生产发酵产物的方法

专利名称：：生产发酵产物的方法生产发酵产物的方法涉及的序列表本申请含有计算机可读形式的序列表。此计算机可读形式在此并入以供参考。本发明的背景本发明的领域本发明涉及在低于磨细的含淀粉材料的起始糊化(gelatinization)温度的温度下在葡糖淀粉酶存在下从磨细的含淀粉材料，例如粒状淀粉生产发酵产物的方法。相关技术的描述谷物，谷类或植物的块茎含有淀粉。该淀粉为显微颗粒形式，室温下不溶于水。当加热含水淀粉浆料时，颗粒膨胀并最终破裂，将淀粉分子分散进溶液中。在该"糊化，，过程期间，粘度显著增加。由于在典型的工业加工中固形物水平为大约30-40%,因此淀粉必须磨细(thinned)或"溶解"使其可被处理。该粘度的减d、一般在称为溶解(liquefaction)的过程中通过酶降解来完成。溶解期间，长链淀粉通过a-淀粉酶降解为更小的支链和直链的葡萄糖单元(糊精)。常规的酶溶解过程可按三步热浆料加工进行。浆料加热到80-85。C之间并加入耐热a-淀粉酶开始溶解。然后将浆料在105-125。C之间的温度下喷射蒸煮以完成浆料的糊化，冷却到60-95。C,且一般来说，再加入a-淀粉酶完成水解。溶解过程一般在5和6之间的pH下进行。磨细并溶解的整体谷物称为麦芽汁(mash)。在糖化期间，溶解的糊精进一步水解产生低分子糖DPw,可通过发酵诸如酵母的生物将其代谢。水解一般使用葡糖淀粉酶完成，作为选择或者除了葡糖淀粉酶外，可使用a-葡糖苷酶和/或酸性a-淀粉酶。完全糖化步骤一般持续达72小时，然而，共同的仅是在超过5(TC的温度下进行例如40-90分钟的预糖化，接着在称为同时糖化和发酵(SSF)的过程中在发酵期间完成4唐化。使用发酵生物，例如酵母，加入麦芽汁进行发酵。然后回收发酵产物。对于乙醇，例如燃料，饮料，或工业乙醇，一般在大约32。C的温度下进行发酵一般35-60小时。当发酵产物是啤酒时，一般在大约14。C的温度下进行发酵一J&达8天。发酵后，麦芽汁可用作，例如啤酒，或者蒸馏回收乙醇。该乙醇可用作，例如，燃料乙醇，々大料乙醇，和/或工业乙醇。从上文的讨论显而易见的是常规方法中的淀粉水解由于在各步骤期间需要不同的温度因此非常耗能。美国专利号4,316，956提供了将粒状淀粉转变成乙醇的发酵方法。欧洲专利号140410提供了用于淀粉水解的酶组合物。WO2004/081193涉及在发酵植物材料期间生产高水平乙醇的方法。该方法包括i)制备用于糖化的植物材料，ii)不需蒸煮将制备的植物材料转变成糖，和iii)发酵糖。本发明的目的是提供将磨细的含淀粉材料，例如粒状淀粉转化成发酵产物，例如乙醇的改进方法。本发明小结本发明提供了使用葡糖淀粉酶从含淀粉材料生产发酵产物而不需糊化所述含淀粉材料的方法。在第一个方面，本发明提供了从磨细的含淀粉材料生产发酵产物的方法，包括(a)用具有SEQIDNO:2所示氨基酸序列的葡糖淀粉酶，或与其至少70%相同的葡糖淀粉酶在低于所述含淀粉材料的起始糊化温度的温度下糖化磨细的含淀粉材料，(b)使用发酵生物发酵。步骤(a)和(b)可依次或同时进行。优选的是，在(a)步骤前制备含有水和磨细的含淀粉材料的浆料。干固形物含量(DS)位于20-55wt,。/o的范围内。为了暴露更多含淀粉材料的表面，可磨细该材料。在一个实施方案中，颗粒大小在0.05-3.0mm之间，或者至少30%的磨细的含淀粉材料可以通过具有0.05至3.0mm筛网的篩子。本发明的方法可在1到250小时的期间完成。糖化和/或发酵期间的pH可在3至7之间的范围内。发酵期间葡萄糖浓度可保持在低于大约3wt-。/。的水平。在一个优选的实施方案中，糖化和发酵同时进行。根据一个优选的实施方案，葡糖淀粉酶来自于A/zWa菌林，优选^/^/^^//^7菌林。葡糖淀粉酶以0.001至10AGU/gDS的含量存在。在优选的实施方案中，还存在酸性a-淀粉酶。酸性a-淀粉酶可以是真菌或细菌a-淀粉酶，优选来自于曲霉属(/1spwg/〃"力菌株，特别是黑曲霉(Am'ger)或米曲霉(Aoo;zae)的真菌a-淀粉酶。酸性a-淀粉酶以0.1至10AFAU/gDS的浓度存在。酸性a-淀粉酶与葡糖淀粉酶之间的比率在0.1至10AGU/AFAU之间。任选发酵后回收发酵产物，例如乙醇。在本发明过程中也可存在其它成份和酶活性。其它酶活性的例子有木聚糖酶，纤维素酶，和植酸酶活性。本发明的详细描述本发明提供了从含淀粉材料生产发酵产物而不需糊化所述含淀粉材料的方法。在一个实施方案中，糖化和发酵期间仅需要葡糖淀粉酶。根据本发明，无须溶解含淀粉材料的含水浆料可生产所需的发酵产物，例如乙醇。如果将含淀粉材料的含水浆料加热到超过糊化温度，则必须溶解。一般来说，本发明的方法包括在具有SEQIDNO:2所示序列的葡糖淀粉酶，或其同源物存在下在低于糊化温度下糖化磨细的含淀粉材料，以产生可被合适的发酵生物发酵成所需发酵产物的糖类。本发明人发现当使用SEQIDNO:2所示的来自于A/zWa的葡糖淀粉酶从未蒸煮的磨细玉米生产乙醇时，与使用来自黑曲霉或ra/aramycMemer加m7的葡糖淀粉酶的相应方法相比获得了明显更高的乙醇产量。在该方法中添加来自黑曲霉的真菌酸性a-淀粉酶(SEQIDNO:3)时，与使用黑曲霉葡糖淀粉酶和来自黑曲霉的真菌酸性a-淀粉酶的相应方法相比效果明显更高。因此，在第一个方面，本发明涉及从磨细的含淀粉材料生产发酵产物的方法，包^^舌(a)用具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的葡糖淀粉酶，或者与其至少70%相同的葡糖淀粉酶在低于所述含淀粉材料的起始糊化温度的温度下糖化磨细的含淀粉材料，(b)使用发酵生物发酵。本发明方法的步骤(a)和(b)可依次或同时进行。在步骤(a)之前，制备具有20-55wt,。/。含淀粉材料的干固形物，优选25-40wt.-。/。干固形物，更优选30-35%干固形物的诸如粒状淀粉的含淀粉材料的浆料。该浆料可包含水和/或生产用水，例如釜馏物(stillage)(逆流)，洗涤水，蒸发冷凝物或馏出物，蒸馏的侧线馏分(stripper)分离用水，或其它发酵产物工厂生产用水。由于本发明的方法在低于糊化温度下进行，因此不会发生明显的粘度增加，可按需要使用高水平的釜馏物(stillage)。在一个实施方案中，含水浆料含有从大约1到大约70vol,。/o的釜馏物，优选15-60%vol,。/。的釜馏物，特别是从大约30到50vol,。/。的釜馏物。磨细的含淀粉材料可通过将含淀粉材料磨成0.05至3.0mm，优选0.1-0.5mm的颗粒大小来制备。进行本发明的方法后，至少85%,至少86%,至少87%,至少88%，至少89%，至少90%,至少91%,至少92%,至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%,或优选至少99%的该含淀粉材料的干固形物转化成可溶性淀粉水解产物。温度在30-75。C之间，优选在45-60。C之间。在一个优选的实施方案中，步骤(a)和(b)以同时糖化和发酵过程进行。在该优选的实施方案中，该方法一4殳在28。C至36°C之间，例如29°C至35°C之间，例如30。C至34°C之间，例如大约32。C的温度下进行。根据本发明，该温度可在发酵期间上下调节。在一个实施方案中，进行同时糖化和发酵使得糖水平，例如葡萄糖水平保持在低水平，例如，低于大约3wt.-。/。，优选低于大约2wt.-%,更优选低于大约lwt,。/。.，甚至更优选低于大约0.5%,或甚至更优选低于大约0.1wt.-%。该低水平的糖可通过仅仅釆用调节酶和发酵生物的量来实现。本领域的技术人员可容易地测定使用的酶和发酵生物的量。也可选择使用的酶和发酵生物的量以维持麦芽糖在发酵培养基中的低浓度。例如，麦芽糖水平可维持在低于大约0.5wt.-。/。或低于大约0.2wt,%。8本发明的方法可在3至7之间，优选从3.5至6，或更优选从4到5范围内的pH下进行。含淀粉材料根据本发明可使用任何合适的含淀粉起始材料，包括粒状淀粉。起始材料一般根据所需发酵产物来选择。适用于本发明方法的含淀粉起始材料的例子包括块茎，根，茎，所有谷物(wholegrains),玉米，穗轴(cobs),小麦，大麦,黑麦，milo，西米(sago)，木薯(cassava)，木薯淀4分(tapioca),高梁，水稻，豌豆，菜豆，或谷类，含糖原材料，例如糖蜜，水果材料，糖，甘蔗或甜菜，马铃薯，和含纤维素材料，例如木材或植物残渣。蜡状(waxy)和非蜡状(non-waxy)类型的玉米和大麦都包含在内。术语"粒状淀粉"是指原始未蒸煮的淀粉，即以其在谷类，块茎或谷物中发现的天然形式的淀粉。淀粉在植物细胞内形成不溶于水的微d、颗粒。当放入冷水中时，淀粉颗粒可吸收少量液体并膨胀。在温度达到50。C至75°C时，膨胀是可逆的。然而，在更高温度下，开始称为"糊化，，的不可逆膨胀。需加工的粒状淀粉可以是高度精炼的淀粉品质，优选至少90%，至少95%,至少97%或至少99.5%纯或者可以是更粗制的含淀粉材料，包括含有诸如胚芽(germ)残留物和纤维的非淀粉成份的磨细的整体谷物。将诸如完整谷物的原材料磨细以打开该结构并允许进一步加工。根据本发明优选两种磨细方法即湿磨和干磨。在干磨中，磨细并使用全部谷粒(kemels)。湿磨可较好地分离胚芽和粉(meal)(淀粉颗粒和蛋白质)且通常应用于使用淀粉水解产物生产糖浆的情况。干磨和湿磨是淀粉加工领域熟知的且同样包含在本发明的方法中。磨细含淀粉材料以暴露更多表面。在一个实施方案中，颗粒大小在0.05至3.0mm之间，或者使得至少30%，优选至少50%,更优选至少70%,甚至更优选至少90%的磨细含淀粉材料可通过具有0.05至3.0mm筛网，优选0.1-0.5mm筛网的筛子。术语"起始糊化温度"是指开始淀粉糊化的最低温度。在水中加热的淀粉在50°C至75°C之间开始糊化；准确的糊化温度取决于特定的淀粉，且技术人员可容易地测定。因此，起始糊化温度可随植物种类，植物种类的特定品种以及生长条件而变化。在本发明上下文中，给定含淀粉材料的起始糊化温度是使用Gorinstein.S.和Lii.C.,Starch/Starke，Vol.44(12),第461-466页(1992)所述的方法5%的淀粉颗粒丧失双折射的温度。发酵产物术语"发酵产物"是指使用发酵生物通过包括发酵步骤的方法生产的产物。根据本发明涉及的发酵产物包括醇(例如，乙醇，曱醇，丁醇)，有机酸(例如，柠檬酸，乙酸，衣康酸，乳酸，葡萄糖酸)；S同(例如，丙酮)；氨基酸(例如，谷氨酸)；气体(例如，H2和C02);抗生素(例如，青霉素和四环素)；酶；维生素(例如，核黄素，B12,(3-胡萝卜素)；和激素。在一个优选的实施方案中，发酵产物是乙醇，例如，燃料乙醇；饮料乙醇，即饮用中性酒精；或工业乙醇或用于消费醇产业(例如，啤酒或葡萄酒)，乳产业(例如，发酵的乳产品)，皮革工业和烟草工业的产物。优选的啤酒类型包括麦芽酒(ales),浓烈黑啤酒(stouts),黑啤酒(porters),贮陈啤酒(lagers),苦啤酒(bitter)，麦芽酒(maltliquors)，happoushu,高酒精啤酒，低酒精啤酒，低热量啤酒或淡啤酒(lightbeer)。优选使用的发酵方法包括本领域熟知的乙醇发酵方法。优选的发酵方法是本领域熟知的厌氧发酵方法。发酵生物"发酵生物"是指适用于发酵方法且能够产生所需的发酵产物的任何生物，包括细菌和真菌生物。特别合适的发酵生物能够将诸如葡萄糖或麦芽糖的糖类直接或间接发酵，即转化成所需发酵产物。发酵生物的例子包括真菌生物，例如酵母。优选的酵母包括酵母属CSacc/2aramyce"菌抹，且特别是啤酒糖酵母(Sacc/wram3;cescerev/w'ae)。商业上可获得的酵母包括，例如，RedStarTM/LesaffreEthanolRed(可从RedStar/Lesaffre,USA获得)，FALI(可从Fleischmann，sYeast,adivisionofBumsPhilpFoodInc.,USA获得)，SUPERSTART(可从Alltech获得)，GERTSTRAND(可从GertStrandAB，Sweden获得)和FERMIOL(可从DSMSpecialties获得)。葡糖淀粉酶术语"葡糖淀粉酶活性"是指葡聚糖1，4-a-葡糖普酶，它水解末端1,4-连接的a-D-葡萄糖残基，连续从该链的非还原端释放(3-D-葡萄糖，属于酶分类EC3.2.1.3。用于本发明方法的葡糖淀粉酶具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列(氨基酸残基1至561)，或与SEQIDNO:2(氨基酸残基1至561)至少70%，优选至少75%,或至少80%，或至少85%,或90%,或至少95%,至少96%，至少97%,至少98%或甚至至少99%相同的氨基酸序列。该葡糖淀粉酶来源于爿/2e"aro的//，其氨基酸序列可从SPTREMBL:Q12596得到，它与SEQIDNO:2所示的序列几乎相同，除了相应于SEQIDNO:2的第97位氨基酸残基的一个氨基酸残基外，在数据库序列中该残基为丝氨酸，而在SEQIDNO:2中它是脯氨酸。数据库序列的注解鉴定了氨基酸残基1-18为信号肽，残基19-579(即，561个氨基酸残基)为成熟葡糖淀粉酶，残基472-482作为葡糖淀粉酶结构域和包含在残基483-579中的淀粉结合结构域之间的接头。在一个实施方案中葡糖淀粉酶以0.001至10AGU/gDS，优选从0.01至5AGU/gDS,例如大约O.l，0.3，0.5,l或2AGU/gDS,特别是0.1至0.5AGU/gDS或0.02-20AGU/gDS，优选0.1-10AGU/gDS的量加入。a-淀粉酶在一个优选的实施方案中，可在本发明方法中加入a-淀粉酶。根据本发明的a-淀粉酶可以是任何来源。优选是真菌或细菌来源的a-淀粉酶。在一个优选的实施方案中，a-淀粉酶是酸性a-淀粉酶，例如真菌酸性a-淀粉酶或细菌酸性a-淀粉酶。术语"酸性a-淀粉酶"是指以有效量加入的a-淀粉酶(E.C.3.2丄l)在pH从3至7,优选从3.5至6,或更优选从4-5的范围内具有最佳活性。细菌a-淀粉酶#4居本发明，细菌a-淀粉酶可来源于芽孢杆菌属(Ba"7/M)。在一个优选的实施方案中，芽孢杆菌属a-淀粉酶来源于地衣型芽孢杆菌(及/z'c/em/or冊:)，解淀粉芽孢杆菌(及amy/0/f々Me7^c/era),枯草芽孑包杆菌(5.w6"fc)或嗜热脂肪芽孢杆菌WearoAermop/n7MS)的菌4朱，但是也可以来源于其它芽孢杆菌属。涉及的a淀粉酶的具体例子包括SEQIDNO:5所示的地衣型芽孢杆菌a-淀粉酶(BLA)，SEQIDNO:6所示的解淀粉芽孢杆菌a-淀粉酶(BAN)，和SEQIDNO:7所示的嗜热脂肪芽孢杆菌CBflc/〃wWearaAermc^/n'/w)a-淀粉酶(BSG)。在本发明的一个实施方案中，a-淀粉酶是与本申请SEQIDNO:5,6，或7或WO99/19467中的SEQIDNO:1,2或3所示的任一序列具有至少60%，优选至少70%,更优选至少80%,甚至更优选至少90%,例如至少95%,至少96%,至少97%，至少98%或至少99%相同性的相同程度的酶。芽孢杆菌属a-淀粉酶也可以是变异体和/或杂合体，特别是在WO96/23873,WO96/23874,WO97/41213,WO99/19467,WO00/60059,和WO02/10355(所有文件在此引用以供参考)任一文件中所述的一种。具体涉及的a-淀粉酶变异体在美国专利号6,093,562,6,187,576,和6,297,038(在此引用以供参考)中公开且包括在WO1996/023873，参见例如，第20页，第1-10行(在此引用以供参考)中公开的具有双缺失的嗜热脂肪芽孢杆菌a-淀粉酶(BSGa-淀粉酶)变异体，优选与WO99/19467(在此引用以供参考)中公开的SEQIDNO:7所述的野生型BSGa-淀粉酶氨基酸序列相比相应于缺失(181-182)的变异体。甚至更优选的是芽孢杆菌属a-淀粉酶，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌a-淀粉酶，它与本申请SEQIDNO:7和在WO99/19467中公开的SEQIDNO:3所述的野生型BSGa-淀粉酶氨基酸序列相比具有相应于缺失(181-182)的双缺失且还包含N193F取代(也表示为1181*+G182*+N193F)。a-淀粉酶也可以是麦芽a-淀粉酶。"麦芽a-淀粉酶，，(葡聚糖1，4-a-麦芽水解酶，E.C3.2丄133)能够将直链淀粉和支链淀粉水解成a-构型的麦芽糖。嗜热脂肪芽孢杆菌菌抹NCIB11837的麦芽oc-淀粉酶可从丹麦NovozymesA/S以商品买到。麦芽a-淀粉酶在美国专利号4,598,048,4,604,355和6,162,628中描述，在此引用以供参考。细菌杂合a-淀粉酶具体涉及的杂合a-淀粉酶包含地衣型芽孢杆菌a-淀粉酶445个C-末端氨基酸残基(SEQIDNO:5所示)和解淀粉芽孢杆菌a-淀粉酶的37个N-末端氨基酸残基(SEQIDNO:6所示)，且具有下列取代的一个或多个，特别是所有取代12G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S(使用地衣型芽孢杆菌编号)。还优选具有一个或多个下列突变(或在其它芽孢杆菌属oc-淀4分酶主链上的相应突变)的变异体H154Y，A181T,N190F，A209V和Q264S和/或位置176和179之间的两个残基缺失，优选缺失E178和G179(使用WO99/19467中SEQIDNO:5的编号)。细菌a-淀粉酶以本领域熟知的量加入。当以KNU单位测量时(在下文"材料和方法"部分描述)，a-淀粉酶活性优选以0.5-5,000NU/gDS的量，以1-500NU/gDS的量，或更优选以5-1,000NU/gDS，例如10-100NU/gDS的量存在。真菌a-淀粉酶真菌酸性a-淀粉酶包括来源于曲霉属(^^^^//^)菌抹的酸性01-淀粉酶，例如米曲霉(^5perg/〃wswjzae)和黑曲霉(J印erg7'〃wsm'ger)a-淀4分酶。优选的酸性真菌a-淀粉酶是Fungamyl-样a-淀粉酶，优选来源于米曲霉菌林。在本说明书中，术语"Fungamyl-样a-淀粉酶"是指与WO96/23874中SEQIDNO:10所示或本申请SEQIDNO:4所示的氨基酸序列的成熟部分表现出高相同性，即超过70%，超过75%,超过80%,超过85%，超过90%,超过95%，超过96%,超过97%,超过98%，超过99%或甚至100%相同的a-淀4分酶。另一优选的酸性a-淀粉酶来源于黑曲霉菌林。在一个优选的实施方案中，酸性真菌oc-淀粉酶是在Swiss-prot/TeEMBL数据库中以原始登录号P56271作为"AMYA—ASPNG"公开且在WO89/01969(实施例3)中有更详细描述的黑曲霉的淀粉酶。酸性黑曲霉酸性a-淀粉酶也如SEQIDNO:3所示。还包含与SEQIDNO:3具有至少70%相同性，例如至少80%或甚至至少卯％相同性，例如至少95%，96%，97%,98%,或至少99%相同性的所述酸性真菌淀粉酶的变异体。商业上可获得的来源于黑曲霉的酸性真菌a-淀粉酶是SP288(可从丹麦NovozymesA/S获得)。真菌酸性oc-淀粉酶也可以是含有糖结合模块(module)(CBM)和a-淀粉酶催化结构域的野生型酶(即，非杂合体)，或其变异体。在一个实施方案中，野生型酸性a-淀粉酶来源于A^erg///zAawac/z/菌抹，特別是SEQIDNO:31所示的a-淀粉酶。还包含与SEQIDNO:31具有至少70%相同性，例如至少1380%或甚至至少90%相同性，例如至少95%，至少96%,至少97%,至少98%,或至少99%相同性的所迷真菌酸性淀粉酶的变异体。真菌杂合体a-淀粉酶在一个优选的实施方案中，真菌酸性a-淀粉酶是杂合体a-淀粉酶。真菌杂合体a-淀粉酶的优选例子包括在PCT/US2004/020499(Novozymes)中公开的酶，在此引用以供参考。杂合体a-淀粉酶可包含a-淀粉酶催化结构域(CD)和糖结合模块(CBM)和任选的接头。本文提及的杂合体酶或遗传修饰的野生型酶包括含有与包含糖结合模块(CBM)的氨基酸序列连接(即，共价结合)的a-淀粉酶(EC3.2丄1)的氨基酸序列的种类。含有CBM的杂合体酶，及其制备和純化的详细说明是本领域已知的[参见，例如WO卯/00609,WO94/24158和WO95/16782，以及Greenwood等，BiotechnologyandBioengineering44(1994)第1295-1305页]。它们可以通过例如，将至少含有使用或不用接头连接到编码目的酶的DNA序列上的编码糖结合模块的DNA片断的DNA构建体转化进宿主细胞，并培养该转化的宿主细胞以表达融合基因来制备。所得的重组产物(杂合体酶)-本领域通常称为"融合蛋白"-可用下列通式描述A-CBM-MR陽X在该通式中，A-CBM是至少含有糖结合模块(CBM)本身的N-末端或C-末端区氨基酸序列。MR是中间区("接头")，且X是由编码酶(或其它蛋白质)的DNA序列编码的多肽的氨基酸残基序列，它与CBM连接。组件A可以不存在(因此A-CBM为CBM本身，即除了组成CBM的氨基酸残基外不含其它氨基酸残基)或者可以是一个或多个氨基酸残基的序列(充当CBM本身的末端延伸)。接头(MR)可以是键，或者含有大约2到大约100个碳原子，特别是2到40个碳原子的短连接基团。然而，MR优选是从大约2到大约100个氨基酸残基的序列，更优选从2到40个氨基酸残基，例如从2到15个氨基酸残基的序列。组件(moiety)X可组成整个杂合体酶的N-末端或者C-末端区。从上文所述显而易见的是在所述类型的杂合体酶中CBM可位于杂合体酶的C-末端，N-末端或内部。接头序列可任选的接头序列可以是任何合适的接头序列。在优选的实施方案中，接头序列来源于A/ze/^W诉//葡糖淀粉酶，黑曲霉葡糖淀粉酶或A^wac/nYa-淀粉酶，例如选自黑曲霉葡糖淀粉酶接头TGGTTTTATPTGSGSVTSTSKTTATASKTSTSTSSTSA(SEQIDNO:8)，AAawac/n7a-淀粉酶接头TTTTTTAAATSTSKATTSSSSSSAAATTSSS(SEQIDNO:9)，A/2e/Za葡糖淀粉酶接头GATSPGGSSGS(SEQIDNO:10)，和PEPT接头PEPTPEPT(SEQIDNO:ll)的接头序列。在另一优选的实施方案中，杂合体酶具有的接头序列与SEQIDNO:8，SEQIDNO:9，SEQIDNO:10,或SEQIDNO:11所示的氨基酸序列在不超过10个位置，不超过9个位置，不超过8个位置，不超过7个位置，不超过6个位置，不超过5个位置，不超过4个位置，不超过3个位置，不超过2个位置，或甚至不超过1个位置上有区别。糖结合模块糖结合模块(CBM),或通常称为糖结合域(CBD),是优先与多糖或寡糖(糖类)，通常(但不是必须唯一地)与其不溶于水(包括结晶)的形式结合的多肽氨基酸序列。来源于淀粉降解酶的CBMs通常称为淀粉结合模块或SBMs(存在于某些淀粉降解酶，例如某些葡糖淀粉酶，或诸如环糊精葡聚糖转移酶的酶中，或a-淀粉酶中的CBMs)。同样，CBMs的其它亚类可包含，例如，纤维素结合模块(纤维素降解酶的CBMs),几丁质结合模块(一般存在于几丁质酶中的CBMs)，木聚糖结合模块(一般存在于木聚糖酶中的CBMs)，甘露聚糖结合模块(一般存在于甘露聚糖酶中的CBMs)。SBMs通常称为SBDs(淀粉结合域)。CBMs作为由2个或多个多肽氨基酸序列区组成的大型多肽或蛋白质的完整(integral)部分被发现，特别是在一般包含含有底物水解活性位点的催化模块和结合所述糖类底物的糖类结合模块(CBM)的水解性酶(水解酶)中。该酶可包含一个以上的催化模块和1个，2个或3个CBMs,且任选还包含一个或多个连接CBM(s)与催化模块的多肽氨基酸序列区，后一类型的区域通常称为"接头"。含有CBM的水解酶的例子(其中一些已经在上文中提到)有纤维素酶，木聚糖酶，甘露聚糖酶，阿拉伯糖呋喃糖苷酶，乙酰酯酶和几丁质酶。CBMs已经在藻类中发现，例如在红藻A^p/y;ra非水解性多糖结合蛋白的形式发现。在存在CBMs的蛋白质/多肽(例如，酶，一般是水解酶)中，CBM可位于N或C末端或在内部位置。组成CBM本身的多肽或蛋白质(例如，水解酶)的该部分一般由超过大约30个且低于大约250个的氨基酸残基组成。"家族20的糖类结合模块"或CBM-20模块在本发明上下文中定义为与Joergensen等(1997)在Biotechnol丄ett19:1027-1031的图1中公开的多肽的糖类结合模块(CBM)具有至少45%相同性的大约100个氨基酸的序列。CBM包含该多肽的最后102个氨基酸，即从氨基酸582到氨基酸683的子序列。本说明书中使用的糖苷水解酶家族的编号按照Coutinho,P.M.&Henrissat,B.(1999)C4Z_y-Car6o/y^/rafe-^"/ve五wz戸esserver,见URL:afmb.cnrs-mrs.fr/cazy/CAZY/index.html或任选Coutinho,P.M.&Henrissat,B.1999;"纤维素酶和其它糖类活性酶的模块结构综合数据库研究"的概念。参见"Gew"/cs'历oc/ze/m.Wry朋d五co/ogyo/Ce〃w/o化Z)eg/W加.o"，，,K.Ohmiya,K.Hayashi，K.Sakka,Y.Kobayashi,S.Karita禾口T.Kimura编，UniPublishersCo.，Tokyo，第15-23页，和Boume，Y.&Henrissat,B.2001:糖苷水解酶和糖基转移酶家族和功能4莫块，Cw厅eWQp/m'o"z>所o/ogv11:593-600。适用于本发明上下文的包含CBM的酶的例子是a-淀粉酶，麦芽a-淀粉酶，纤维素酶，木聚糖酶，甘露聚糖酶，阿拉伯糖呋喃糖苷酶，乙酰酯酶和几丁质酶。与本发明相关的感兴趣的其它CBMs包括来自葡糖淀粉酶(EC3.2丄3)或来自CGTases(EC2.4.1.19)的CBMs。来源于真菌，细菌或植物来源的CBMs—般适用于本发明上下文。优选的是真菌来源的CBMs,更优选来自曲霉属种类，芽孢杆菌属种类，克雷白氏杆菌属种类(K/eZwW/asp,),或根霉菌属种类(i/n'zopwsp.)。与此相关，适合于分离相关基因的技术是本领域熟知的。本发明优选的是糖结合模块家族20的CBMs。适合于本发明的糖结合模块家族20的CBMs可来源于泡盛曲霉G^pwg"/wmwmon')(SWISSPROTQ12537),Aperg/〃ws^wac/n7(SWISSPROTP23176),黑曲霉(SWISSPROTP04064)，米曲霉0S『/SS尸i(9rP36914)的葡糖淀粉酶，来源于A;ergz7/wfewac/2//(EMBL:#AB008370),构巢曲霉(y^/erg"/iwmWw/a""(NCBIAAF17100.1)的a-淀粉酶，来源于蜡样芽孢杆菌(^^〃wcerew力的(3-淀粉酶(SWISSPROTP36924),或来源于环状芽孢杆菌(5ac/〃wsc^cw/a"力的CGTases(SWISSPROTP43379)。优选的是来源于Apergz'〃wAawac/^'a-淀粉酶(EMBL:弁AB008370)的CBM以及与A^wg/〃wAawac/Ya-淀4分酶(EMBL^AB008370)的CBM具有至少50%，至少60%，至少70%,至少80%,至少卯％,至少95，至少96%，至少97%,至少98%或甚至至少99%相同性的CBMs,即与SEQIDNO:12的氨基酸序列具有至少50%，60%,70%，80%，95%,96%，97%，98%或甚至至少99%相同性的CBM。本发明还优选具有SEQIDNO:14(Bac"/w/Zavo^enni^CBM),SEQIDNO:15(芽孢杆菌属种类的CBM),和SEQIDNO:1604/ca/z;p/7/cBa"7/wsCBM)所示的氨基酸序列并在国际申请PCT/DK2004/000456中分别作为SEQIDNO:1，SEQIDNO:2和SEQIDNO:3公开的糖结合才莫块家族20的CBMs。其它优选的CBMs包4舌来自//ormocom'ssp.,例^口来自//orwocom'srew'wae(Syn.Creosote真菌或Jmorp/zoAecams7'"ae)的葡糖淀粉酶CBMs,例如SWISSPROT:003045(SEQIDNO:17)的CBM，来自￡e""m//asp.,例如来自Ze""舰/aWo^fey(香菇)的CBM，例如SPTREMBL:Q9P4C5(SEQIDNO:18)的CBM,来自链孑包零属种类(7Vez/ra^on3sp.)，例^口来自7Vew,as^on3cnxwa的CBM,例如SWISSPROT:P14804(SEQIDNO:19)的CBM，来自7^/"ra/wjce51sp.，仿H口来自T^/aromyces^Kwoc/z/amjv^/o/fifes的CBM,仿H口NN005220(SEQIDNO:20)的CBM,来自Geasm"/zz'asp.，例如来自Geas/m说/aqy/z'"c/ra^ora的CBM，例如NN48286(SEQIDNO:21)的CBM,来自Scor,cwsp.，例如来自Scon.ass戸gz'謂的CBM，例如NN007096(SEQIDNO:22)的CBM,来自五wpem'"'〃z'wmsp.，"f列长口来自五w/em'c/〃/wm/wdw/g7'/的CBM,例如NN005968(SEQIDNO:23)的CBM，来自曲霉属种类，例如来自A;erg"/w力pom'c^的CBM,例如NN001136(SEQIDNO:24)的CBM，来自青霉属种类(户ew'c;'〃&msp.),例3口来自尸ew'c/〃/wmcf.mf'C2ym"/b7的CBM，例如NN48691(SEQIDNO:25)的CBM，来自Mzl青霉属种类的CBM，例如NN48690(SEQIDNO:26)的CBM,来自r/7"a"c^/20msp.的CBM，例如NN48711(SEQIDNO:27)的CBM,和来自//"w/co/asp.,例如来自//wm'co/agn."a^ewzo^fea的CBM,例如SPTREMBL:Q12623(SEQIDNO:28)的CBM。最优选的CBMs包括来自曲霉属种类，例如来自黑曲霉的葡糖淀粉酶的CBMs，例如SEQIDNO:29,和来自sp.,例如来自j歸a的CBMs，例如SEQIDNO:30。优选的杂合体酶包含与SEQIDNO:13，SEQIDNO:1410,SEQIDNO:15,SEQIDNO:16,SEQIDNO:17,SEQIDNO:18,SEQIDNO:19,SEQIDNO:20,SEQIDNO:21，SEQIDNO:22,SEQIDNO:23，SEQIDNO:24，SEQIDNO:25,SEQIDNO:26，SEQIDNO:27，SEQIDNO:28,SEQIDNO:29或SEQIDNO:30所示的任一氨基酸序列具有至少50%，至少60%,至少70%,至少80%,至少90%，至少95%,至少96%,至少97%,至少98%或甚至至少99%相同性的CBM序列。在另一优选的实施方案中，CBM序列具有与SEQIDNO:13，SEQIDNO:1410，SEQIDNO:15,SEQIDNO:16,SEQIDNO:17,SEQIDNO:18，SEQIDNO:19，SEQIDNO:20,SEQIDNO:21,SEQIDNO:22,SEQIDNO:23，SEQIDNO:24，SEQIDNO:25,SEQIDNO:26,SEQIDNO:27,SEQIDNO:28,SEQIDNO:29或SEQIDNO:30所示的氨基酸序列在不超过10个氨基酸位置，不超过9个位置，不超过8个位置，不超过7个位置，不超过6个位置，不超过5个位置，不超过4个位置，不超过3个位置，不超过2个位置，或甚至不超过1个位置上有区别的氨基酸序列。在最优选的实施方案中，该杂合体酶包含来自于葡糖淀粉酶，例如来自于美国专利号4,727,026所述的Aro//w7AHU9627葡糖淀粉酶的CBM。其它合适的糖结合模块家族20的CBMs可参见URL:afmb.cnrs-mrs.fr/cazY/CAZY/index.html)。一旦鉴定了编码底物结合(糖结合)区的核苷酸序列，不论是cDNA还是染色体DNA,随后可用各种方式对其进行操作以便将它融合到编码目的酶的DNA序列上。然后将编码糖结合氨基酸序列的DNA片断和编码目的酶的DNA使用或不用接头连接。然后可用各种方法操作所得的连接DNA以冗成表达。杂合体中的催化结构域适合于用作本发明上下文中使用的CBM/淀粉酶杂合体类型基础的a-淀粉酶(特别是酸性a-淀粉酶)包括真菌来源的酶。优选的例子是上文在"真菌a-淀粉酶"部分所述的酶，它包括.SEQIDNO:3所示的来源于黑曲霉的或SEQIDNO:4所示的米曲霉的酸性a-淀粉酶。甚至更优选这样的实施方案，其中该杂合体酶包含来源于米曲霉酸性a-淀粉酶(FungamylTM，SEQIDNO:4)的oc-淀粉酶序列，和/或来源于Afewflc/7/z'a-淀粉酶(SEQIDNO:9)或A葡糖淀4分酶(SEQIDNO:10)的接头序列，和/或来源于Ay^wc/z"a-淀粉酶(SEQIDNO:13)或A葡糖淀粉酶(SEQIDNO:30)的CBM。还优选这样的实施方案，其中该杂合体酶包含具有SEQIDNO:3所示序列的来源于黑曲霉酸性a-淀粉酶(SP288)催化模块的a-淀粉酶序列，和/或来源于AytawacWa-淀粉酶(SEQIDNO:9)或A葡糖淀粉酶(SEQIDNO:10)的接头序列，和/或来源于A/tavrac/^'a-淀粉酶(SEQIDNO:12)，Ara//w'/葡糖淀粉酶(SEQIDNO:30)或黑曲霉葡糖淀粉酶(SEQIDNO:29)的CBM。在特别优选的实施方案中，该杂合体酶包含具有SEQIDNO:3所示序列的黑曲霉酸性a-淀粉酶(SP288)催化模块和AA:awac/7"a-淀粉酶接头(SEQIDNO:9)和CBM(SEQIDNO:12)。在一个具体实施方案中，该杂合体酵是SEQIDNO:33(黑曲霉酸性a-淀粉酶催化结构域-A^w"c/2//cc-淀粉酶接头-黑曲霉葡糖淀粉酶CBM)，SEQIDNO:35(黑曲霉酸性a-淀粉酶催化结构域-A^wac/"a-淀粉酶接头-A葡糖淀粉酶CBM)，或SEQIDNO:37(米曲霉酸性a-淀粉酶催化结构域-A^wac/z〃a-淀粉酶接头-Aa-淀粉酶CBM)，或SEQIDNO:39(黑曲霉酸性a-淀粉酶催化结构域-A葡糖淀粉酶接头-A葡糖淀粉酶CBM),或SEQIDNO:41(米曲霉酸性a-淀粉酶催化结构域-A葡糖淀粉酶接头-A葡糖淀粉酶CBM)所示氨基酸序列的成熟部分或由黑曲霉酸性a-淀粉酶催化结构域(SEQIDNO:3)-A^wac/z"a-淀粉酶接头(SEQIDNO:9)-AAravrac/^'a-淀粉酶CBM(SEQIDNO:13)组成的杂合体或与任一前述氛基酸序列具有至少50%，至少60%,至少70%,至少80%,或甚至至少90%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,或至少99%相同性的氨基酸序列的杂合体酶。在另一优选的实施方案中，该杂合体酶具有与SEQIDNO:33(黑曲霉酸性a-淀粉酶催化结构域-A^wac/z"a-淀粉酶接头-黑曲霉葡糖淀粉酶CBM)，SEQIDNO:35(黑曲霉酸性a-淀粉酶催化结构域-Az^w"c/^a-淀粉酶接头-A葡糖淀粉酶CBM)，SEQIDNO:37(米曲霉酸性a-淀粉酶催4匕结构i或-AAawac/z"a-淀4分酶4妄头-Afewac/z"a-淀4分酶CBM)，或SEQIDNO:39(黑曲霉酸性a-淀粉酶催化结构域-A葡糖淀粉酶接头-A葡糖淀粉酶CBM)或SEQIDNO:41(米曲霉酸性a-淀粉酶催化结构域-ATO诉//葡糖淀粉酶接头-A葡糖淀粉酶CBM)所示的氨基酸序列或由黑曲霉酸性a-淀粉酶催化结构域(SEQIDNO:3)-A^wac/n7a-淀粉酶接头(SEQIDNO:9)-Abwac/z"a-淀粉酶CBM(SEQIDNO:13)组成的杂合体在不超过10个氨基酸位置，不超过9个位置，不超过8个位置，不超过7个位置，不超过6个位置，不超过5个位置，不超过4个位置，不超过3个位置，不超过2个位置，或甚至不超过1个位置上有区别的氨基酸序列。商品a-淀粉酶产品优选的含有a-淀粉酶的商品组合物包括MYCOLASE，来自DSM(GistBrocades),BAN,TERMAMYLSG，FUNGAMYL,LIQUOZYMEX和SANTMSUPER,SANTMEXTRAL(NovozymesA/S)和CLARASEL-40,000,DEX-LO,SPEYMEFRED，SPEZYMEAA,和SPEZYMEDELTAAA(GenencorInt.),和以商品名SP288销售的酸性真菌a-淀粉酶(可从NovozymesA/S,Denmark获得)。根据本发明，酸性cc-淀粉酶可按O.l至10AFAU/gDS，优选0.10至5AFAU/gDS，特别是0.3至2AFAU/gDS的量加入。葡糖淀粉酶和酸性a-淀粉酶的组合即使根据本发明酸性a-淀粉酶的存在不是指令性的，酸性a-淀粉酶和葡糖淀粉酶的活性以0.3到5.0AFAU/AGU之间的比率存在。更优选的是酸性a-淀粉酶活性与葡糖淀粉酶活性之间的比率为至少0.35，至少0.40，至少0.50,至少0,60，至少0.7,至少0.8，至少0.9,至少1.0，至少l.l,至少1.2，至少1.3,至少1.4，至少1.5,至少1.6，至少1.7,至少1.8，至少1.85，或甚至至少1.9AFAU/AGU。然而，酸性a-淀粉酶活性与葡糖淀粉酶活性之间的比率优选应低于4.5,低于4.0，低于3.5,低于3.0,低于2.5,或甚至低于2.25AFAU/AGU。以AUU/AGI表示，酸性oc-淀粉酶与葡糖淀粉酶的活性优选以0.4到6.5AUU/AGI之间的比率存在。更优选的是，酸性a-淀粉酶活性与葡糖淀粉酶活性之间的比率为至少0.45,至少0.50，至少0.60,至少0.7，至少0.8，至少0.9,至少1.0，至少1.1,至少1.2,至少1.3，至少1.4，至少1.5，至少1.6,至少1.7，至少1.8，至少1.9,至少2.0,至少2.1，至少2.2，至少2.3，至少2.4，或甚至至少2.5AUU/AGI。然而，酸性a-淀粉酶活性与葡糖淀粉酶活性之间的比率优选低于6.0,低于5.5，低于4.5,低于4,0'低于3.5，或甚至低于3.0AUU/AGI。蛋白酶根据本发明的方法，在糖化和/或发酵期间可存在蛋白酶。在一个优选的实施方案中，蛋白酶是微生物来源，优选是真菌或细菌来源的酸性蛋白酶。合适的蛋白酶包括微生物蛋白酶，例如真菌和细菌蛋白酶。优选的蛋白酶是酸性蛋白酶，即，其特征在于在低于pH7的酸性条件下具有水解蛋白质的能力的蛋白酶。包含的酸性真菌蛋白酶包括来自曲霉属，白霉属(Mwcor)，根霉菌属(i/z/zopM力,念i朱菌属(Ca"(iz'(i(3),Cor/o/ws，五"(ic^/z,a，￡>7//zowo//7^*a，7rpex,青霉属，Sc/era^wand球拟酵母属(7brw/o/wz'力的真菌蛋白酶。特别包含的蛋白酶来源于黑曲霉(参见，例如，Koaze等,(1964)，Agr.Biol.Chem.Japan,28，216)，爿，厂g,〃w柳'to/(参见，例如，Yoshida,(1954)J.Agr,Chem.Soc.Japan,28,66),泡盛曲霉(Hayashida等，(1977)Agric.Biol.Chem.，42(5),927-933)，Ay;wg"/^acw/ea^s(WO95/02044),或米曲霉，例如pepA蛋白酶；和来自彬'小毛霉菌(Mwcor;us/〃^)或Mwcorm/e/zez'的酸性蛋白酶。还包含中性或碱性蛋白酶，例如来自芽孢杆菌属菌抹的蛋白酶。本发明包含的具体蛋白酶来源于解淀粉芽孢杆菌且具有可从SwissprotasAccessionNo.P06832获得的^歹l)。i￡包*与可从SwissprotasAccessionNo.P06832获得的氨基酸序列具有至少卯％相同性，例如至少92%,至少95%,至少96%,至少97%，至少98%，或特别是至少99%相同性的蛋白酶。还包含与WO2003/048353中以SEQ.ID.NO:l公开的氨基酸序列具有至少90%相同性，例如至少92%,至少95%，至少96%,至少97%,至少98%,或特别是至少99%相同性的蛋白酶。还包含木瓜蛋白酶样蛋白酶，例如E.C.3.4.22.*内的蛋白酶(半胱氨酸蛋白酶)，例如EC3A22.2(木瓜蛋白酶)，EC3.4.22.6(木瓜凝乳蛋白酶)(chymopapain),EC3.4.22.7(萝摩蛋白酶)(asclepain)，EC3.4.22.14(actinidain)，EC3.4.22.15(组织蛋白酶L)(cathepsinL),EC3.4.22.25(甘氨酰基内肽酶)和EC3.4.22.30(caricain)。蛋白酶可按0.1-1000AU/kgdm,优选1-100AU/kgDS且最优选5-25AU/kgDS的量加入。其它成份在糖化和/或发酵期间可存在其它成份以提高本发明方法的效率。例如营养素(例如，发酵生物的微量营养素)，抗生素，盐(例如，锌或镁盐)，其它酶，例如植酸酶，纤维素酶，半纤维素酶，外切和内切葡聚糖酶，和木聚糖酶。发酵产物的回收可任选在发酵后回收诸如乙醇的发酵产物。可通过例如，蒸馏的任何常规方式进行回收。围，因为这些实施方案试图用于举例说明本发明的一些方面。任何等价的实施方案都打算包含在本发明的范围内。事实上，除了本文所示和描述的那些外，对本发明的各种修改对于本领域的技术人员而言从上面的描述将是显而易见的。该修改也落入所提交的权利要求书的范围内。如有沖突，将核对本说明书，包括定义。本文引用了各种参考文献，其公开内容以其整体引入以供参考。材料和方法葡糖淀粉酶*来源于A/ze//a的葡糖淀粉酶以SEQIDNO:2公开且可从NovozymesA/S获得。*来源于黑曲霉的葡糖淀粉酶在Boel等，(1984),EMBOJ.3(5)第1097-1102页中公开且可从NovozymesA/S获得。的葡糖淀粉酶在WO99/28448中公开且可从NovozymesA/S获得。*酸性真菌a-淀粉酶来源于黑曲霉，由黑曲霉酸性a-淀粉酶催化结构域(SEQIDNO:3)，As;ergz'〃wAawac/zz7a-淀粉酶接头(SEQIDNO:9)—A;erg/〃ws^wac///a-淀粉酶CBM(SEQIDNO:13)组成。酵母RedStar，可从RedStar/Lesaffre，USA获得。同源性/相同性在本发明上下文中，"同源性"是指两个氨基酸序列之间的相同性程度。同源性可用本领域已知的计算机程序合适地测定，例如在GCG程序包中提供的GAP(WisconsinPackage,Version8的程序手册，1994年8月，遗传学计算机组，575ScienceDrive,Madison,Wisconsin,USA53711)(Needleman,S.B.和Wunsch，C.D.,(1970)，JournalofMolecularBiology,48,443-453)。使用下列设定值用于多肽序列比较GAP产生罚分3.0和GAP延伸罚分O.l。oc-淀粉酶活性(KNU)可使用马铃薯淀粉作为底物测定淀粉分解活性。该方法基于酶对修饰的马铃薯淀粉的分解，且通过将淀粉/酶溶液的样品与碘溶液混合进行反应。最初形成黑蓝色，但在淀粉分解期间，蓝色变弱且逐渐变成红褐色，将它与有色玻璃标准进行比较。一个KiloNovoa淀粉酶单位(KNU)定义为在标准条件(即，在37°C+/-0.05;0.0003MCa2+;和pH5.6)下糊化(dextrinizes)5260mg干淀4分底物MerckAmylum溶液的酶量。更详细地描述该分析方法的文件EB-SM-0009.02/01可向NovozymesA/S,Denmark要求获得，该文件在此引用以供参考。23200580008578.0说明书第19/26页*来源于A/ze//a200580008578.0说明书第19/26页*来源于A/ze//a的葡糖淀粉酶以SEQIDNO:2公开且可从NovozymesA/S获得。*来源于黑曲霉的葡糖淀粉酶在Boel等，(1984),EMBOJ.3(5)第1097-1102页中公开且可从NovozymesA/S获得。的葡糖淀粉酶在WO99/28448中公开且可从NovozymesA/S获得。*酸性真菌a-淀粉酶来源于黑曲霉，由黑曲霉酸性a-淀粉酶催化结构域(SEQIDNO:3)，As;ergz'〃wAawac/zz7a-淀粉酶接头(SEQIDNO:9)—A;erg/〃ws^wac///a-淀粉酶CBM(SEQIDNO:13)组成。酵母RedStar，可从RedStar/Lesaffre，USA获得。同源性/相同性在本发明上下文中，"同源性"是指两个氨基酸序列之间的相同性程度。同源性可用本领域已知的计算机程序合适地测定，例如在GCG程序包中提供的GAP(WisconsinPackage,Version8的程序手册，1994年8月，遗传学计算机组，575ScienceDrive,Madison,Wisconsin,USA53711)(Needleman,S.B.和Wunsch，C.D.,(1970)，JournalofMolecularBiology,48,443-453)。使用下列设定值用于多肽序列比较GAP产生罚分3.0和GAP延伸罚分O.l。oc-淀粉酶活性(KNU)可使用马铃薯淀粉作为底物测定淀粉分解活性。该方法基于酶对修饰的马铃薯酸性a-淀粉酶活性根据本发明使用时，任何酸性a-淀粉酶的活性可用AFAU(酸性真菌a-淀粉酶单位)测量。作为选择，酸性a-淀粉酶的活性可用AAU(酸性a-淀粉酶单位)测量。酸性a-淀粉酶单位(AAU)酸性oc-淀粉酶活性可用AAU(酸性a-淀粉酶单位)测量，它是一个绝对方法。一个酸性淀粉酶单位(AAU)是在标准条件下每小时将1g淀粉(100%干物质)转化成在与等于一个颜色参照的已知强度的碘溶液反应后在620nm下具有透光性(transmission)的产物的酶量。标准条件/反应条件底物溶解淀粉，浓度大约20gDS/L.緩冲液柠檬酸盐，大约0.13M,pH=4.2石典溶液40.176g碘化钾+0.088g碘/L城市水15°-20°dH(德国硬度)pH:4.2温育温度30oC反应时间11分钟波长620nm酶浓度0.13-0.19AAU/mL酶作用范围0.13-0.19AAU/mL淀粉应是Lintner淀粉，它是稀薄的煮沸淀粉，在实验室用作比色指示剂。Lintner淀粉通过用稀盐酸处理天然淀粉获得，使其保留遇碘呈蓝色的能力。详细情况参见欧洲专利号140410,其说明书在此引用以供参考。酸性a-淀粉酶活性(AFAU)酸性a-淀粉酶活性以AFAU(酸性真菌oc-淀粉酶单位)测定，它相对于酶标准进行测定。1FAU定义为在下述标准条件下每小时降解5.260mg淀粉干物质的酶量。酸性a-淀粉酶，内切-a-淀粉酶(l,4-a-D-葡聚糖-葡聚糖水解酶，E.C.3.2.1.1)水解淀粉分子内部区域的a-l,4-糖苷键形成具有不同链长的糊精和寡糖。与碘形成的颜色强度与淀粉的浓度成正比。淀粉酶活性使用反向比色法测定，因为在特定分析条件下淀粉浓度下降。a-淀粉酶淀粉+碘->糊精+寡糖X=590nm40。，pH2.5蓝色/紫罗兰色1=23秒脱色标准条件/反应条件底物可溶性淀粉，大约0.17g/L缓沖液柠檬酸盐，大约0.03M硪(I2):0.03g/LCaCl2:1.85mMpH:2.50±0.05温育温度40。C反应时间23秒波长590nm酶浓度0.025AFAU/mL酶作用范围.-0,01-0.04AFAU/mL更详细地描述该分析方法的文件EB-SM-0259.02/01可向NovozymesA/S,Denmark要求获得，该文件在此引用以供参考。葡糖淀粉酶活性葡糖淀粉酶活性以AGI单位或淀粉葡糖苷酶单位(AGU)测定。葡糖淀粉酶活性(AGD葡糖淀粉酶(相当于淀粉葡糖苷酶)将淀粉转化成葡萄糖。这里通过葡萄糖氧化酶方法测定葡萄糖的量用于活性测定。该方法在"美国谷类化学家协会批准的方法"，第76-ll部分，用葡萄糖氧化酶随后测量葡萄糖的淀粉-葡糖淀粉酶方法，VoU-2AACC,美国谷类化学家协会，(2000)，ISBN:1-891127-12-8中描述。一个葡糖淀粉酶单位(AGI)是在该方法的标准条件下每分钟形成1微摩尔葡萄糖的酶量。标准条件/反应条件底物可溶性淀粉，浓度大约16g干物质/L.緩冲液醋酸盐，大约0.04M，pH=4.3pH:4.3温育温度60°C反应时间15分钟终止反应力卩NaOH至浓度大约0.2g/L(pH~9)酶浓度0.15-0.55AAU/mL.淀粉应是Lintner淀粉，它是稀薄的煮沸淀粉，在实验室用作比色指示剂。Lintner淀粉通过用稀盐酸处理天然淀粉获得，使其保留遇碘呈蓝色的能力。葡糖淀粉酶活性(AGU)Novo葡糖淀粉酶单位(AGU)定义为在标准条件37。C，pH4.3，底物麦芽糖23.2mM，緩沖液乙酸盐0.1M,反应时间5分钟的标准条件下每分钟水解1微摩尔麦芽糖的酶量。可使用自动分析器系统。将变旋酶加入葡萄糖脱氢酶试剂中使得存在的任何a-D-葡萄糖转变成P-D-葡萄糖。在上述反应中葡萄糖脱氢酶与(3-D-葡萄糖特异性反应，使用光度计在340nm下测定形成的NADH作为原始葡萄糖浓度的测量值。AMG温育底物麦芽糖23.2mM緩冲液乙酸盐0.1MpH:4.30±0.05温育温度37QC士1反应时间5分钟酶作用范围0.5-4.0AGU/mL颜色反应GlucDH:430U/L变旋酶9U/LNAD:0.21mM緩沖液磷酸盐0.12M;0.15MNaClpH:7.60±0.05温育温度37。C±1反应时间5分钟波长340腦更详细地描述该分析方法的文件(EB-SM-0131.02/01)可向NovozymesA/S,Denmark要求获得，该文件在此引用以供参考。蛋白水解活性(AU)可用变性血红蛋白作为底物测定蛋白水解活性。在测定蛋白水解活性的Anson-血红蛋白方法中消化变性血红蛋白，未消化的血红蛋白用三氯乙酸(TCA)沉淀。TCA可溶性产物的量用苯酚试剂测定，它与酪氨酸和色氨酸产生蓝色。一个Anson单位(AU)定义为在标准条件(即，25。C,pH7.5和10分钟反应时间)下以这样的起始速率消化血红蛋白的酶量，该速率使得每分钟释放的TCA可溶性产物量与苯酚试剂产生与1毫克当量(milliequivalent)酪氨酸相同的颜色。更"i,纟田i也4苗述该分才斤方法的文4牛AF4/5可向NovozymesA/S,Denmark要求获得，该文件在此引用以供参考。实施例1在"一步法"燃料乙醇发酵中评估A/2e/^ro诉z7葡糖淀粉酶通过小批量发酵评价葡糖淀粉酶与黑曲霉葡糖淀粉酶和r"/aram少CM葡糖淀粉酶的相对效率。将大约380g磨细的玉米(在小规模锤头磨中磨碎并过1.65mm筛)加入大约620g自来水中。向该混合物中添加3mL1g/L青霉素。用40。/。H2S04将该浆料的pH调节到5.0。以一式三份测定千固形物(DS)水平为大约32%。将大约5g该浆料加入15mL试管中。每种酶进行两个剂量的剂量-反应。所用的剂量为0.3和0.6nmol/gDS。每种处理进行6份试验。确定剂量后，向试管中接种在玉米糊(mash)上生长了22.5小时的0.04mL/g酵母繁殖物(RedStaryeast)的玉米糊。试管用带有小针孔的螺旋盖盖上以允许气体释放并在称量前简单涡旋并在32°C下培养。进行70小时发酵并通过称量该试管测定乙醇产量。称量前简单涡旋试管。实验结果如表l所示。从表1可见，使用A/zWa葡糖淀粉酶与野生型黑曲霉和ra/aromyc^eme^om'/葡糖淀粉酶的产量相比每克DS的乙醇产量明显更高。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>实施例2在"一步法"糖化中评价^/zg/^m诉z7葡糖淀粉酶与酸性真菌oc-淀粉酶的组合将分别用y^/ze/^葡糖淀粉酶单独和与真菌酸性a-淀粉酶活性(黑曲霉酸性a-淀粉酶与A;e^/〃z^fewac/z//a-淀粉酶淀粉结合域的杂合体)组合在一步法糖化后的葡萄糖浓度与在相同条件和相同剂量水平下用黑曲霉葡糖淀粉酶单独和与相同真菌酸性a-淀粉酶的组合进行比较。除了不加入酵母和使用的缓冲液控制pH为4.5外，通过与实施例1使用的小规模发酵非常相似的小规模糖化进行该评价。筒单地说，194g磨细的玉米与306g37mMNaOAc,0.025%叠氮化钠，20mMCaCl2,pH4.5混合产生大约35%DS的浆料。将该浆料的pH用40%H2S04调节到4.5(调节前的起始pH为大约4.9)。使得该浆料水合，同时在室温下搅拌1小时。每次反应向20mL小瓶中加入大约5g该浆料。然后在确定剂量(dosing)前将含有玉米浆料的小瓶在32。C下预培养1小时。定量每个小瓶的合适酶量，盖上盖并立即涡旋。根据每瓶中玉米浆料的精确重量确定实际剂量。每个反应以一式三份进行。小瓶在32。C下温育。4小时后涡旋各小瓶且通过加入50微升40%H2S04终止反应并准备HPLC分析。HPLC准备由离心，和过滤通过0.45微米滤膜组成。等待HPLC分析的样品在4。C下贮存。表2显示了糖化4小时后的葡萄糖浓度处理0.263mg/gDS黑曲霉葡糖淀粉酶0.263mg/gDS黑曲霉葡糖淀粉酶十0.034mg/gDS带有爿5perg/〃wsA:a丽c/2"oc-淀粉酶接头和CBM的黑曲霉酸性ot-淀粉酶0.263mg/gDS葡糖淀粉酶0.263mg/gDSJAe/Zflro的"葡糖淀粉酶+0.034mg/gDS带有爿5/e，'〃wAa丽cM294小时葡萄糖(g/L)33.240.445.6a-淀粉酶接头和CBM的黑曲霉酸性a-淀粉酶糖化后获得的葡萄糖水平与通过酵母属酵母发酵时获得的乙醇发酵产量相关。因此，上述结果表明ra拆"葡糖淀粉酶单独和与真菌酸性a-淀粉酶组合在相同条件下比黑曲霉葡糖淀粉酶单独和与真菌酸性a-淀粉酶的组合效果更好。权利要求1.从磨细的含淀粉材料生产发酵产物的方法，包括(a)用具有SEQIDNO2所示的氨基酸序列的葡糖淀粉酶，或者与其具有至少70％同一性的葡糖淀粉酶在低于所述含淀粉材料的起始糊化温度的温度下糖化磨细的含淀粉材料，(b)使用发酵生物发酵。2.权利要求1的方法，其中该方法进行1到250小时的时间，优选25到190小时，更优选30到180小时，更优选40到170小时，甚至更优选50到160小时，还更优选60到150小时,甚至还更优选70到140小时，且最优选从80到130小时。3.权利要求1或2的方法，其中该方法在3到7之间，优选从3.5到6,或更优选4-5的pH范围内进行。4.权利要求1至3任一项的方法，其中干固形物含量(DS)位于20-55wt,%,优选25-40wt.-%，更优选30-35wt,。/。的范围内。5.权利要求l-4任一项的方法，其中糖化和发酵期间糖浓度保持在低于大约3wt.。/。的水平。6.权利要求1-5任一项的方法，其中在步骤(a)之前制备包含水和磨细的含淀粉材料的浆料。7.权利要求1-6任一项的方法，其中该磨细的含淀粉材料通过将含淀粉材料磨细成0.1-0.5mm的颗粒大小来制备。8.权利要求1-7任一项的方法，其中该磨细的含淀粉材料是通过干或湿磨获得的颗粒淀粉。9.权利要求1-8中任一项的方法，其中该磨细的含淀;盼材料是整体谷物。10.权利要求1-9任一项的方法，其中同时进行糖化。11.权利要求10的方法，其中发酵期间的温度在28。C到36。C之间，例如在29。C到35°C之间，例如在30°C到34°C之间，例如大约32°C。12.权利要求1-3任一项的方法，其中该葡糖淀粉酶来源于A/ze/z'a13.权利要求1-13中任一项的方法，其中该葡糖淀粉酶以0.001到10AGU/gDS，优选从0.01到5AGU/gDS,特别是0.1到0.5AGU/gDS的量存在。14.权利要求1-13任一项的方法，其中存在酸性a-淀粉酶。15.权利要求14的方法，其中该酸性a-淀粉酶是真菌a-淀粉酶，优选来源于曲霉属的菌抹，特别是黑曲霉，米曲霉或泡盛曲霉。16.权利要求15的方法，其中该酸性a-淀粉酶是与SEQIDNO:4具有至少70°/。，优选至少75%，80%，85%或至少90%,例如至少95%，至少97%，至少98%，或至少99。/。同一性的氨基酸序列的酸性a-淀粉酶。17.权利要求14-16中任一项的方法，其中该真菌酸性a-淀粉酶是包含oc-淀粉酶催化结构域(CD)和糖结合模块(CBM)和任选的接头或野生型真菌酸性a-淀粉酶催化结构域(CD)和糖结合模块(CBM)和任选的接头的杂合体酶。18.权利要求17的方法，其中该CBM来源于A/^rg/Z/wsfewac/z//a-淀粉酶，A/ze//a葡糖淀粉酶，或黑曲霉葡糖淀粉酶。19.权利要求17或18的方法，其中该CBM来源于A/ze/z'ara//^葡糖淀粉酶，黑曲霉葡糖淀粉酶或AAmracto'a-淀粉酶。20.权利要求14的方法，其中该酸性a-淀粉酶是酸性细菌a-淀粉酶。21.权利要求20的方法，其中该酸性a-淀粉酶来源于地衣型芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌和嗜热脂肪芽孢杆菌的菌林。22.权利要求21的方法，其中该酸性细菌a-淀粉酶来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的菌抹，与SEQIDNO:7所述的野生型氨基酸序列相比具有突变I181*+G182*，优选1181*+G182*,+N193F。23.权利要求20的方法，其中该细菌a-淀粉酶是包含SEQIDNO:5所示的地衣型芽孢杆菌a-淀粉酶445个C-末端氨基酸残基和SEQIDNO:6所示的解淀粉芽孢杆菌a-淀粉酶的37个N-末端氨基酸残基且具有取代(使用SEQIDNO:5编号)的杂合体a-淀粉酶。24.权利要求20的方法，其中该细菌a-淀粉酶是具有SEQIDNO:5所示的氨基酸序列且具有突变H156Y，A181T,N190F,A209V，Q264S，和/或位置176和179之间的两个残基缺失，优选缺失E178和G179的a-淀粉酶。25.权利要求14-24中任一项的方法，其中酸性a-淀粉酶以0.1到10AFAU/gDS,优选0.10到5AFAU/gDS，特别是0.3到2AFAU/gDS的量存在。26.根据权利要求14-25任一项的方法，其中酸性a-淀粉酶和葡糖淀粉酶以0.1到10AGU/AFAU，优选0.30到5AFAU/AGU，特别是0.5到3AFAU/AGU之间的比率加入。27.权利要求1-26任一项的方法，其中该发酵产物在发酵后回收。28.权利要求1-27任一项的方法，其中该发酵产物是醇，优选乙醇，特别是燃料乙醇，饮用乙醇和/或工业乙醇。29.权利要求1-28任一项的方法，其中该方法在蛋白酶，优选酸性蛋白酶，优选真菌酸性蛋白酶存在下进行。30.权利要求l-29任一项的方法，其中该含淀粉材料从块茎，根，茎，果实，种子或整体谷物获得。31权利要求1-30任一项的方法，其中该含淀粉材料从玉米，穗轴(cobs),小麦，大麦，黑麦，milo，西米，木薯，木薯粉(manioc),木薯淀粉，高梁，稻或马铃薯获得。32.权利要求1-31任一项的方法，其中该含淀粉材料从谷类获得。33.根据权利要求1-32任一项的方法，其中步骤(a)期间的温度从30。C到75。C,优选在45到60。C之间。全文摘要本发明涉及从磨细的含淀粉材料生产诸如乙醇的发酵产物的方法，包括(a)用具有SEQIDNo2所示的氨基酸序列的葡糖淀粉酶，或者与其至少70％相同的葡糖淀粉酶在低于所述含淀粉材料的起始糊化温度的温度下糖化磨细的含淀粉材料，(b)使用发酵生物发酵。文档编号C12N9/24GK101517072SQ200580008578公开日2009年8月26日申请日期2005年1月14日优先权日2004年1月16日发明者亨里克·比斯加德-弗朗曾,凯文·S·温格,埃里克·阿兰申请人:诺维信北美公司;诺维信公司