专利名称：Schizochytrium脂肪酸合酶(fas)以及与其相关的产品和方法
技术领域：
本发明通常涉及来自Schizochytrium的脂肪酸合酶以及与其相关的产品和方法。
背景技术：
从乙酰辅酶A和丙二酸单酰辅酶A从头合成短链和中链饱和脂肪酸是由几种酶活催化的复杂过程。在大多数细菌和植物中，这些活性与离散的单功能多肽有关。然而在真菌和动物中，这些活性被整合进入一个或两个多功能多肽链中。脂肪酸，特别是作为甘油酯的以油和脂肪的形式存在的脂肪酸，因为它们具有高能含量，所以在人的营养供给中起主要作用。另外，特殊类型的脂肪酸(例如多未饱和脂肪酸，如DHA)具有广泛的生理学作用。人们对于能够利用在产生这些脂肪酸(例如以油和/或磷脂的形式)的有机体中制备的特殊类型的脂肪酸很感兴趣。
发明综述本发明的一个实施例涉及一种包含选自如下氨基酸序列的分离的蛋白(a)选自下列的氨基酸序列SEQ ID NO2、SEQ ID NO5、SEQ IDNO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9、SEQ ID NO10、SEQID NO11、SEQ ID NO12、SEQ ID NO13，由SEQ ID NO2的位置1-500组成的氨基酸序列，由SEQ ID NO2的位置450-1300组成的氨基酸序列，由SEQ ID NO2的位置1250-1700组成的氨基酸序列，由SEQ ID NO2的位置1575-2100组成的氨基酸序列，由SEQ ID NO2的位置2025-2850组成的氨基酸序列，由SEQ ID NO2的位置2800-3350组成的氨基酸序列，由SEQ ID NO2的位置3300-3900组成的氨基酸序列，由SEQ ID NO2的位置3900-4136组成的氨基酸序列，以及它们的生物活性片段；和(b)一种氨基酸序列，该氨基酸序列与(a)的氨基酸序列中的任何一个具有至少约45％的同一性并具有(a)的氨基酸序列的生物活性。该实施例的另一个方面，所述分离蛋白包含与(a)的任何一个氨基酸序列具有至少60％的同一性、至少约80％的同一性或至少约95％的同一性的氨基酸序列。本实施例的一个优选的方面是，所述蛋白包含选自下列的一种氨基酸序列，选自下列的氨基酸序列SEQ ID NO2，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO10，SEQ ID NO11，SEQ ID NO12，SEQ ID NO13，由SEQ ID NO2的位置1-500组成的氨基酸序列，由SEQ IDNO2的位置450-1300组成的氨基酸序列，由SEQ ID NO2的位置1250-1700组成的氨基酸序列，由SEQ ID NO2的位置1575-2100组成的氨基酸序列，由SEQ ID NO2的位置2025-2850组成的氨基酸序列，由SEQ ID NO2的位置2800-3350组成的氨基酸序列，由SEQ ID NO2的位置3300-3900组成的氨基酸序列，由SEQ ID NO2的位置3900-4136组成的氨基酸序列，或这些序列中任何一个的生物活性片段。在一个更优选的实施例中，蛋白质包含选自下列的氨基酸序列SEQ ID NO2，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO10，SEQ ID NO11，SEQ ID NO12和SEQ ID NO13。
该实施例的一个方面，所述蛋白质包含选自下列氨基酸序列的任何两个或更多的氨基酸序列SEQ ID NO2，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO10，SEQ ID NO11，SEQID NO12和SEQ ID NO13。另一方面，所述蛋白质包含SEQ ID NO5，SEQID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO10，SEQID NO11，SEQ ID NO12和SEQ ID NO13。另一方面，所述分离蛋白来自Thraustochytriale微生物，在一个优选的实施例中来自Schizochytrium微生物。
本发明的另一个实施例涉及分离的核酸分子，所述核酸分子包含编码任一上述已鉴别的蛋白的核酸序列，或与之完全互补的核酸序列。本发明的另一个实施例涉及包含这种分离的核酸分子的重组核酸分子，操作性地与转录控制序列连接。一个方面，该转录控制序列是组织特异性转录控制序列。另一个方面，所述重组核酸分子进一步包含引导肽。本发明另一个实施例涉及用这种重组核酸分子转化的重组细胞。
本发明另一个实施例涉及通过生物合成方法生产短链脂肪酸的遗传修饰微生物，所述微生物用上述重组核酸分子转化。
本发明另一个实施例涉及用于通过生物合成方法生产短链脂肪酸的遗传修饰植物，所述植物用上述重组核酸分子转化。
本发明另一个实施例涉及通过生物合成方法生产短链脂肪酸的遗传修饰微生物。所述微生物包含编码脂肪酸合酶的核酸分子，其中该核酸分子已被修饰以提高脂肪酸合酶的表达或生物活性。脂肪酸合酶包含选自如下序列的氨基酸序列(a)选自下列的氨基酸序列SEQ ID NO2，SEQIDNO5，SEQID NO6，SEQID NO7，SEQ ID NO8，SEQID NO9，SEQID NO10，SEQ ID NO11，SEQ ID NO12，SEQ ID NO13，由SEQ IDNO2的位置1-500组成的氨基酸序列，由SEQ ID NO2的位置450-1300组成的氨基酸序列，由SEQ ID NO2的位置1250-1700组成的氨基酸序列，由SEQ ID NO2的位置1575-2100组成的氨基酸序列，由SEQ ID NO2的位置2025-2850组成的氨基酸序列，由SEQ ID NO2的位置2800-3350组成的氨基酸序列，由SEQ ID NO2的位置3300-3900组成的氨基酸序列，由SEQ IDNO2的位置3900-4136组成的氨基酸序列，以及它们的生物活性片段；或(b)一种氨基酸序列，该氨基酸序列与(a)的氨基酸序列中的任何一个具有至少约45％的同一性并具有(a)的氨基酸序列的生物活性。在一个实施例中，编码脂肪酸合酶的核酸分子是微生物体内的内源基因。在另一个实施例中，微生物已用编码脂肪酸合酶的核酸分子转化。在另一个实施例中，微生物包含编码脂肪酸合酶的内源基因，并已由编码脂肪酸合酶的重组核酸分子转化。在这个实施例中，基因和重组核酸分子之一或二者都被修饰，以提高脂肪酸合酶的表达或生物活性。这种遗传修饰微生物可包括Thraustochytriales微生物，且在某个方面，是Schizochytrium微生物。
本发明另一个实施例涉及包含上述遗传修饰微生物的生物质，以及包含这种生物质的食品，或者包含这种生物质的药品。
本发明另一个实施例涉及通过生物合成过程生产短链脂肪酸的方法，所述方法包括在发酵培养基中培养上述遗传修饰微生物。本发明另一个实施例涉及通过生物合成过程生产短链脂肪酸的方法，所述方法包括培育已由上述重组核酸分子转化的遗传修饰植物。
本发明另一个实施例涉及一种寡核苷酸，所述寡核苷酸包含SEQ IDNO1、SEQ ID NO3或SEQ ID NO4的至少12个连续的核苷酸，或与之完全互补的核酸序列。
本发明另一个实施例涉及具有减少产量的短链脂肪酸的遗传修饰微生物，其中所述微生物已被遗传修饰以选择性的减弱编码结构域的脂肪酸合酶基因或其部分。脂肪酸合酶基因包含选自如下序列的核酸序列(a)编码SEQ ID NO2的核酸序列；和(b)编码与SEQ ID NO2至少具有45％的同一性的氨基酸序列的核酸序列，其中所述包含氨基酸序列的蛋白具有的生物活性选自乙酰转移酶(AT)活性、烯酰ACP还原酶(ER)活性、脱水酶(DH)活性、丙二酰/棕榈酰酰基转移酶(M/PAT)活性、第一酰基载体蛋白(ACP)活性、第二酰基载体蛋白(ACP)活性、酮脂酰ACP还原酶(KR)活性、酮脂酰ACP合酶(KS)活性以及磷酸泛酰巯基乙胺基(phosphopantetheinyl)转移酶(PPT)活性。一个方面，脂肪酸合酶基因包含由SEQ ID NO1代表的核酸序列。另一方面，所述微生物提高了至少一种多未饱和脂肪酸(PUFA)的产量。所述微生物可包括，但不限于，Thraustochytriales微生物，具体为Schizochytrium。一方面，脂肪酸合酶基因在调控区被修饰以减少基因的表达。另一方面，脂肪酸合酶基因在编码区被修饰以降低脂肪酸合酶一个或多个结构域的生物活性。另一方面，脂肪酸合酶基因通过与核酸序列定向同源重组进行突变，所述核酸序列与脂肪酸合酶基因杂交，并包括修饰脂肪酸合酶基因的编码区以减少由此编码的脂肪酸合酶的表达或活性的异源核酸序列。
本发明另一个实施例涉及包含上文直接描述的遗传修饰微生物的生物质，其中所述微生物与相同物种的野生型微生物相比，减少了短链脂肪酸的生产。本发明还包括包含这种生物质的食品和药品。
本发明另一个实施例涉及在生物合成过程中提高多不饱和脂肪酸(PUFA)的产量的方法。该方法包括在有效生产包含PUFA的脂类的条件下，培养上文直接提出的遗传修饰微生物的步骤。含有通过这种方法生产的脂类的产品，包括食品和药品，也包含在本发明的范围中。
发明附图的简要描述
图1是推定的存在于Schizochytrium FAS蛋白中的酶促区域的示意图。
图2A是用于定向失活Schizochytrium FAS基因的质粒构建的示意图。
图2B是相信会发生并导致Schizochytrium中的FAS基因稳定失活的事件的示意图。
图3是在来自细胞壁缺乏的Schizochytrium菌株(AC66)和该菌株的突变体(其中PUFA聚酮化合物合酶orfC基因(PUFA-KO)或FAS基因(FAS-KO)已被灭活)的无细胞匀浆中由[1-14C]-丙二酰-CoA合成脂肪酸的数字化图像。
发明的详细描述本发明总的涉及来自Schizochytrium的脂肪酸合酶(FAS)、生物活性片段及其同源序列，编码这种FAS的核酸序列、其片段及同源序列，编码Schizochytrium FAS的基因，重组表达FAS的宿主细胞及有机体，内源FAS的表达和/或活性已被减弱的宿主细胞和有机体，各种制备和使用这些蛋白、核酸分子、基因、宿主细胞或有机体中任何一种的方法。本发明的FAS蛋白是具有就氨基酸序列和线性结构域构成来说，与真菌中由两种蛋白包含的酶促结构域同源的多酶促结构域的蛋白。也在一个大的蛋白上发现哺乳动物FAS区域，但是所述结构域酶活的组成和具体类型与Schizochytrium和真菌FAS相比明显不同。另外，Schizochytrium FAS结构域和在哺乳动物FAS中发现的结构域之间氨基酸序列同源性明显小于Schizochytrium和真菌FAS之间的同源性。
多功能蛋白的发现提供了一种经济地生产短链脂肪酸的新方法。例如，现在可以克隆和表达一个具有关键顺序酶促功能的基因，所述关键顺序酶促功能在其它(非哺乳动物)有机体中至少两种基因上被发现，这将大大促进具有生产能力的有机体的遗传修饰。另外，可以单独或以各种结合的方式使用Schizochytrium FAS基因的酶促结构域，以构建表达一个或多个结构域的各种重组/合成基因。
更具体地，本发明者从包含编码脂肪酸合酶(FAS基因)的单个orf(可读框)的Schizochytrium sp.ATCC 20888克隆了基因组DNA的一个区域。所述酶的推定的功能(即短链饱和脂肪酸例如C14:0和C16:0的合成)，通过显示其中该基因被破坏的菌株为了存活需要补充短链脂肪酸得以证实。由Schizochytrium基因编码的FAS具有一些新特征。蛋白中结构域的组成与在许多真菌(例如面包酵母)中发现的相似。然而，在迄今被表征的所有真菌酶中，FAS编码为两个亚单位(即两个蛋白)，而Schizochytrium FAS是一个大蛋白。基于与真菌系统的同源性，可能Schizochytrium FAS使用乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A以及NADH和NADPH作为底物。释放的产物很可能作为酰基辅酶A酯。如在酵母中，蛋白包含磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶结构域，它被认为活化包埋的酰基载体蛋白结构域。Schizochytrium FAS是一种用于短链饱和脂肪酸合成的“完全一体”(‘all-in-one’)的蛋白。
如本文使用的，短链脂肪酸被定义为具有18个和更少的碳的脂肪酸。本发明的FAS系统生产短链脂肪酸，它可包括任何短链脂肪酸，典型的具有16、14或12个碳的脂肪酸，并包括饱和和单不饱和脂肪酸。例如，由FAS系统生产的短链脂肪酸包括，但不限于短链饱和脂肪酸，例如C14:0和C16:0。本发明包括FAS系统任何产物的生产。
Schizochytrium是一种海产的显微藻类，它被开发用作富含DHA的油的商业来源。Schizochytrium中的DHA是高度特异性的PUFA合酶产物(描述于PCT
发明者詹姆斯·G·梅茨, 克雷格·A·韦弗, 杰里·M·库纳 申请人:马泰克生物科学公司