专利名称：稳定化的脯氨酸转运蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及稳定化的脯氨酸转运蛋白及编码该蛋白的基因，以及使用该基因转化酵母后得到的、可高效利用麦汁等原料中的脯氨酸的酵母属(Saccharomyces)酵母。
背景技术：
脯氨酸是麦汁等酒精饮料原料中含有的主要氨基酸之一。但当与酵母更适合的其他氨基酸、氨等氮源共存时，脯氨酸不能被酵母积极地摄入同化。这是由于在其他氨基酸、氨等存在下，担负脯氨酸摄入的脯氨酸转运蛋白PUT4基因(以下称“PUT4基因”)的转录受到抑制以及脯氨酸转运蛋白Put4(以下称“Put4”)的稳定性极低的缘故。
因此，进行了通过酵母提高脯氨酸等利用性的尝试。因葡萄酒酵母一般都缺乏向细胞中运送脯氨酸的能力，所以，基本不能同化葡萄汁中的脯氨酸。因此，当葡萄汁中的氮含量少时，尽管含有脯氨酸，但为促进发酵，仍需添加磷酸二铵等的氮源。日本特开平2001-346573号公报中有如下记载，尝试从广泛的酵母群中筛选具有同化葡萄汁中脯氨酸能力的酵母，获得了具有同化脯氨酸能力、属于酵母属的一菌株。另外，通过使用该酵母酿造葡萄酒，不仅同化了以往在发酵中酵母不能同化的葡萄汁中的脯氨酸，且其浓度减少的同时，还获得了乙醇浓度较高，具有丰富和醇厚的味道，具有温和香味的葡萄酒。
另外，也进行了有关氨基酸转运蛋白稳定性的氨基酸水平分析的尝试。并有如下报道，色氨酸转运蛋白Tat2，由于其转运蛋白自身的不稳定化且易被分解，虽可调节色氨酸的摄入，但通过N末端31氨基酸残基中的5个赖氨酸全部被精氨酸取代，使色氨酸转运蛋白Tat2得以稳定化(Thomas Beck等，The Joumal of Cell Biology，Volume 146，Number 6，September 20，19991227-1237)。
在Fumihiko Omura等的Biochemical and Biophysical ResearchCommunications 287，1045-1050(2001)中报道了如下结果，其为分析对异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸的摄入起重要作用的转运蛋白Bap2在转录后的调节机制的结果，表明N末端49残基中的赖氨酸残基等参与了转录后调节。
还有如下报道，N末端第9和第16赖氨酸残基与非特异性氨基酸转运蛋白Gaplp的转录、翻译后的分解调节有关，通过用精氨酸残基取代这些氨基酸可使Gaplp稳定化[Soetens，O.et al.J.Biol.Chem.，vol.276，43949-43957(2001)]。
但是，却没有与Put4的稳定化有关的氨基酸残基的报道，此Put4参与麦汁等酒精饮料原料中含有的主要氨基酸之一脯氨酸的摄入。因此，为提高发酵过程中脯氨酸的利用性，期望提高Put4的稳定性，进而有效利用包含啤酒原料麦汁等的发酵原料中含有的脯氨酸的全部氨基酸，制备生产率高的酿造菌株。
专利文献1日本特开平2001-346573号公报非专利文献1The Journal of Cell Biology，Volume 146，Number 6，September 20，1999 1227-12非专利文献2Biochemical and Biophysical ResearchCommunications 287，1045-1050(2001)非专利文献3Soetens，O.et al.J.Biol.Chem.，vol.276，43949-43957(2001)发明内容如上所述，尽管脯氨酸是麦汁等酒精饮料原料中含有的主要氨基酸之一，但与其他氨基酸、氨等酵母更适合的氮源共存时，脯氨酸不能被酵母积极地摄入、同化。这是由于在其他氨基酸、氨等的存在下，担负脯氨酸摄入的PUT4基因的转录受到抑制，以及Put4的稳定性极低的缘故。本发明的目的是，通过使用基因诱变的方法，例如定点诱变的方法抑制Put4的分解，从而提高该转运蛋白的稳定性，以及有效利用包含啤酒原料麦汁等的发酵原料中含有的脯氨酸的全部氨基酸，制备生产率高的酿造菌株。
本发明涉及通过基因突变获得的稳定化的脯氨酸转运蛋白及编码该蛋白的基因，以及使用该基因转化酵母后得到的、可高效利用麦汁等发酵原料中的脯氨酸的酵母属酵母。
本发明者等发现，通过Put4的N末端侧氨基酸9、34、35、60、68、71、93、105及107赖氨酸的至少一个被精氨酸取代，优选该赖氨酸的至少6个被精氨酸取代，更优选该赖氨酸的全部被精氨酸取代，可使Put4稳定化，而且发现表达稳定化的Put4的酵母可有效利用包含啤酒原料麦汁等发酵原料中含有的脯氨酸的全部氨基酸，且生产率高，从而完成了本发明。
即，本发明是N末端氨基酸残基编号为9、34、35、60、68、71、93、105及107的赖氨酸的至少一个被精氨酸取代的突变型脯氨酸转运蛋白Put4(以下称“突变型Put4”)。
本发明还是N末端氨基酸残基编号为9、34、35、60、68、71、93、105及107的赖氨酸的至少6个被精氨酸取代的突变型Put4。
本发明还是N末端氨基酸残基编号为60、68、71、93、105及107的赖氨酸被精氨酸取代的突变型Put4。
本发明还是N末端氨基酸残基编号为9、34、35、60、68、71、93、105及107的赖氨酸全部被精氨酸取代的突变型Put4。
本发明还是编码N末端氨基酸残基编号为9、34、35、60、68、71、93、105及107的赖氨酸的基因中至少一个被编码精氨酸的基因取代的突变型脯氨酸转运蛋白PUT4基因(以下称“突变型PUT4基因”)。
本发明还是编码N末端氨基酸残基编号为9、34、35、60、68、71、93、105及107的赖氨酸的基因中至少6个被编码精氨酸的基因取代的突变型PUT4基因。
本发明还是编码N末端氨基酸残基编号为60、68、71、93、105及107的赖氨酸的基因被编码精氨酸的基因取代的突变型PUT4基因。
而且，本发明还是编码N末端氨基酸残基编号为9、34、35、60、68、71、93、105及107的赖氨酸的基因全部被编码精氨酸的基因取代的突变型PUT4基因。
本发明还是含有上述基因的重组载体或含有该重组载体的酵母，特别是酵母属的酵母，更具体地说是啤酒酵母、葡萄酒酵母、清酒酵母等。
而且，本发明是一种啤酒、杂酒或葡萄酒的制造方法，且还是在前述酵母存在下进行发酵过程的制造方法。
本发明中，通过使用稳定化的突变型Put4，可高效利用麦汁等酒精饮料的原材料中含有的难同化性脯氨酸等的氮源。另外，通过能大量摄取氮源的酵母的发酵，可促进碳源的同化，提高酒精饮料的生产率。并且难同化性氮源的利用与节约资源相关联，可进行对环境温和的酒精饮料的生产。
图1是实施例1得到的3种突变型Put4的序列模式图。突变型Put4，其氨基酸残基编号为9、34、35、60、68、71、93、105、107的赖氨酸残基(K)中的任一个或全部被精氨酸残基(R)取代。
图2表示具有天然型Put4(WT Put4)及实施例1得到的突变型Put4(mPut4#10、mPut4#18、mPut4#20)的啤酒酵母的转化体、和其亲株VLBRasse J株中表达的PUT4 mRNA。ACT1 mRNA的检测也用内部标准进行。
图3表示在3种具有用实施例1得到的突变型脯氨酸转运蛋白Put4(mPut4#10、mPut4#18、mPut4#20)的啤酒酵母的转化体、和具有天然型Put4(WT Put4)的菌株中表达、积累的Put4的量。导入的Put4附加有HA标签，可由抗HA抗体通过Western印迹法检测。
图4表示表达突变型Put4的菌株(mPUT4#20)或表达天然型Put4的菌株(WT PUT4)、及亲株VLB Rasse J株的脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸的摄入、同化能力。将这些菌株置于合成培养基中在好氧条件下振荡培养，测定0、9、23小时后培养基中的各氨基酸量，并绘图标出。
图5是表示使用亲株BH422和表达突变型脯氨酸转运蛋白mPut4#20的菌株进行啤酒试验发酵时的糖同化、总氨态氮同化的经时变化图。
图6是使用亲株VLB Rasse J和表达突变型脯氨酸转运蛋白m Put4#20的菌株在进行啤酒试验发酵时，将其发酵第77小时的各种氨基酸的摄入、同化以VLB Rasse J的效价为100％表示的示意图。图中的氨基酸用三字母表示法表示。
具体实施例方式
<PUT4基因>
酵母Saccharomyces cerevisiae的PUT4基因已被克隆，其碱基序列也已被报道[例如，参照Gene，volume 83，(1989年)，153-159，Vandenbol，M.等]。因此，PUT4基因以其碱基序列信息为基础，使用以从酵母Saccharomycescerevisiae制备的染色体DNA为PCR的模板，通过用PCR扩增、分离，可获得PUT4基因。
用于PUT4基因制备的染色体DNA，只要属于具有PUT4基因的Saccharomyces cerevisiae酵母即可，可由任何酵母制备。作为Saccharomycescerevisiae的酵母，例如，可以举出Saccharomyces cerevisiae X2180-1A[Rose，M.D.，Winston，F.and Hieter，P.(1990)Methods in Yeast GeneticsALaboratory Course Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY]。根据使用染色体DNA的PCR，其目的基因的扩增及其后的分离，包含PCR引物的制备，可使用本领域技术人员周知的方法进行。
<定点诱变>
定点诱变可使用本领域技术人员周知的方法进行。在定点诱变时，作为无限制的例子，例如可利用(1)Oligonucleotide-directed Dual Amber法(ODA法，寡核苷酸介导的双琥珀酸法)/Takara Biomedicals；(2)LA PCR in vitromutagenesis(体外LAPCR诱导)/Takara Biomedicals、以及(3)ExSiteTMPCR-Based Site-Directed Mutagenesis Kit(基于PCR的定点诱变试剂盒)/STRATAGENE。以下对各方法简要说明。
(1)Oligonucleotide-directed Dual Amber法(ODA法，寡核苷酸介导的双琥珀酸法)/Takara Biomedicals在卡那霉素抗性基因(Km)上具有的琥珀突变的质粒(pKF 18k-2/19k-2等)中插入目的基因。将所得到的DNA通过热变性变成单链DNA后，使修复了Km的琥珀突变的合成寡核苷酸与用于在目的基因中导入目的突变的突变用合成寡核苷酸同时杂交。维持导入了此DNA的突变，同时进行复制，最终只选择Km的琥珀突变完全被修复的DNA。所选择的DNA，其目的基因中以高概率导入了目的突变。
(2)LAPCR in vitro mutagenesis(体外LAPCR诱导)/TakaraBiomedicals将欲导入突变的DNA片段插入任意质粒的多克隆位点。用目的基因的导入目的突变的引物与多克隆位点附近的引物进行PCR(I)。另一方面，用目的基因的诱变和使反向多克隆位点中一个位点(A)消失的引物，覆盖插入的DNA片段全体，进行PCR(II)。混合PCR(I)(II)的产物，进行含有导入的突变，扩增插入的DNA片段全体的PCR。此处得到的DNA片段中具有目的突变的片段，因克隆位点(A)消失，所以，如用限制性内切酶(A)酶切PCR产物后进行利用位点(A)的亚克隆操作，即，此时进行了再克隆的产物，理论上应全是导入了目的突变的产物。
(3)ExSiteTMPCR-Based Site-Directed Mutagenesis Kit(基于PCR的定点诱变试剂盒)/STRATAGENE将欲导入突变的DNA片段插入适当的质粒中。通过用dam+(具有DNA甲基化酶活性)的大肠杆菌使得到的DNA增加，从而使GATC序列中的A为甲基化状态。以此质粒为模板，将用于导入目的突变的合成寡核苷酸以正义、反义两方向合成，并以其为引物进行PCR。进行PCR后，将所得到的DNA片段用只能酶切被甲基化的DNA的限制性内切酶DpnI酶切，只保留包含目的突变的DNA片段。将其用T4DNA连接酶连接，形成环状DNA的形态时，回收目的基因中导入了目的突变的质粒。
本发明中，为使Put4稳定化，导入位于Put4的N末端附近的赖氨酸残基被精氨酸残基取代的突变。即，用编码精氨酸的密码子AGG或AGA取代编码赖氨酸的密码子AAG或AAA。诱变处理的确认可通过用本领域技术人员周知的方法，分析结束了突变操作的DNA的碱基序列来进行。
本发明的实施方式之一是，将利用PCR所得到的开放阅读框(ORF)的一部分在质粒DNA上克隆后，通过Kunkel方法，诱导结果为位于Put4的N末端附近的赖氨酸残基(氨基酸残基编号为9、34、35、60、68、71、93、105及107的赖氨酸残基)中1个至9个全部被精氨酸残基取代的突变。具体地说，制备使Put4的氨基酸残基编号为9、34、35、60、68、71、93、105及107位置的赖氨酸残基中1个至9个全部被精氨酸取代的合成DNA。诱导多个赖氨酸残基被精氨酸残基取代的突变时，可混合多个合成DNA后使用。定点突变可使用宝酒造公司(宝酒造社)制的试剂盒Mutan-K，用Kunkel的方法(Kunkel，T.A.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，488，1985)进行。
<酵母的转化>
酵母转化的进行，可通过在酵母中的能组成性表达的质粒载体上，克隆由前述方法得到的突变型PUT4基因ORF，使用所得到的DNA构建物转化酵母。酵母可使用任意的酵母，但优选酵母属的酵母，特别优选啤酒酵母、葡萄酒酵母、清酒酵母。
此方法中向酵母导入突变型PUT4基因时的载体，只要是在酵母中可组成性表达的质粒载体均可。例如，也可使用染色体整合型的pUP3GLP(Omura，F.et al.，FEMS Microbiol.Lett.，194，207，2001)、pYCGPY(Kodama，Y.et al.，Appl.Environ.Microbiol.，67，3455，2001)等的单拷贝复制型的质粒。
转化株可通过在表达质粒中整合抗药性基因，例如，对放线菌酮有抗药性的基因，用含有该药剂(例如0.3μg/ml)的琼脂培养基选择。
导入了突变型PUT4的基因在所得到的转化株中的表达，可通过用Northem印迹法分析PUT4 mRNA的表达量来进行。例如，从培养液中回收对数增殖期的供试菌株，洗涤酵母菌体后，悬浮于0.2mM的LETS缓冲液
中，加入0.4g的玻璃珠，剧烈搅拌，使菌体破碎。将得到的菌体破碎液进行10,000xg、10分钟离心后得到上清液，苯酚处理3次后加入乙醇，在-20℃使全RNA沉淀。将所得到的全RNA 20μg按照通常方法[Sambrook，J.，Fritsch，E.F.andManiatis，T.(1989)Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY]用甲醛凝胶电泳分离后，转移至尼龙膜，进行PUT4mRNA的检测。检测用Roche公司制的DIG-Northern印迹法检测试剂盒进行。
突变型Put4的菌体内积累量可通过Western印迹法等测定。例如，从10ml的培养液中回收对数增殖期的表达突变型Put4的菌株，在溶解缓冲液[8M尿素、5％(w/v)SDS、40mM Tris-HCl(pH6.8)、0.1mM EDTA、1％β-巯基乙醇]中用玻璃珠搅拌破坏，得到细胞提取液。将总蛋白60μg的样品用SDS-凝胶电泳分离，转移至硝基纤维素膜后，使用兔多克隆抗HA抗体(SantaCruz Biotechnology公司制)进行Western印迹分析。突变型Put4与天然型Put4相比，其在细胞内的分解、代谢受到了抑制且难于破坏，此结果表明其在细胞内的积累量增加了。
<突变型Put4>
本发明的突变型Put4，是Put4的N末端侧氨基酸残基编号为9、34、35、60、68、71、93、105及107的赖氨酸的至少一个被精氨酸取代的突变体。另外，本发明的突变型Put4是前述赖氨酸的至少6个被精氨酸取代的突变体。而且，本发明的突变型Put4是前述赖氨酸全部被精氨酸取代的突变体。
本发明的突变型Put4具有在酵母内稳定性高的特征。
<使用组成性表达突变型Put4的酵母的培养>
通过组成性表达突变型Put4的酵母的氨基酸摄入，可通过在适合该酵母的条件下好氧培养，测定培养基中的各氨基酸量来进行评价。氨基酸的测定可使用本领域技术人员周知的方法，例如液相色谱法测定。本发明的酵母不仅改善了脯氨酸的摄入，而且促进了甘氨酸及丙氨酸的摄入、同化。
将突变型Put4转化到啤酒酵母、葡萄酒酵母或清酒酵母，并可使用该酵母制造啤酒、杂酒(包含发泡酒)、葡萄酒或清酒。啤酒、杂酒、葡萄酒或清酒的制造可使用本领域技术人员周知的方法进行。各发酵过程中氨基酸同化的状况可通过测定发酵液中的各氨基酸量进行评价。
实施例以下通过实施例进一步详细说明本发明，但本发明不限于以下实施例。
实施例1.PUT4基因的分离和诱变因酵母Saccharomyces cerevisiae的PUT4基因已被克隆，其碱基序列也已被报道，所以以此信息为基础，通过PCR扩增分离PUT4基因。PCR的模板使用从研究室酵母X2180-1A[Rose，M.D.，Winston，F.and Hieter，P.(1990)Methods in Yeast GeneticsA Laboratory Course Manual，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY]制备的染色体DNA。此时，以检验之后表达的Put4p蛋白的稳定性为目的，以来自流感病毒血球凝集素(HA)的氨基酸配列10残基为标签并付加于PUT4 ORF的ATG起始密码子上游的形式，制备了PUT4 ORF(Chen，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90，6508，1993)。用于扩增PUT4的ORF的PCR用引物，使用5’-GAGCTCATGTACCCATACGA TGTTCCGGAT TACGCTAGCG TAAATATACTGCCCTTCCAC AAGA-3’(序列号1)及5’-GGATC CTTAC AACAA GGCGTCCAAG AACTT GTC-3’(序列号2)的合成DNA。所得到的约1.9kb的PCR产物利用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen公司制)克隆，获得了质粒pCR-PUT4。
为进行定点突变，首先将PUT4 ORF的一部分作为pCR-PUT4的408bp的SacI-KpnI片段进行制备，将其插入pUC119[宝酒造公司(宝酒造社)制]的SacI/KpnI限制性内切酶位点，获得质粒pUC-PUT4。使用pUC-PUT4的辅助噬菌体等制备单链DNA(Vieira，J.and Messing，J.，Methods inEnzymology，153，3，1987)，将其作为定点突变操作时的模板使用。为使Put4p的氨基酸残基编号为9、34、35、60、68、71、93、105及107位置的赖氨酸残基中的几个被精氨酸取代，将以下6条合成DNA完全混合，作为用于诱发突变的引物使用5’-GCCCT TCCACAGGAA CAATA GACAC-3’(序列号3)、5’-GGCGA CACCAGAAGGGAGGA GGATG T-3’(序列号4)、5’-GCGAC AATGA AAGAGATGAC GCCA-3’(序列号5)、5’-TCCGTATGGA GAGAATATCTAGGAA CCAGTCCGC-3’(序列号6)、5’-GGACTTGGAGAGATC GCCCT CC-3’(序列号7)、5’-GAGCC GCACAGACTAAGACA AGGTT TGCA-3’(序列号8)。另外，上述序列号3～8中的下线部分，是为了突变成编码精氨酸的密码子而导入的取代部分。定点突变使用宝酒造公司(宝酒造社)制的试剂盒Mutan-K，用Kunkel的方法(Kunkel，T.A.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，488，1985)进行。确认突变操作结束后DNA的碱基序列后，可判断出得到了编码3种突变型脯氨酸转运蛋白Put4[mPut4#10、mPut4#18、mPut4#20(图1)]的基因，所以，此时以双链质粒DNA的形态回收，用SacI和KpnI酶切后，制备408bp的SacI-KpnI片段。
实施例2.突变型PUT4基因在啤酒酵母中的表达将编码3种突变型PUT4基因的ORF的一部分408bp的SacI-KpnI片段、与编码从pCR-PUT4另行制备的ORF的剩余部分1508bp的KpnI-BamHI片段同时插入表达载体pUP3GLP的SacI/BglII位点，制成质粒，用于使突变型mPut4#10、#18、#20在啤酒酵母中表达。作为对照，将附有HA标签的天然型PUT4 ORF作为1916bp SacI-BamHI片段制备，插入表达载体pUP3GLP的SacI/BglII位点，制成天然型Put4表达用质粒。使用所得到的表达用质粒，用醋酸锂法[Rose，M.D.，Winston，F.and Hieter，P.(1 990)Methods in Yeast GeneticsA Laboratory Course Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY]转化啤酒酵母Saccharomycescerevisiae VLB Rasse J株。因使用的表达质粒具有针对放线菌酮的抗药性基因，所以，转化株使用含有0.3μg/ml放线菌酮的琼脂培养基选择。
为确定所得到的转化株是否表达了导入的PUT4基因，可通过Northern印迹法分析PUT4 mRNA的表达量。从10ml的培养液中回收对数增殖期的表达天然型Put4、突变型mPut4#10、mPut4#18、mPut4#20的各转化株及亲株的VLB Rasse J株，洗涤酵母菌体后，悬浮于0.2mM的LETS缓冲液
中，加入0.4g玻璃珠，剧烈搅拌使菌体破碎。将所得到的菌体破碎液用10,000xg、离心10分钟，得到上清液，苯酚処理3次后加入乙醇，在-20℃使全RNA沉淀。将所得到的全RNA 20μg按照通常方法(Sambrook，J.，Fritsch，E.F.andManiatis，T.(1989)Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)用甲醛凝胶电泳分离后，转移至尼龙膜，进行PUT4mRNA的检测。检测用Roche公司制的DIG-Northern印迹检测试剂盒进行。表明了任一转化株中导入的PUT4的mRNA均同等程度地高表达(图2)。
实施例3.突变型Put4的菌体内积累量评价从10ml的培养液中，回收对数增殖期的表达突变型脯氨酸转运蛋白mPut4#10、mPut4#18、mPut4#20及天然型转运蛋白Put4(以下称“天然型Put4”)的菌株，在溶解缓冲液[8M尿素、5％(w/v)SDS、40mM Tris-HCl(pH6.8)、0.1mM EDTA、1％β-巯基乙醇]中用玻璃珠搅拌破坏，得到细胞提取液。将总蛋白60μg的样品，用SDS-凝胶电泳分离，转移至硝基纤维素膜后，使用兔多克隆抗HA抗体(Santa Cruz Biotechnology公司制)进行Western印迹分析。附有HA标签的天然型Put4及突变型Put4的检测，使用Amersham Biosciences公司的ECL试剂盒，利用化学发光进行。突变型脯氨酸转运蛋白mPut4#20与天然型Put4相比，其在细胞内的分解、代谢受到抑制且难破坏，此结果表明其在细胞内的积累量增加了(图3)。其他的突变型脯氨酸转运蛋白mPut4#18也同样进行了稳定化，可看出蛋白的积累，但稳定化的程度较mPut4#20小(图3)。
实施例4.通过表达突变型Put4的菌株，评价氨基酸的摄入能力将表达突变型(mPut4#20)或天然型Put4的菌株、及亲株VLB Rasse J株，以吸光度(OD 600nm)＝0.5的菌体浓度，接种于合成培养基2xSC[只使标准的合成培养基SC培养基(Rose，M.D.，Winston，F.and Hieter，P.(1990)Methods in Yeast GeneticsA Laboratory Course Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)的氮源为2倍浓度，且脯氨酸的最终浓度增加到7.5mM的培养基]中，在30℃条件下好氧振荡培养23小时。用氨基酸分析仪(Hitachi L-8800)对开始时、9小时后、23小时后的培养样品中的氨基酸含量进行定量。虽然，天然型Put4的高表达对脯氨酸的摄入改善也起到了一定程度的效果，但高表达突变型脯氨酸转运蛋白mPut4#20的菌株，其脯氨酸的摄入则得到了大幅度的改善，同时促进了甘氨酸、丙氨酸的摄入(图4)。
实施例5.使用表达突变型Put4的菌株的啤酒试验发酵使用组成性表达突变型mPut4#20的酵母(FOY336)，用2升圆筒形发酵罐，使用麦芽率100％的麦汁进行了试验发酵。以1.5升的麦汁中酵母为15×106cells/ml的细胞密度投入，在18℃温度条件下进行发酵。发酵开始时的糖浸出物浓度为12.87％(w/v)，pH值为4.93，溶解氧为8.6ppm。开始到发酵77小时之间糖浸出物浓度变化，用Anton Paar公司制的浓度计(DMA-48)测定，同时分析发酵醪液中残留的总氨基酸量(总氨态氮)的变化。将亲株VLB Rasse J和表达突变型mPut4#20的菌株FOY336的糖同化、总氨态氮同化的经时变化用图表示(图5)。从图中可判断，表达突变型mPut4#20的菌株与对照亲株相比，碳源、氮源的摄入、同化均得到了促进。将表达突变型mPut4#20的菌株在发酵77小时后各氨基酸的摄入，与由亲株的摄入相比较表示时，表达mPut4#20的FOY336菌株中脯氨酸的摄入为亲株的4倍以上(图6)。用表达突变型mPut4#20的FOY336株制作的啤酒分析值如下表所示。
表1
以上结果表明，使用表达突变型mPut4#20的菌株制造的啤酒是酒精发酵度高且富于高级醇、酯等的馥郁香味的啤酒。而且，使用导入了其他突变型转运蛋白mPut4#10、mPut4#18的菌株制造的啤酒也呈现出杂味少、且淡爽的优质香味。
序列表<110>三得利株式会社(Suntory Co.，LTD.)<120>稳定化的脯氨酸转运蛋白(Stabilized proline transporter protein.)<130>YCT-1052<160>8<210>1<211>65<212>DNA<213>人工序列(Artificial sequence)<220>
<223>合成DNA；线状及单链(synthesized DNA；linear and single strand.)<400>1gagctcatgt acccatacga tgttccggat tacgctagcg taaatatact gcccttccac60aaga64<210>2<211>33<212>DNA<213>人工序列(Artificial sequence)<220>
<223>合成DNA；线状及单链(synthesized DNA；linear and single strand.)<400>2ggatccttac aacaaggcgt ccaagaactt gtc33<210>3<211>25<212>DNA<213>人工序列(Artificial sequence)<220>
<223>合成DNA；线状及单链(synthesized DNA；linear and single strand.)<400>3gcccttccac aggaacaata gacac25<210>4<211>26<212>DNA<213>人工序列(Artificial sequence)<220>
<223>合成DNA；线状及单链(synthesized DNA；linear and single strand.)<400>4ggcgacacca gaagggagga ggatgt26<210>5<211>24<212>DNA<213>人工序列(Artificial sequence)<220>
<223>合成DNA；线状及单链(synthesized DNA；linear and single strand.)<400>5gcgacaat gaaagagat gacgcca24<210>6<211>34<212>DNA<213>人工序列(Artificial sequence)<220>
<223>合成DNA；线状及单链(synthesized DNA；linear and single strand.)<400>6tccgtatgga gagaatatct aggaaccagt ccgc34<210>7<211>22
<212>DNA<213>人工序列(Artificial sequence)<220>
<223>合成DNA；线状及单链(synthesized DNA；linear and single strand.)<400>7ggacttggag agatcgccct cc22<210>8<211>29<212>DNA<213>人工序列(Artificial sequence)<220>
<223>合成DNA；线状及单链(synthesized DNA；linear and single strand.)<400>8gagccgcaca gactaagaca aggtt tgca29
权利要求
1.一种突变型脯氨酸转运蛋白Put4，其中，N末端氨基酸残基编号为9、34、35、60、68、71、93、105及107的赖氨酸的至少一个被精氨酸取代。
2.按照权利要求1中所述的突变型脯氨酸转运蛋白Put4，其中，N末端氨基酸残基编号为9、34、35、60、68、71、93、105及107的赖氨酸的至少6个被精氨酸取代。
3.按照权利要求2中所述的突变型脯氨酸转运蛋白Put4，其中，N末端氨基酸残基编号为60、68、71、93、105及107的赖氨酸被精氨酸取代。
4.按照权利要求1中所述的突变型脯氨酸转运蛋白Put4，其中，N末端氨基酸残基编号为9、34、35、60、68、71、93、105及107的赖氨酸全部被精氨酸取代。
5.一种突变型脯氨酸转运蛋白PUT4基因，其中，编码N末端氨基酸残基编号为9、34、35、60、68、71、93、105及107的赖氨酸的基因中至少一个被编码精氨酸的基因取代。
6.按照权利要求5中所述的基因，其中，编码N末端氨基酸残基编号为9、34、35、60、68、71、93、105及107的赖氨酸的基因中至少6个被编码精氨酸的基因取代。
7.按照权利要求6中所述的基因，其中，编码N末端氨基酸残基编号为60、68、71、93、105及107的赖氨酸的基因被编码精氨酸的基因取代。
8.按照权利要求5中所述的基因，其中，编码N末端氨基酸残基编号为9、34、35、60、68、71、93、105及107的赖氨酸的基因全部被编码精氨酸的基因取代。
9.一种重组载体，其含有权利要求5、6、7或8中任一项所述的基因。
10.一种酵母，其含有权利要求9中所述的重组载体。
11.按照权利要求10中所述的酵母，其为酵母属的酵母。
12.按照权利要求11中所述的酵母，其酵母属的酵母为啤酒酵母或葡萄酒酵母。
13.一种制造方法，其是啤酒或葡萄酒的制造方法，且前述制造方法包含在权利要求11中所述的酵母的存在下进行发酵的过程。
全文摘要
本发明涉及通过基因突变获得的稳定化的脯氨酸转运蛋白Put4及编码该蛋白的基因，以及使用该基因转化酵母后得到的、可高效利用麦汁等原料中的脯氨酸的酵母属酵母。更具体地说，本发明通过使用经稳定化的突变型脯氨酸转运蛋白Put4，可高效利用麦汁等酒精饮料的原材料中含有的难同化性脯氨酸等的氮源。通过能大量摄取氮源的酵母的发酵，可促进碳源的同化，提高酒精饮料的生产率。另外，难同化性氮源的利用还与节约资源相关联，并可进行对环境温和的酒精饮料的生产。
文档编号C12N1/19GK1973039SQ20058002083
公开日2007年5月30日 申请日期2005年6月17日 优先权日2004年6月22日
发明者大村文彦, 福井宣之, 近藤平人 申请人:三得利株式会社