蛋白质的N-末端含有21个来自载体pDESTTM17的额外氨基酸。
4.在大肠杆菌中OK1蛋白质的异源(Heterological)表达用根据实施例3得到的表达载体A.t.-OK1-pDESTTM17转化大肠杆菌菌株BL21 StarTM(DE3)(Invitrogen，产品号C6010-03)。对该表达系统的描述见上文(见一般方法第3条)。转化得到的含有载体A.t.-OK1-pDESTTM17的细菌克隆首先用于制备预培养物，该预培养物随后用于接种主要培养物(见一般方法第3条c)。将预培养物和主要培养物分别在30℃下搅拌培养(250转/分钟)。当该主要培养物的OD600到达约0.8时，加入IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)直至终浓度为1mM，以诱导重组A.t.-OK1蛋白质的表达。加入IPTG后，在30℃搅拌(250转/分钟)下培养主要培养物直至其OD600为约1.8。然后将主要培养物在冰上冷却30分钟，再通过离心(4,000×g、4℃下10分钟)将主要培养物中的细胞从培养基中分离。
5.纯化重组表达的OK1蛋白质使用一般方法第4条所述的方法，纯化和浓缩根据实施例4得到的A.t.-OK1蛋白质。
6.证实OK1蛋白质的淀粉磷酸化活性根据一般方法第11条所述的方法证明A.t.-OK1蛋白质的淀粉磷酸化活性。其中，将5μg根据实施例5制备的纯化A.t.-OK1蛋白质分别在制备物A中与5mg根据实施例1b)从拟南芥sex1-3突变体中分离的淀粉，以及在制备物B中与5mg根据实施例1c)进行酶促磷酸化得到的淀粉共同在室温下搅拌温育30分钟，温育均在500μl含0.05mM放射性(33P)标记的随机ATP(总共1,130,00cpm，约0.55uCi)的磷酸缓冲液中进行。制备物C用作对照，其与制备物B相同，只是不含有OK1蛋白质，但是与制备物A和B以相同方式处理。对于所有制备物(A、B、C)均独立检测两次。
使用闪烁计数器检查试剂A、B和C中的淀粉内是否存在放射性标记的磷酸(见一般方法第11b)条)。其结果如表1和图3所示。
表1证实OK1蛋白质的淀粉-磷酸化活性根据所得的结果，可见当底物为非磷酸化淀粉时，OK1蛋白质不能将磷酸酯基从ATP转移至淀粉；因为通过OK1蛋白质转移到非磷酸化淀粉的磷酸酯基的份额(以cpm计量)并不多于制备物C(对照)中放射性标记磷酸酯基的份额。另一方面，如果底物为磷酸化淀粉，从ATP转移到磷酸化淀粉的放射性磷酸酯基的份额显著提高。由此可见，OK1蛋白质需要磷酸化淀粉作为底物，而非磷酸化淀粉不能被OK1蛋白质接受为底物。
如果上述检测用在γ位用33P特异性标记的ATP进行，则淀粉中就不可能产生放射性标记的引入。由此可见，OK1蛋白质转移ATP的β磷酸酯基到淀粉中。该测试的结果如图6所示。
7.证实自磷酸化通过上述方法(见一般方法第12条)证明A.t.-OK1蛋白质的自磷酸化。此处，在室温下将50μg纯化的A.t.-OK1蛋白质与放射性标记的随机ATP在220μl磷酸化缓冲液(见上文，一般方法第12d)条)中搅拌温育60分钟。然后从温育制备物中分别移取100μl，转移到四个新的反应容器中。反应容器1内，加入40μl 0.11M EDTA终止反应。反应容器2，在95℃下温育5分钟。反应容器3内，加入HCl至终浓度为0.5M。而反应容器4内，加入NaOH至终浓度为0.5M。反应容器3和4各在30℃下温育25分钟。然后分别从反应容器1、2、3和4中取出50μl，与SDS测试缓冲液混合并通过SDS丙烯酰胺凝胶电泳(7.5％丙烯酰胺凝胶)分离。为此，将从每种反应容器中取出的样品置于两块相同的丙烯酰胺凝胶上。将其中一块电泳完成后得到的凝胶进行放射自显影，而另一块则以考马斯蓝染色。
在以考马斯蓝染色的凝胶中(见图2A))，清楚可见用0.5M NaOH处理导致的OK1蛋白质降解。因此，OK1蛋白质必须描述为对NaOH是不稳定的。在30℃、95℃下以及与0.5M HCl的温育显示，OK1蛋白质在所述温育条件下相对稳定。根据这些温育条件下得到的各种考马斯蓝染色的凝胶中都有约等量的OK1蛋白质，可以推断出这一结论。
放射自显影中(见图2B))可见，与在30℃下温育的磷酸化OK1蛋白质相比，在95℃温育磷酸化OK1蛋白质会导致结合于OK1蛋白质的磷酸显著下降。因此，磷酸酯残基和OK1蛋白质氨基酸之间的结合必须描述为热不稳定的。此外，相对于30℃下温育的磷酸化OK1蛋白质而言，在0.5M HCl和0.5M NaOH中温育可以看到结合于OK1蛋白质的磷酸也有轻微下降。如果考虑到由于OK1蛋白质对NaOH的不稳定性，在放射性自显影中用0.5M NaOH处理后OK1蛋白质的量显著低于热和酸处理的样品，则可以推断磷酸酯残基与OK1蛋白质氨基酸的结合在碱性条件下相对稳定。由于用酸处理的样品含有与30℃和95℃温育的样品约等量的蛋白质，但其放射自显影的信号显著低于30℃处理样品，则应当认为酸温育条件也在一定程度上破坏了磷酸酯残基和OK1蛋白质氨基酸之间的键。因此，进行的测试也可以确定磷酸酯残基和OK1蛋白质氨基酸之间结合的不稳定性。同时，对酸的不稳定性远不如对热的不稳定性明显。
组氨酸氨基酸和磷酸之间的结合是热不稳定、酸不稳定但对碱稳定的(Rosenberg，1996，Protein Analysis and Purification，Birkhuser，Boston，242-244)。因此，上述结果提示，OK1蛋白质的自磷酸可以产生磷酸组氨酸。
若如上所述将重组表达的OK1蛋白质与γ位用33P特异标记的ATP温育，则不能发生任何自磷酸化。图5A)显示了相关温育步骤后，在相应反应试剂中通过Western印迹分析可以检测到的蛋白质的量。图5B)显示了各个反应制备物蛋白质的放射自显影。可见当使用在γ位特异标记的ATP时，不能证实OK1蛋白质的自磷酸化，而使用随机ATP则可以证实其自磷酸化。这意味着OK1蛋白质自磷酸化时，ATP的β位磷酸酯残基与OK1蛋白质的氨基酸共价结合。
8.证实淀粉葡萄糖分子中由OK1蛋白质磷酸化的C-原子位点a)制备磷酸化淀粉根据一般方法第7条制备磷酸化淀粉。为此，在制备物A中将5mg从拟南芥sex1-3突变体叶中分离的非磷酸化淀粉与25μg纯化A.t.-OK1蛋白质一同使用；而在制备物B中将5mg分离自拟南芥sex1-3突变体叶的体外磷酸化的淀粉与5μg纯化R1蛋白质一同使用。反应均在500μl分别含有33P标记的ATP(约2.5×106cpm)的磷酸化缓冲液中进行，室温下搅拌温育1小时。此外，使用对照制备物，其含有5mg分离自拟南芥sex1-3突变体叶的淀粉和所述磷酸缓冲液、但不含有蛋白质的制备物。对照制备物完全按照与制备物A和B相同的方法处理。通过向各个反应加入125μl10％SDS终止相应反应，并用2％SDS洗涤1次、2mM ATP 2次以及H2O每次900μl洗涤2次。每次洗涤后进行离心(各在Eppendorf台式离心机中13,000转/分钟离心2分钟)。每次将得到的淀粉沉淀重悬浮于1mlH2O中，向100μl每种制备物中加入3ml闪烁混合物(Ready Safe，BECKMANN)，用闪烁计数器(LS 6500 Multi-Purpose ScintillationCounter，BECKMANN COULTERTM)测量。
测量结果如下对照63cpm/100μl 630cpm/1000μl制备物A(OK1)1351cpm/100μl13512cpm/1000μl
制备物B(R1)3853cpm/100μl38526cpm/1000μlb)磷酸化淀粉的完全水解再次离心根据步骤a)所得的制备物A、B和C的悬浮液(Eppendorf台式离心机中13,000转/分钟离心5分钟)，将得到的沉淀重悬浮于90μl0.7M HCl(Baker，分析用)中并随后在95℃下温育2小时。然后再次离心制备物A、B和C(Eppendorf台式离心机中13,000转/分钟离心5分钟)，将上清液转移到新的反应容器中。制备物的沉淀残留物分别重悬浮于100ml H2O中，加入3ml闪烁混合物((Ready Safe，BECKMANN)后用闪烁计数器(LS 6500 Multi-Purpose Scintillation Counter，BECKMANNCOULTERTM)测量。这些残留物中都检测不到大量的放射性，即所有放射性磷酸标记的水解产物都在上清液中。
然后各加入30μl 2M NaOH中和含有水解产物的各上清液(事先在空白样品中测试出中和所需的NaOH的量)。将中和的水解产物置于已用每次200μl H2O冲洗两次的10kDa微米滤器中，并在Eppendorf台式离心机上以12,000转/分钟离心约25分钟。从所得滤液中(各为约120μl)取10μl，加入3ml闪烁混合物(Ready SafeTM，BECKMANN)后，用闪烁计数器(LS 6500 Multi-Purpose Scintillation Counter，BECKMANNCOULTERTM)测量。确定各个制备物中存在的活性的结果如下制备物A(OK1)934cpm/10μl11,208cpm/120μl93cpm/μl制备物B(R1) 2518cpm/10μl 30,216cpm/120μl252cpm/μlc)分离水解产物在上述条件下(一般方法第13c)条)，使用Dionex系统，通过HPAE方法分离步骤b)中得到的水解产物。用于分离根据步骤b)得到的制备物A和B的过滤上清液的样品的组成如下制备物A(OK1)43μl步骤b)中得到的制备物A上清液(相当于约4,000cpm)、32μl H2O、2.5μl 2.5mM葡萄糖-6-磷酸和2.5μl 5mM葡萄糖-3-磷酸(∑体积＝80μl)。
制备物B(R1)16μl步骤b)中得到的制备物B上清液(相当于约4,000cpm)、59μl H2O、2.5μl 2.5mM葡萄糖-6-磷酸和2.5μl 5mM葡萄糖-3-磷酸(∑体积＝80μl)。
每次注射含有约3,000cpm的60μl相应样品用于通过HPAE分离。根据第23c)点(Point)指定的条件进行HPAE。通过HPAE柱后，按级分收集洗脱缓冲液各1ml。在注射样品10分钟后开始收集级分。根据所用的PAD检测器接收的信号，将葡萄糖-6-磷酸洗脱液命名为级分15，而葡萄糖-3-磷酸洗脱液命名为级分17。分别取各级分500μl与3ml闪烁混合物(Ready SafeTM，BECKMANN)混合后，用闪烁计数器(LS 6500Multi-Purpose Scintillation Counter，BECKMANN COULTERTM)测量。各个级分测量数据如下
表4通过水解OK1蛋白质或者R1蛋白质磷酸化的淀粉得到的水解产物的各级分中测量的放射性的量[cpm]。
结果也如图5所图示。
R1蛋白质催化的淀粉磷酸化后，按照所分析的级分中总的测量的放射性磷酸，约66％的放射性标记的磷酸在水解淀粉后随含有葡萄糖-6-磷酸作为标准的级分洗脱，约27％随含有葡萄糖-3-磷酸作为标准的级分洗脱。OK1蛋白质催化的淀粉磷酸化后，按照所分析的级分中总的测量的放射性磷酸，约67％的放射性标记的磷酸在水解淀粉后随含有葡萄糖-6-磷酸作为标准的级分洗脱，约8％随含有葡萄糖-3-磷酸作为标准的级分洗脱。从这可以推断葡萄糖分子优选在C-6位被R1蛋白质磷酸化，而葡萄糖分子优选在C-3位被OK1蛋白质磷酸化。
9.鉴定稻中的OK1蛋白质使用一般方法第1至13条所述的方法，也能够鉴定可将磷酸酯残基从ATP转移到磷酸化淀粉的稻(M202种系)蛋白质。该蛋白质命名为O.s.-OK1。非磷酸化淀粉不能作为O.s.-OK1蛋白质的底物，即O.s.-OK1蛋白质也需要磷酸化淀粉为底物。定义鉴定的O.s.-OK1蛋白质的核酸如SEQ ID NO 3所示，而编码O.s.-OK1蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO4所示。SEQ ID NO 4所示的编码O.s.-OK1蛋白质的氨基酸序列与SEQID NO 2所示的编码A.t.-OK1蛋白质的氨基酸序列间有57％同一性。SEQID NO 3所示的编码O.s.-OK1蛋白质的核酸序列与SEQ ID NO 1所示的编码A.t.-OK1蛋白质的核酸序列之间有61％同一性。
制备含有编码稻OK1蛋白质的核酸序列的质粒pMI50载体pMI50含有编码稻M202种系的完整OK1蛋白质的DNA片段。
对稻DNA的扩增分五小步进行。
以合成的寡核苷酸Os_ok1-R9(GGAACCGATAATGCCTACATGCTC)和Os_ok1-F6(AAAACTCGAGGAGGATCAATGACGTCGCTGCGGCCCCTC)为引物、通过逆转录酶和聚合酶链式反应用未成熟的稻种子RNA扩增SEQ DIE NO 3中指定序列的-11位至288位的开放阅读框部分。将扩增的DNA片段克隆入载体pCR2.1(Invitrogen目录号K2020-20)中。得到的质粒命名为pML123。
以合成的寡核苷酸Os_ok1-F4(CCAGGTTAAGTTTGGTGAGCA)和Os_ok1-R6(CAAAGCACGATATCTGACCTGT)为引物、通过逆转录酶和聚合酶链式反应用未成熟稻种子RNA扩增SEQ DIE NO 3中指定序列的250位至949位的开放阅读框部分。将扩增的DNA片段克隆入载体pCR2.1(Invitrogen目录号K2020-20)中。得到的质粒命名为pML120。
以合成的寡核苷酸Os_ok1-F7(TTGTTCGCGGGATATTGTCAGA)和Os_ok1-R7(GACAAGGGCATCAAGAGTAGTATC)为引物、通过逆转录酶和聚合酶链式反应用未成熟稻种子的RNA扩增SEQ DIE NO 3中指定序列的839位至1761位的开放阅读框部分。将扩增的DNA片段克隆入载体pCR2.1(Invitrogen目录号K2020-20)中。得到的质粒命名为pML121。
以合成的寡核苷酸Os_ok1-F8(ATGATGCGCCTGATAATGCT)和Os_ok1-R4(GGCAAACAGTATGAAGCACGA)为引物、通过逆转录酶和聚合酶链式反应用未成熟稻种子的RNA扩增SEQ DIE NO 3中指定序列的1571位至3241位的开放阅读框部分。将扩增的DNA片段克隆入载体pCR2.1(Invitrogen目录号K2020-20)中。得到的质粒命名为pML119。
以合成的寡核苷酸Os_ok1-F3(CATTTGGATCAATGGAGGATG)和Os_ok1-R2(CTATGGCTGTGGCCTGCTTTGCA)为引物、通过逆转录酶和聚合酶链式反应用稻基因组DNA扩增SEQ DIE NO 3中指定序列的2777位至3621位的开放阅读框部分。将扩增的DNA片段克隆入载体pCR2.1(Invitrogen目录号K2020-20)中。得到的质粒命名为pML122。
如下将OK1开放阅读框的子部分克隆在一起。
将含有OK1开放阅读框部分的长为700个碱基对的pML120 ApaI片段克隆入pML121的ApaI位点。得到的质粒命名为pM147。
通过聚合酶链式反应，扩增含有载体pML120和pML123中编码OK1区域的长为960碱基对的片段。其中使用浓度各为50nm的引物Os_ok1-F4(见上)和Os_ok1-R9(见上)，以及浓度各为500nm的Os_ok1-F6和Os_ok1-R6。将扩增的DNA片段克隆入载体pCR2.1(Invitrogen目录号K2020-20)中。得到的载体命名为pMI44。
以Os_ok1-F3(见上文)和Os_ok1-R2Xho(AAAACTCGAGCTATGGCTGTGGCCTGCTTTGCA)为引物，再扩增长为845碱基对的pML122片段，以在终止密码子之后引入XhoI位点，并将其克隆入载体pCR2.1(Invitrogen目录号K2020-20)中。得到的质粒命名为pMI45。
用限制性酶SpeI和PstI消化，从pML119中得到含有OK1部分开放阅读框的长为1671碱基对的片段。将该片段克隆入pBluescriptIISK+(Genbank Acc.X52328)中。得到的质粒命名为pMI46。
用限制性酶SpeI和XhoI切割，从pMI46中得到含有OK1部分开放阅读框的长为1706碱基对的片段。将该片段克隆入用相同限制性酶切割的载体pMI45中。得到的质粒命名为pMI47。
用限制性酶AflII/NotI切割，从pMI43中得到含有OK1部分开放阅读框的长为146碱基对的片段。将该片段克隆入用相同限制性酶切割的载体pMI44中。得到的质粒命名为pMI49。
用限制性酶NotI和NarI切割，从pMI49中得到含有OK1部分开放阅读框的长为1657碱基对的片段。将该片段克隆入用相同限制性酶切割的载体pMI47中。得到的质粒命名为pMI50，其中含有鉴定的稻OK1蛋白质的完整编码区。
10.鉴定多种植物种系中的其他OK1蛋白质使用一般方法第1至13条所述的方法，也能够鉴定大麦(Hordeumvulgare)、马铃薯(Solanum tuberosum)、小麦(普通小麦(Triticum aestivam))和黍(两色粟黍(Sorghum bicolor))中可将磷酸酯残基从ATP转移到磷酸化淀粉的蛋白质。非磷酸化淀粉不能作为这些蛋白质的底物，即这些蛋白质需要磷酸化淀粉作为底物。
使用一般方法第14条所述的方法，分离这些蛋白质。以胰蛋白酶消化、从凝胶中溶解出来，然后用Q-TOF-MS-MS测序。使用得到的肽序列，可以通过数据库比较(Blast检索)确定编码大麦、马铃薯、小麦或黍中相应OK1蛋白质的EST核酸序列。
SEQ ID NO 9所示的核酸序列编码大麦OK1蛋白质的一部分，通过数据库比较(Blast检索)，以登陆号TC117610在TIGR(http://tigrblast.tigr.org/tgi/)中发现。使用Q-TOF-MS-MS测序分离自大麦的OK1蛋白质而得到那些肽，它们也用于鉴定SEQ ID NO 9所示的EST核酸序列，其序列为SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 7和SEQ ID NO 8。SEQ ID NO 10所示的氨基酸序列编码大麦OK1蛋白质的一部分，其衍生自SEQ ID NO10所示的核酸序列。
SEQ ID NO 15所示的核酸序列编码马铃薯OK1蛋白质的一部分，通过数据库比较(Blast检索)，以登陆号BF054632在TIGR(http://tigrblast.tigr.org/tgi/)中发现。使用Q-TOF-MS-MS测序分离自马铃薯的OK1蛋白质而得到那些肽，它们也用于鉴定SEQ ID NO 15所示的EST核酸序列，其序列为SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 12、SEQ ID NO 13和SEQ IDNO 14。SEQ ID NO 16所示的氨基酸序列编码马铃薯OK1蛋白质的一部分，其衍生自SEQ ID NO 15所示的核酸序列。
SEQ ID NO 21所示的核酸序列编码黍OK1蛋白质的一部分，通过数据库比较(Blast检索)，以登陆号TC77219在TIGR(http://tigrblast.tigr.org/tgi/)中发现。使用Q-TOF-MS-MS测序分离自黍的OK1蛋白质而得到那些肽，它们也用于鉴定SEQ ID NO 21所示的EST核酸序列，其序列为SEQ ID NO 17、SEQ ID NO 18、SEQ ID NO 19和SEQ ID NO 20。SEQ ID NO 22所示的氨基酸序列编码黍OK1蛋白质的一部分，其衍生自SEQ ID NO 21所示的核酸序列。
SEQ ID NO 25所示的核酸序列编码小麦OK1蛋白质的一部分，通过数据库比较(Blast检索)，以登陆号CA74319在TIGR(http://tigrblast.tigr.org/tgi/)中发现。使用Q-TOF-MS-MS测序分离自小麦的OK1蛋白质而得到那些肽，它们也用于鉴定SEQ ID NO 25所示的EST核酸序列，其序列为SEQ ID NO 23和SEQ ID NO 24。SEQ ID NO 26所示的氨基酸序列编码小麦OK1蛋白质的一部分，其衍生自SEQ ID NO 25所示的核酸序列。
选择以下的设置以进行数据库比较Program(程序)tblastnMatrix(矩阵) blosum62
Expect(期望值)100EchofilterdisabledDescriptions 20其他所有的设置选择默认值。
11.制备特异性识别OK1蛋白质的抗体通过SDS凝胶电泳分离约100μg纯化的A.t.-OK1蛋白质作为抗原，将含有A.t.-OK1蛋白质的蛋白质条带切下并送至EUROGENTEC S.A.公司(比利时)，该公司根据合同制备抗体。在用重组的OK1免疫之前，先检查预免疫的兔血清是否已经能识别来自拟南芥总提取物的蛋白质。有2只兔的预免疫血清不能识别100-150kDa范围内的蛋白质，因此选其进行免疫。每只兔注射4次蛋白质，每次100μg(第0、14、28、56天)。从每只兔中取4份血样(第38、66、87天以及最后一次取血)。第一次取血后得到的血清已经在Western印迹中显示出与OK1抗原特异反应。然而在进一步的试验中使用的是最后一次的兔血样。
12.制备OK1活性增强或降低的转基因稻植物a)制备质粒pGlo-A.t.-OK1以glb1-F2(AAAACAATTGGCGCCTGGAGGGAGGAGA和glb1-R1(AAAACAATTGATGATCAATCAGACAATCACTAGAA)为引物、使用高保真Taq聚合酶(Invitrogen，目录号11304-011)，通过聚合酶链式反应(30×20秒，94℃；20秒，62℃；1分钟，68℃；4mM Mg2SO4)，用M202种系稻的基因组DNA扩增稻球蛋白基因的启动子，从而得到质粒pIR94，并将其克隆入pCR2.1(Invitrogen目录号K2020-20)中。
通过将由X1(TGCAGGCTGCAGAGCTCCTAGGCTCGAGTTAACACTAGTAAGCTTAATTAAGATATCATTTAC)和X2(AATTGTAAATGATATCTTAATTAAGCTTACTAGTGTTAACTCGAGCCTAGGAGCTCTGCAGCCTGCA)这2个寡核苷酸组成的DNA合成片段克隆入SdaI和MunI切割的载体pGSV71中，得到质粒pIR115。
所得质粒pIR115用SdaI切割，突出的3’-末端用T4DNA聚合酶补齐，并插入长为197碱基对的pBinAR(Hfgen和Willmitzer，1990，PlantScience 66，221-230)的HindIII/SphI片段，其是以T4DNA聚合酶补齐并含有根瘤土壤杆菌的章鱼碱合成酶基因的终止信号。得到的质粒命名为pIR96。
通过将pIR94中长为986碱基对的DNA片段克隆入质粒pIR96中，得到质粒pIR103；所述片段内含有稻球蛋白基因的启动子。
pGSV71为质粒pGSV7的衍生物，后者通过中间载体pGSV1衍生而来。pGSV1为pGSC1700的衍生物，所述pGSC1700的构建见Cornelissen和Vanderwiele(Nucleic Acid Research 17，(1989)，19-25)的描述。通过缺失羧苄青霉素耐药基因和缺失质粒pTiB6S3 TL-DNA的T-DNA序列，从pGSC1700获得pGSV1。
pGSV7含有质粒pBR322的复制起点(Bolivar等人，Gene 2，(1977)，95-113)以及假单胞菌(Psurdomona)质粒pVS1的复制起点(Itoh等人，Plasmid 11，(1984)，206)。pGSV7还含有肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)转位子Tn1331来源的选择性标记基因aadA，该基因赋予对抗生素大观霉素和链霉素的耐药性(Tolmasky，Plasmid 24(3)，(1990)，218-226；Tolmasky和Crosa，Plasmid 29(1)，(1993)，31-40)。
在pGSV7的交界区之间克隆入嵌合bar基因，可以得到质粒pGSV71。嵌合bar基因含有花椰菜花叶病毒的启动子序列(Odel等人，Nature 313，(1985)，180)用于起始转录、吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因(Thompson等人，Embo J.6，(1987)，2519-2523)，以及pTiT37中T-DNA的胭脂氨酸合酶基因的3′-不翻译区用于终止转录和多聚腺苷酸化。bar基因提供了对除草剂草铵膦的耐受性。
从载体A.t.-ok1-pGEM-T中切出含有拟南芥OK1蛋白质完整阅读框的DNA片段，并克隆入载体pIR103中。为此，用限制性酶Bsp120I切割质粒A.t.-OK1-pGEM-T，T4-DNA聚合酶补齐其末端，然后用SalI切割之。将编码拟南芥OK1蛋白质的DNA片段克隆入用Ecl136II和XhoI切割的载体pIR103中。得到的质粒命名为pGlo-A.t.-OK1。
b)制备构建体以通过RNAi技术抑制稻中的OK1蛋白质使用GatewayTM克隆系统(Invitrogen)进行质粒pML124和pIR115的特异重组，得到用于转化稻植物的质粒pML125。
将pML119中含有编码稻OK1蛋白质的开放阅读框部分的长为359碱基对的DNA片段(见上，实施例9)克隆入用EcoRI切割的载体pENTR-1A(Invitrogen，产品号11813-011)中，得到pML124。
以Adh(i)-1(TTTTCTCGAGGTCCGCCTTGTTTCTCCT)和Adh(i)-2(TTTTCTCGAGCTGCACGGGTCCAGGA)为引物，在玉米基因组DNA上扩增玉米乙醇脱氢酶编码基因的内含子1，得到质粒pIR87。用限制性酶XhoI消化聚合酶链式反应(30×30秒，94℃；30秒，59℃；1分钟，72℃；2.5mM MgCl2)的产物，并将其克隆入用同一种酶切割的载体pBluescriptII SK+(Genbank Acc.X52328)中。
将pIR94中含有稻球蛋白基因启动子的长为986碱基对的DNA片段克隆入载体pIR96中。得到的质粒命名为pIR103。
将“RfA盒”(见上)克隆入用限制性酶EcoRV切割的质粒pIR103中，得到质粒pIR107。
使用限制性酶XhoI从质粒pIR87上切出含有玉米乙醇脱氢酶编码基因内含子1的长为540碱基对的片段，并将其克隆入同样用XhoI切割的载体pIR107中。得到的质粒命名为pIR114。将“RfA盒”(见上)克隆入用限制性酶Ecl136II切割的质粒pIR114中，得到质粒pIR115。
c)稻植物的转化使用Hiei等人(1994，Plant Journal 6(2)，271-282)所述的方法，用土壤杆菌(含有质粒pGlo-A.t.-OK1或质粒pML125)转化稻植物(M202种系)。
d)分析表达A.t.-OK1蛋白质的转基因稻植物及其合成的淀粉通过Northern印迹分析，鉴定用质粒pGlo-A.t.-OK1转化且表达异源性A.t.-OK1蛋白质的稻植物。
在温室中培育含有可检测量的编码A.t.-OK1蛋白质的mRNA的植物。收获这些植物的谷粒。这些谷粒中的淀粉中共价连接于相关淀粉的磷酸酯含量升高。
e)分析内源性OK1蛋白质的表达受RNAi技术抑制的转基因植物及其合成的淀粉通过Northern印迹分析，鉴定用质粒pML125转化且其中编码OK1蛋白质的内源性mRNA表达减少的稻植物。
13.制备OK1活性增强或降低的转基因马铃薯植物a)制备质粒pBinB33-Hyg首先，从质粒pBinB33中切割出包括B33启动子、部分多聚接头和ocs终止子的EcoRI-HindIII片段，并将其连入相应切割的载体pBIB-Hyg中(Becker，1990，Nucl.Acids Res.18，203).Acids Res.18，203)。
将马铃薯patatin基因B33的启动子(Rocha-Sosa等人，1989)以DraI片段(核苷酸-1512至+14)的形式，连入SstI切割并以T4DNA聚合酶补齐其末端的载体pUC19中，得到质粒pBinB33。从而产生质粒pUC19-B33。用EcoRI和SmaI将B33启动子从该质粒中切割出来，并连入相应切割的载体pBinAR(Hfgen和Willmitzer，1990，Plant Science 66，221-230)中。从而产生植物表达载体pBinB33。
b)制备载体A.t.-OK1-pBinB33-Hyg用限制性内切酶Bsp120I和SaII从质粒OKI-pGEM中切出A.t.-OK1蛋白质的编码序列，连入用SmaI和SaII切割的载体pBinB33-Hyg中。得到的载体命名为A.t.-OK1-pBinB33-Hyg。
c)转化马铃薯植物用质粒A.t.-OK1-pBinB33-Hyg转化根瘤土壤杆菌(菌株GV2260)。然后通过Rocha-Sosa等人(EMBO J.8，(1989)，23-29)所述的方法，使用含有质粒A.t.-OK1-pBinB33-Hyg的土壤杆菌转化Désirée种系的马铃薯植物，并再生该植物。该转化事件得到的植物命名为385JH。
d)分析该转基因马铃薯植物及其合成的淀粉通过Western印迹分析，鉴定异源性表达的A.t.-OK1蛋白质活性增强的植物，以及内源性OK1蛋白质活性受共抑制效应而降低的植物。使用实施例11所述的抗体进行Western印迹分析。
图7例示了用Western印迹分析检测来自转化事件的植物385JH中的A.t.-OK1蛋白质。在组织培养液中含100mM蔗糖的固相MusharigeSkoog培养基中培育单一种系转化植物385JH 2天，以诱导叶组织中的B33启动子。收获后，根据一般方法第1a)条所述的方法从这些植物的叶组织中制备蛋白质提取物。通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质后，用第10实施例中所述的抗体通过Western印迹分析，分析各系的40μg蛋白质提取物。作为对照样品，也分析拟南芥植物和马铃薯野生型植物(cv Désirée)的蛋白质提取物。
将A.t.-OK1蛋白质的量比相应野生型植物增加的植物种植在温室内。在这些植物块茎分离的淀粉中，共价连接于淀粉的磷酸酯含量相对于未转化的野生型植物中分离的淀粉提高。
14.分析本发明蛋白质活性降低的拟南芥植物将插入的OK1基因为纯合子的拟南芥T-DNA插入突变体(获自SalkInstitute Genomic Analysis Laboratory，10010 N.Torrey Pines Road，LaJolla，CA 92037，http://signal.salk.edu/，ACC.No.Salk_110814，AliasN610814)在以下条件下生长光照阶段16小时，20℃黑暗阶段8小时，16℃在花即将发育前，将植物在光照阶段中20℃培育12小时，黑暗阶段中17℃培育12小时。
得到的突变体种系(Salk 110814)是从原始种子材料的3个不同种子(Salk_110814-1，Salk_110814-2，Salk_110814-3)培育而来，用于分析。
在黑暗阶段结束时，从6株野生型植物(kotyp Columbia)中分别摘取10片叶子，在70％的乙醇中50℃脱色。此外，从突变体种系Salk_110814-1，Salk_110814-2或Salk_110814-3的各4株不同植物中分别摘取6片叶子，所述植物对于OK1基因中插入的T-DNA而言是纯合的，并将这些叶子在70％乙醇中50℃脱色。然后在Lugol’s溶液中温育叶子10分钟，用自来水将多余的Lugol’s溶液冲尽。所有野生型植物的叶子不被Lugol’s溶液染色。而另一方面，所有突变体种系Salk_110814-1，Salk_110814-2或Salk_110814-3的叶子显色为深棕色或黑色(见图7)。因此，突变体种系相对于野生型植物表现为淀粉过量表型。培育中突变体种系和野生型植物之间在生长上没有差异。
使用实施例10所述的抗体通过Western印迹分析，分析用含有OK1基因编码区“反向重复”(35S启动子调控)的RNAi构建体转化的经遗传修饰的拟南芥植物。鉴定OK1蛋白质的量相对于野生型植物减少的若干独立种系。在前述培养条件下培育这些种系。每次在黑暗阶段(17℃12小时)结束时，从各个种系中摘取5片叶子，在乙醇中脱色并用Lugol’s溶液染色。与相应野生型相比，所有这些植物均为淀粉过量的表现型。培育中经遗传修饰的植物和野生型植物之间在生长上没有差异。因此，通过RNAi技术经遗传修饰的植物与突变体种系Salk_110814-1，Salk_110814-2或Salk_110814-3的特性相同。
每次分析种系A.t.-α-OK1-1、A.t.-α-OK1-2、A.t.-α-OK1-3、A.t.-α-OK1-4、A.t.-α-OK1-5的四株拟南芥植物不同时期的淀粉含量，所述种系为通过RNAi技术减少OK1蛋白质的量的独立转化事件所产生。通过Western印迹分析，可以证实各个种系中OK1蛋白质的量的减少(见图8)。使用Boehringer Mannheim的淀粉试剂盒(产品号0207748)确定各个种系叶中的淀粉含量。为此，收集各个种系中四株植物的所有叶子，用研钵将这些叶子匀浆。每种情况取40mg至60mg匀浆的叶材料用80％的乙醇洗涤两次，弃去上清液。所剩不溶于乙醇的材料用1ml水洗涤一次后冷冻干燥，然后95℃下溶于0.5ml 0.2M KOH 1小时，并用88μl 1M乙酸调整得到的溶液的pH至7。取所得溶液各25μl与已加入1单位α-淀粉酶(产自解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，Boehringer，产品号161764)的50μl淀粉葡糖苷酶溶液(Boehringer Mannheim的淀粉试剂盒，产品号0207748)混合，在55℃下温育1小时。然后使用酶联光度测试(见来自Boehringer In mgelheim，确定天然淀粉的产品信息单，产品号0207748)，使用该20μl用淀粉葡糖苷酶和α-淀粉酶处理的溶液确定葡萄糖。同时与转基因种系一样，也确定拟南芥野生型植物(EcotypeColumbia)叶中的淀粉含量。野生型植物和转基因植物在相同条件下培养12小时光照阶段，随后为12小时黑暗阶段。
在黑暗阶段结束后种子萌发后约4.5周时，在光照阶段结束后以及紧接光照阶段的第二黑暗阶段结束后，收集各转基因植物种系和野生型植物的叶子。对于每一转基因植物种系而言，各制备2份独立提取物，从而得出2个淀粉含量的测量值。对于野生型植物而言制备4份独立提取物，每个得出2个淀粉含量的测量值。得到以下确定的叶中淀粉含量的结果种系 淀粉含量(mg/g FW) 标准差*黑暗阶段1结束A.t.-α-OK1-14.090.55A.t.-α-OK1-24.930.94A.t.-α-OK1-35.590.52A.t.-α-OK1-46.360.87野生型 0.780.14光照阶段结束A.t.-α-OK1-19.300.96A.t.-α-OK1-29.861.45A.t.-α-OK1-311.68 1.60A.t.-α-OK1-49.531.25A.t.-α-OK1-56.610.71野生型 5.610.72
黑暗阶段2结束A.t.-α-OK1-13.920.83A.t.-α-OK1-24.351.07A.t.-α-OK1-36.000.63A.t.-α-OK1-45.341.35A.t.-α-OK1-51.460.56野生型 0.620.18表4使用RNAi技术降低OK1蛋白质的量的拟南芥植物叶中淀粉的含量。
*使用一般公式得到的标准差[(n∑x2-(∑x)2)/n(n-1)]的平方根15.分析分离自OK1蛋白质活性降低的植物的淀粉从实施例14所述的植物叶中分离淀粉，并用一般方法第13条所述的方法水解，然后通过HPAE分析的分离。计算HPAE分析中得到的C-3磷酸酯和C-6磷酸酯分离信号的面积(软件Chromelion6.20，Dionex，USA)，得到的值以两者的比值表示。野生型植物中C-6磷酸酯与C-3磷酸酯的比例为2.1。而另一方面，实施例14所述的通过RNAi技术降低OK1蛋白质活性的植物中，根据分离自种系A.t.-α-OK1-1、A.t.-α-OK1-2、A.t.-α-OK1-3、A.t.-α-OK1-4和A.t.-α-OK1-5的淀粉分析得到的C-6磷酸酯与C-3磷酸酯的平均比例为2.5。对A.t.-α-OK1-5种系的淀粉分析所得的C-6磷酸酯与C-3磷酸酯比例最低(比例为2.2)，来自A.t.-α-OK1-1种系的淀粉的比例最高(比例为2.7)。
在所涉及的淀粉中，分离自OK1蛋白质活性降低的实施例13的突变体叶的淀粉中C-6磷酸酯与C-3磷酸酯的比例提高。
序列表<110>拜尔作物科学有限公司<120>鉴定具有淀粉磷酸化酶促活性的蛋白质的方法<130>BCS 04-5001-PCT<150>EP04090483.1<151>2004-12-15<150>EP04090121.7<151>2004-03-29<150>EP04090087.0<151>2004-03-05<150>US60/549,980 provisional<151>2004-03-05<160>26<170>PatentIn版本3.1<210>1<211>3591<212>DNA<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)<220>
<221>CDS<222>(1)..(3591)<223>
<400>1atg gag agc att ggc agc cat tgt tgc agc tct cct ttc acc ttc atc48Met Glu Ser Ile Gly Ser His Cys Cys Ser Ser Pro Phe Thr Phe Ile1 5 10 15act aga aac tca tca tca tca ctt cct aga ctc gtt aac atc act cac96Thr Arg Asn Ser Ser Ser Ser Leu Pro Arg Leu Val Asn Ile Thr His20 25 30aga gtt aat ctc agc cac caa tct cac cga ctc aga aac tcc aat tct144Arg Val Asn Leu Ser His Gln Ser His Arg Leu Arg Asn Ser Asn Ser35 40 45cgt ctc act tgc act gct act tct tct tcc acc att gag gaa caa cgg192Arg Leu Thr Cys Thr Ala Thr Ser Ser Ser Thr Ile Glu Glu Gln Arg50 55 60
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Gly Phe Ala Cys Arg Gly Arg Ser Ala Ala Ser Ala Ala Glu Arg Thr50 55 60aag gag aaa aag aga aga gat tct tca aag cag cca ttg gtg cat ctc243Lys Glu Lys Lys Arg Arg Asp Ser Ser Lys Gln Pro Leu Val His Leu65 70 75cag gtt tgt cta gag cac cag gtt aag ttt ggt gag cat gta ggc att291Gln Val Cys Leu Glu His Gln Val Lys Phe Gly Glu His Val Gly Ile80 85 90atc ggt tcc aca aag gag ctt ggt tca tgg gag gag cag gtt gaa ctg339Ile Gly Ser Thr Lys Glu Leu Gly Ser Trp Glu Glu Gln Val Glu Leu95 100 105gaa tgg act aca aat ggt tgg gtc tgc cag ctt aag ctc cct gga gaa387Glu Trp Thr Thr Asn Gly Trp Val Cys Gln Leu Lys Leu Pro Gly Glu110 115 120 125aca ctt gtg gag ttt aaa ttt gtt ata ttt ttg gtg gga gga aaa gat435Thr Leu Val Glu Phe Lys Phe Val Ile Phe Leu Val Gly Gly Lys Asp130 135 140aaa ata tgg gaa gat ggt aat aac cgt gtt gtt gag ctg ccg aag gat483Lys Ile Trp Glu Asp Gly Asn Asn Arg Val Val Glu Leu Pro Lys Asp145 150 155ggt aag ttt gat ata gta tgc cac tgg aat aga aca gaa gag cca tta531Gly Lys Phe Asp Ile Val Cys His Trp Asn Arg Thr Glu Glu Pro Leu160 165 170gaa ctt tta gga aca cca aag ttt gag ttg gtc gga gaa gct gaa aag579Glu Leu Leu Gly Thr Pro Lys Phe Glu Leu Val Gly Glu Ala Glu Lys175 180 185aat act ggc gag gat gct tca gca tct gta act ttt gca cct gaa aaa627Asn Thr Gly Glu Asp Ala Ser Ala Ser Val Thr Phe Ala Pro Glu Lys190 195 200 205gtt caa gat att tca gtt gtt gag aat ggt gat cca gca cca gag gcc675Val Gln Asp Ile Ser Val Val Glu Asn Gly Asp Pro Ala Pro Glu Ala210 215 220gag tca agc aaa ttt ggt ggg caa tgg caa gga agt aaa act gtt ttc723Glu Ser Ser Lys Phe Gly Gly Gln Trp Gln Gly Ser Lys Thr Val Phe225 230 235atg aga tca aat gag cat ctg aat aag gag gct gat agg atg tgg gat771Met Arg Ser Asn Glu His Leu Asn Lys Glu Ala Asp Arg Met Trp Asp240 245 250aca act ggg ctt gat gga ata gca ctg aaa ctg gtg gag ggc gat aaa819
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<400>15gcg gat gct tea ata gct atg cgt cag aag tgg cgt ctc tgc gaa atc48Ala Asp Ala Ser Ile Ala Met Arg Gln Lys Trp Arg Leu Cys Glu Ile1 5 10 15ggg ctt gaa gac tat gca ttt gtt ctt ttg agc agg ttt gtg aat gca96Gly Leu Glu Asp Tyr Ala Phe Val Leu Leu Ser Arg Phe Val Asn Ala20 25 30gtt gaa gct cta ggc gga gct gat tgg ctt gca gag aat gta aca gtg144Val Glu Ala Leu Gly Gly Ala Asp Trp Leu Ala Glu Asn Val Thr Val35 40 45aaa aac att agt tct tgg aat gat cca att gga gca ctt aca gtt gga192Lys Asn Ile Ser Ser Trp Asn Asp Pro Ile Gly Ala Leu Thr Val Gly50 55 60atc caa cag cta ggt ata tct ggt tgg aag ccc gag gaa tgc aaa gct240Ile Gln Gln Leu Gly Ile Ser Gly Trp Lys Pro Glu Glu Cys Lys Ala65 70 75 80gtt gga aat gaa ctt ttg tca tgg aaa gaa agg ggt att tca gaa att288Val Gly Asn Glu Leu Leu Ser Trp Lys Glu Arg Gly Ile Ser Glu Ile85 90 95gaa ggc agc gaa gat ggt aag act ata tgg gca tta aga cta aaa gcg336Glu Gly Ser Glu Asp Gly Lys Thr Ile Trp Ala Leu Arg Leu Lys Ala100 105 110
act ctt gat aga agt cga agg tta act gag gag tat tcc gag aca ctt384Thr Leu Asp Arg Ser Arg Arg Leu Thr Glu Glu Tyr Ser Glu Thr Leu115 120 125ctc caa ata ttc cct gaa a 403Leu Gln Ile Phe Pro Glu130<210>16<211>134<212>PRT<213>马铃薯<400>16Ala Asp Ala Ser Ile Ala Met Arg Gln Lys Trp Arg Leu Cys Glu Ile1 5 10 15Gly Leu Glu Asp Tyr Ala Phe Val Leu Leu Ser Arg Phe Val Asn Ala20 25 30Val Glu Ala Leu Gly Gly Ala Asp Trp Leu Ala Glu Asn Val Thr Val35 40 45Lys Asn Ile Ser Ser Trp Asn Asp Pro Ile Gly Ala Leu Thr Val Gly50 55 60Ile Gln Gln Leu Gly Ile Ser Gly Trp Lys Pro Glu Glu Cys Lys Ala65 70 75 80Val Gly Asn Glu Leu Leu Ser Trp Lys Glu Arg Gly Ile Ser Glu Ile85 90 95Glu Gly Ser Glu Asp Gly Lys Thr Ile Trp Ala Leu Arg Leu Lys Ala100 105 110Thr Leu Asp Arg Ser Arg Arg Leu Thr Glu Glu Tyr Ser Glu Thr Leu115 120 125Leu Gln Ile Phe Pro Glu130<210>17<211>7<212>PRT<213>两色粟黍<400>17Asp Gly Gly His His Arg Pro
1 5<210>18<211>8<212>PRT<213>两色粟黍<400>18Asp Ala Pro Asp Ser Ala Ile Ala1 5<210>19<211>9<212>PRT<213>两色粟黍<400>19Ile Pro Glu Asn Ser Val Arg Thr Tyr1 5<210>20<211>6<212>PRT<213>两色粟黍<400>20Val Asn Lys Ala Asp Gly1 5<210>21<211>1526<212>DNA<213>两色粟黍<220>
<221>CDS<222>(2)..(1525)<223>
<400>21g cac gag gct gaa tat gtt cat gat cag agt cac ctg gag gct ctt aca49His Glu Ala Glu Tyr Val His Asp Gln Ser His Leu Glu Ala Leu Thr1 5 10 15
tat tct gca ata tat cta aag tgg ata tat act ggt caa ata cca tgc97Tyr Ser Ala Ile Tyr Leu Lys Trp Ile Tyr Thr Gly Gln Ile Pro Cys20 25 30ttt gag gat ggt ggt cac cat cga ccc aat aaa cat gct gag ata tcc145Phe Glu Asp Gly Gly His His Arg Pro Asn Lys His Ala Glu Ile Ser35 40 45agg caa att ttt cgt gaa att gaa agg ata tac tat ggg gaa aac aca193Arg Gln Ile Phe Arg Glu Ile Glu Arg Ile Tyr Tyr Gly Glu Asn Thr50 55 60tca gct cag gat ttg ctt gtg ata cgc aag att cat cct tgt cta cct241Ser Ala Gln Asp Leu Leu Val Ile Arg Lys Ile His Pro Cys Leu Pro65 70 75 80tca ttt aaa tca gaa ttt act gcc tct gtt cct cta aca cga att cgt289Ser Phe Lys Ser Glu Phe Thr Ala Ser Val Pro Leu Thr Arg Ile Arg85 90 95gat att gct cat cgt aat gac ata cca cat gat ctc aag caa gaa atc337Asp Ile Ala His Arg Asn Asp Ile Pro His Asp Leu Lys Gln Glu Ile100 105 110aag cat act ata caa aac aag ctt cac cgg aat gcc ggc cct gag gat385Lys His Thr Ile Gln Asn Lys Leu His Arg Asn Ala Gly Pro Glu Asp115 120 125ctt att gct act gaa gcc atg ctt gct agg att act aag act cct gga433Leu Ile Ala Thr Glu Ala Met Leu Ala Arg Ile Thr Lys Thr Pro Gly130 135 140gag tac agt gaa gct ttt gtt gaa caa ttc aag acg ttt tat agt gaa481Glu Tyr Ser Glu Ala Phe Val Glu Gln Phe Lys Thr Phe Tyr Ser Glu145 150 155 160tta aaa gat ttc ttc aat gct ggc agc cta ctg gag caa gtg caa tcc529Leu Lys Asp Phe Phe Asn Ala Gly Ser Leu Leu Glu Gln Val Gln Ser165 170 175atc gag caa tct ttg gat gag tct ggc tta gaa gct ctc tca tcc ttt577Ile Glu Gln Ser Leu Asp Glu Ser Gly Leu Glu Ala Leu Ser Ser Phe180 185 190ctg aaa acc aaa aag aat tta gac caa ctg gaa gat gca aaa gat ttg625Leu Lys Thr Lys Lys Asn Leu Asp Gln Leu Glu Asp Ala Lys Asp Leu195 200 205gat gaa aat ggt ggc gtt caa gtt ttg ttg aaa gcc ttg ctg tcg tta673Asp Glu Asn Gly Gly Val Gln Val Leu Leu Lys Ala Leu Leu Ser Leu210 215 220
tct tat cta aga tca att cta atg aag ggt ctg gaa agt ggc ctt aga721Ser Tyr Leu Arg Ser Ile Leu Met Lys Gly Leu Glu Ser Gly Leu Arg225 230 235 240aat gat gct cca gat agt gct att gca atg cga caa aag tgg cgt ctt769Asn Asp Ala Pro Asp Ser Ala Ile Ala Met Arg Gln Lys Trp Arg Leu245 250 255tgt gag atc ggg ctt gaa gat tat tcg ttt gta ttg tta agt aga tac817Cys Glu Ile Gly Leu Glu Asp Tyr Ser Phe Val Leu Leu Ser Arg Tyr260 265 270atc aat gct ctt gaa gct ttg ggt gga tca gct tca ctt gca gag ggt865Ile Asn Ala Leu Glu Ala Leu Gly Gly Ser Ala Ser Leu Ala Glu Gly275 280 285ctt cct aca aat aca agt cta tgg gat gat gcc ctt gat gcc ctt gtc913Leu Pro Thr Asn Thr Ser Leu Trp Asp Asp Ala Leu Asp Ala Leu Val290 295 300att ggc ata aat caa gtt agc ttt tca gga tgg aaa cca aat gag tgt96lIle Gly Ile Asn Gln Val Ser Phe Ser Gly Trp Lys Pro Asn Glu Cys305 310 315 320act gca ata gtg aat gag ctt ctt tct tgg aag cag aaa ggt cta tct1009Thr Ala Ile Val Asn Glu Leu Leu Ser Trp Lys Gln Lys Gly Leu Ser325 330 335gaa ttt gaa ggc agt gag gat gga aag tat att tgg gca ctg aga ctc1057Glu Phe Glu Gly Ser Glu Asp Gly Lys Tyr Ile Trp Ala Leu Arg Leu340 345 350aaa gcc act ctt gat aga tca cga aga cta aca gaa gaa tac tct gaa1105Lys Ala Thr Leu Asp Arg Ser Arg Arg Leu Thr Glu Glu Tyr Ser Glu355 360 365gca ctt ctt tct ata ttt cct gaa aaa gtc aag gtt ctt ggg aaa gcc1153Ala Leu Leu Ser Ile Phe Pro Glu Lys Val Lys Val Leu Gly Lys Ala370 375 380ctt gga ata cca gag aac agt gtg aga aca tac act gaa gct gaa att1201Leu Gly Ile Pro Glu Asn Ser Val Arg Thr Tyr Thr Glu Ala Glu Ile385 390 395 400cgt gct ggt gtt att ttt cac gtc tcg aaa ctt tgc act gta ctt tta1249Arg Ala Gly Val Ile Phe His Val Ser Lys Leu Cys Thr Val Leu Leu405 410 415aaa gca act cga gca gtt ctt gga tcg tct gtg tgg gat gtt ctt gtt1297Lys Ala Thr Arg Ala Val Leu Gly Ser Ser Val Trp Asp Val Leu Val420 425 430
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Leu Ile Ala Thr Glu Ala Met Leu Ala Arg Ile Thr Lys Thr Pro Gly130 135 140Glu Tyr Ser Glu Ala Phe Val Glu Gln Phe Lys Thr Phe Tyr Ser Glu145 150 155 160Leu Lys Asp Phe Phe Asn Ala Gly Ser Leu Leu Glu Gln Val Gln Ser165 170 175Ile Glu Gln Ser Leu Asp Glu Ser Gly Leu Glu Ala Leu Ser Ser Phe180 185 190Leu Lys Thr Lys Lys Asn Leu Asp Gln Leu Glu Asp Ala Lys Asp Leu195 200 205Asp Glu Asn Gly Gly Val Gln Val Leu Leu Lys Ala Leu Leu Ser Leu210 215 220Ser Tyr Leu Arg Ser Ile Leu Met Lys Gly Leu Glu Ser Gly Leu Arg225 230 235 240Asn Asp Ala Pro Asp Ser Ala Ile Ala Met Arg Gln Lys Trp Arg Leu245 250 255Cys Glu Ile Gly Leu Glu Asp Tyr Ser Phe Val Leu Leu Ser Arg Tyr260 265 270Ile Asn Ala Leu Glu Ala Leu Gly Gly Ser Ala Ser Leu Ala Glu Gly275 280 285Leu Pro Thr Asn Thr Ser Leu Trp Asp Asp Ala Leu Asp Ala Leu Val290 295 300Ile Gly Ile Asn Gln Val Ser Phe Ser Gly Trp Lys Pro Asn Glu Cys305 310 315 320Thr Ala Ile Val Asn Glu Leu Leu Ser Trp Lys Gln Lys Gly Leu Ser325 330 335Glu Phe Glu Gly Ser Glu Asp Gly Lys Tyr Ile Trp Ala Leu Arg Leu340 345 350Lys Ala Thr Leu Asp Arg Ser Arg Arg Leu Thr Glu Glu Tyr Ser Glu355 360 365Ala Leu Leu Ser Ile Phe Pro Glu Lys Val Lys Val Leu Gly Lys Ala370 375 380Leu Gly Ile Pro Glu Asn Ser Val Arg Thr Tyr Thr Glu Ala Glu Ile385 390 395 400Arg Ala Gly Val Ile Phe His Val Ser Lys Leu Cys Thr Val Leu Leu
405 410 415Lys Ala Thr Arg Ala Val Leu Gly Ser Ser Val Trp Asp Val Leu Val420 425 430Pro Gly Val Ala His Gly Ala Leu Ile Gln Val Glu Arg Ile Ala Pro435 440 445Gly Ser Leu Pro Ser Ser Ile Lys Glu Pro Val Val Leu Val Val Asn450 455 460Lys Ala Asp Gly Asp Glu Glu Val Lys Ala Ala Gly Asp Asn Ile Val465 470 475 480Gly Val Ile Leu Leu Gln Glu Leu Pro His Leu Ser His Leu Gly Val485 490 495Arg Ala Arg Gln Glu Lys Val Val Phe Val Thr Cys500 505<210>23<211>8<212>PRT<213>普通小麦(Triticum aestivum)<400>23Arg Asn Asp Ala Thr Asp Ala Gly1 5<210>24<211>8<212>PRT<213>普通小麦<400>24Gly Asn Thr Ser Val Trp Asp Asp1 5<210>25<211>509<212>DNA<213>普通小麦<220>
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<400>26Asn Gly Ala Phe Val Glu Gln Phe Gln Ile Phe Tyr Ser Glu Leu Lys1 5 10 15Asp Phe Phe Asn Ala Gly Ser Leu Phe Glu Gln Leu Glu Ser Ile Lys20 25 30Glu Ser Leu Asn Asp Ser Gly Leu Glu Ala Leu Ser Ser Phe Val Lys35 40 45Thr Lys Gln Ser Leu Asp Gln Val Asp Ala Ala Asn Ile Gln Val Val50 55 60Met Lys Thr Leu Gln Ser Leu Ser Ser Leu Arg Ser Val Leu Met Lys65 70 75 80Gly Leu Glu Ser Gly Leu Arg Asn Asp Ala Thr Asp Ala Gly Ile Ala85 90 95Met Arg Gln Lys Trp Arg Leu Cys Glu Ile Gly Leu Glu Asp Tyr Ser100 105 110Phe Val Leu Leu Ser Arg Tyr Ile Asn Gly Leu Glu Ala Ser Gly Gly115 120 125Ser Ala Ser Leu Ala Gln Cys Val Ala Gly Asn Thr Ser Val Trp Asp130 135 140Asp Thr Leu Asp Ala Leu Ile Ile Gly Val Asn Gln Val Ser Phe Ser145 150 155 160Gly Trp Lys Pro Glu Glu Cys Ile Ala16权利要求
1.一种鉴定对磷酸化α-1，4-葡聚糖的结合活性比对非磷酸化α-1，4-葡聚糖的结合活性增强的蛋白质的方法，其中a)在彼此分离的制备物中将蛋白质提取物与以下物质温育i磷酸化α-1，4-葡聚糖，和ii非磷酸化α-1，4-葡聚糖，b)特异结合于i步骤a)i中的磷酸化α-1，4-葡聚糖的蛋白质，和ii特异结合于步骤a)ii中的非磷酸化α-1，4-葡聚糖的蛋白质溶解于彼此分离的制备物中，且c)鉴定蛋白质，其与步骤b)i中所用的磷酸化α-1，4-葡聚糖的结合活性比其与步骤b)ii中所用的非磷酸化α-1，4-葡聚糖的结合活性增强。
2.一种鉴定具有α-1，4-葡聚糖磷酸化酶促活性且需要以磷酸化α-1，4-葡聚糖做为底物的蛋白质的方法，其中a)蛋白质提取物与磷酸化α-1，4-葡聚糖温育，b)溶解特异结合于步骤a)中的磷酸化α-1，4-葡聚糖的蛋白质，c)在彼此分离的制备物中，根据步骤b)获得的蛋白质分别与以下物质温育i ATP和磷酸化α-1，4-葡聚糖，和ii ATP和非磷酸化α-1，4-葡聚糖，d)检查步骤c)i或步骤c)ii中温育后获得的相应α-1，4-葡聚糖中引入的其他磷酸酯基，且e)鉴定蛋白质，其在根据c)i的温育制备物中向α-1，4-葡聚糖中引入了大量磷酸酯基，而在根据c)ii的温育制备物中未向α-1，4-葡聚糖中引入大量磷酸酯基。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述具有α-1，4-葡聚糖磷酸化酶促活性的蛋白质以磷酸化淀粉做为底物。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述具有α-1，4-葡聚糖磷酸化酶促活性的蛋白质来自植物。
5.一种根据权利要求1至4中任一项的方法获得的蛋白质。
6.一种鉴定具有α-1，4-葡聚糖磷酸化酶促活性的蛋白质的编码核酸分子的方法，其中a)使用根据权利要求1至4中任一项的方法鉴定蛋白质，b)确定根据步骤a)鉴定的蛋白质的编码氨基酸序列，且c)使用根据步骤b)确定的氨基酸鉴定核酸分子。
7.根据权利要求6所述的方法，其中制备基于根据步骤b)确定的氨基酸序列的核酸寡核苷酸，以鉴定根据步骤c)的所述核酸分子。
8.一种鉴定具有α-1，4-葡聚糖磷酸化酶促活性的蛋白质的编码核酸分子的方法，其中a)使用根据权利要求1至4中任一项的方法鉴定蛋白质，b)制备与根据步骤a)鉴定的蛋白质特异性反应的抗体，且c)使用根据步骤b)制备的抗体鉴定核酸分子。
9.一种根据权利要求6、7或8中任一项的方法获得的核酸分子。
10.一种经遗传修饰的植物细胞，其特征在于与未经遗传修饰的相应野生型植物细胞相比，其根据权利要求5的蛋白质或根据权利要求1至4中任一项的方法获得的蛋白质的酶促活性增强。
11.根据权利要求10所述的经遗传修饰的植物细胞，其中所述植物是玉米、稻、小麦、黑麦、燕麦、大麦、木薯、马铃薯、甘薯、西米、绿豆、香蕉、豌豆、拟南芥、姜黄或高粱植物。
12.一种经遗传修饰的植物，其特征在于所述遗传修饰由向所述植物基因组中引入至少一种根据权利要求9的外源性核酸分子或根据权利要求6、7或8中任一项的方法获得的外源性核酸分子组成。
13.根据权利要求12所述的经遗传修饰的植物细胞，其合成相对于相应野生型植物细胞的淀粉而言改性的淀粉。
14.根据权利要求13所述的经遗传修饰的植物细胞，与相应野生型植物的淀粉相比，其合成的改性淀粉具有增加的淀粉磷酸酯含量和/或改变的磷酸酯分布。
15.根据权利要求14所述的植物细胞，其中与相应野生型植物细胞的淀粉相比，所述改性淀粉的特征在于共价连接于淀粉中葡萄糖分子C-3位点的磷酸酯含量增加。
16.一种含有根据权利要求10至15中任一项的经遗传修饰植物细胞的植物。
17.根据权利要求16所述的植物，其是玉米、稻、小麦、黑麦、燕麦、大麦、木薯、马铃薯、西米、绿豆、豌豆或高粱植物。
18.根据权利要求17所述的植物，其是玉米或小麦植物。
全文摘要
本发明涉及鉴定淀粉磷酸化相关蛋白质及其编码核酸的方法。本发明还涉及蛋白质活性改变的植物细胞和植物，所述蛋白质可用本发明的方法鉴定。此类植物细胞和植物合成改性的淀粉。因此，本发明还涉及由本发明的植物细胞和植物合成的淀粉，以及制备该淀粉的方法；还涉及制备该改性淀粉的淀粉衍生物。
文档编号C12N9/12GK1930301SQ200580006962
公开日2007年3月14日 申请日期2005年3月4日 优先权日2004年3月5日
发明者C·弗罗贝格, O·克廷, G·里特, M·施托伊普 申请人:拜尔作物科学有限公司