专利名称：酵母变异株、富含谷胱甘肽的酵母的制备方法、其培养物、其级分物、酵母提取物和含有谷 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及假丝酵母属(Candida)的酵母变异株。更详细的是，涉及在菌体内可以含有大量还原型或氧化型谷胱甘肽的产朊假丝酵母(Candidautilis)的变异株，由培养该变异株获得的培养物，级分物，酵母提取物和利用这些物质的饮食品。
背景技术：
谷胱甘肽是由谷氨酸、甘氨酸、半胱氨酸这3种氨基酸构成的三肽，在酵母和动物的肝脏，肌肉等的组织中广泛分布，其在生物体内与解毒作用和氧化还原平衡作用相关。基于对这种生理活性的认识，谷胱甘肽现在逐渐被广泛用作醇性脂肪肝的治疗药物和肝脏疾病治疗药物。
另一方面，近年来，随着从健康意图的观点出发健康功能性食品受到人们关注，即使在食品领域中基于谷胱甘肽的生理活性，含有同物质的食品也倍受瞩目。
作为谷胱甘肽的工业制造方法，一般的方法是从酵母中提取，此时，获得谷胱甘肽含量高的酵母就成为必要条件。
作为以往已知的谷胱甘肽高含量酵母的制备方法，有在培养基中添加氨基酸的方法(专利文献1)，限制锌离子的方法(专利文献2)，在比通常条件更低的培养温度下培养的方法(专利文献3)等。此外，还有用突变剂处理的乙基硫氨酸亚硫酸盐抗性株(专利文献4)，多烯类抗生素抗性株(专利文献5)等。
不过，为了工业上廉价地获得谷胱甘肽，希望获得谷胱甘肽含量更高的酵母。
专利文献1特开昭53-94089号公报专利文献2特开平1-141591号公报专利文献3特开昭60-156379号公报专利文献4特开昭59-151894号公报专利文献5特开2003-284547公报发明的公开发明欲解决的课题本发明在上述技术背景下，以提供菌体内具有大量谷胱甘肽的酵母和利用这种酵母的含有谷胱甘肽的饮食品作为课题。
用于解决课题的方法本发明人为了解决上述课题进行了积极的研究，结果发现，具有镉抗性或大环内酯类抗生素抗性的酵母变异株在菌体内含有比一般的野生酵母更多的谷胱甘肽，从而完成了本发明。
即，本发明如下。
(1)具有镉抗性或大环内酯类抗生素抗性，可以含有高浓度谷胱甘肽的酵母变异株。
(2)根据(1)记载的酵母变异株，前述酵母变异株的谷胱甘肽的菌体内含量在0.3wt％或以上。
(3)根据(1)记载的酵母变异株，前述具有镉抗性的酵母变异株是产朊假丝酵母ABYC1560(保藏号FERM P-20094)。
(4)根据(1)记载的酵母变异株，前述大环内酯类抗生素是雷帕霉素。
(5)根据(1)记载的酵母变异株，前述具有大环内酯类抗生素抗性的酵母变异株是产朊假丝酵母ABYC1561(保藏号FERM P-20095)。
(6)谷胱甘肽高含量酵母的制备方法，其特征在于有氧培养(1)至(5)任一项中记载的酵母变异株，使谷胱甘肽在该酵母菌体内累积成高浓度。
(7)通过在有氧条件下培养(1)至(5)任一项中记载的酵母变异株获得的培养物。
(8)通过在有氧条件下培养(1)至(5)任一项中记载的酵母变异株而获得的含有谷胱甘肽的上述培养物的级分物。
(9)使用通过在有氧条件下培养(1)至(5)任一项中记载的酵母变异株获得的培养物制备的酵母提取物。
(10)使用通过在有氧条件下培养(1)至(5)任一项中记载的酵母变异株获得的培养物而制备的干燥酵母菌体。
(11)含有谷胱甘肽的饮食品，其特征在于其含有通过在有氧条件下培养(1)至(5)任一项中记载的酵母变异株获得的培养物、包含谷胱甘肽的前述培养物的级分物。
发明的效果本发明的新型酵母变异株可以在菌体内以高浓度含有谷胱甘肽。通过有氧培养本发明的新型酵母变异株可以使谷胱甘肽在该酵母菌体内累积成高浓度。
因此，通过在有氧条件下培养本发明的新型的酵母变异株可以获得含有高浓度谷胱甘肽的培养物或级分物。
此外，通过在有氧条件下培养本发明的新型的酵母变异株可以获得含有高浓度谷胱甘肽的酵母提取物。
进而，通过使饮食品含有在有氧条件下培养本发明的新型的酵母变异株获得的培养物、包含谷胱甘肽的前述培养物的级分物或经加热处理的前述培养物或级分物，可以成为含有谷胱甘肽的饮食品。
用于实施发明的最佳方式以下，对发明进行详细的说明。
本发明的新型的酵母变异株是具有镉抗性或大环内酯类抗生素抗性、可以含有高浓度谷胱甘肽的酵母变异株。
此外，本发明的具有镉抗性的酵母变异株是以产朊假丝酵母15-10株等作为亲本株，通过突变处理，选择与亲本株相比重金属抗性能力提高的变异株而获得。
具体的是，用紫外线，电离辐射，亚硝酸，亚硝基胍，甲磺酸乙酯(以下简称为“EMS”)等变异原进行突变处理，选择在含有镉等重金属的培养基上确认了生长的变异株。
测定被选择的变异株的菌体中含有的谷胱甘肽量，再选择谷胱甘肽量增强的变异株，寻找可含有高浓度谷胱甘肽的变异株。作为此时使用的重金属，可以使用镉，水银等。这样一来，在本发明中，获得了新型的变异株产朊假丝酵母ABYC1560。
本发明的变异株产朊假丝酵母ABYC1560在菌体中积累了相当于干燥重量的0.3wt％或以上的谷胱甘肽。在本发明中的谷胱甘肽是指还原型和氧化型谷胱甘肽的谷胱甘肽总量。
此外，本发明的新型变异株产朊假丝酵母ABYC1560的一般的菌学性质除了镉抗性外，与产朊假丝酵母的一般菌学性质完全相同。本发明的新型变异株产朊假丝酵母ABYC1560以“保藏号FERM P-20094”保藏。
此外，本发明的酵母变异株只要是具有大环内酯类抗生素抗性，进而在菌体内可以含有大量氧化型和还原型谷胱甘肽的酵母，可以是任意一种。具体的是，可例举有以产朊假丝酵母ABYC1560株作为亲本株，通过突变处理获得的产朊假丝酵母ABYC1561等。
所谓大环内酯类抗生素是具有大环状内酯的抗生素，作为本发明的大环内酯类抗生素，可以例举有例如雷帕霉素、羊毛霉素(Renamycin)、兰卡杀菌素C等。
为了获得本发明的具有大环内酯类抗生素抗性的酵母变异株，具体的是，使用紫外线，电离辐射，亚硝酸，亚硝基胍，EMS等变异原，选择在含有大环内酯类抗生素的培养基上确认了生长的变异株。测定被选择的变异株的菌体中含有的谷胱甘肽量，再选择谷胱甘肽量增强的变异株，寻找可含有高浓度谷胱甘肽的变异株。这样一来，在本发明中，获得了新型的变异株产朊假丝酵母ABYC1561。
本发明的具有大环内酯类抗生素抗性的变异株ABYC1561在菌体中积累了相当于干燥重量的0.5wt％或以上的谷胱甘肽。在本发明中的谷胱甘肽是指还原型和氧化型谷胱甘肽的谷胱甘肽总量。
进而，本发明的新型变异株产朊假丝酵母ABYC1561的一般的菌学性质除了大环内酯类抗生素抗性外，与产朊假丝酵母的一般菌学性质完全相同。本发明的新型变异株产朊假丝酵母ABYC1561以“保藏号FERMP-20095”保藏。
本发明中，进而还提供了有氧培养变异株的谷胱甘肽高含量酵母的制备方法。
在本发明中，进而还提供了有氧培养上述酵母变异株制备谷胱甘肽高含量的酵母的方法。为了实施本发明，可以在含有碳源，氮源和无机盐等的培养基中有氧培养前述方法获得的镉抗性变异株或大环内酯类抗生素抗性变异株。
作为这些菌株的培养基的组成，可以使用选自于通常的微生物培养中利用的葡萄糖，蔗糖，醋酸，乙醇，糖蜜和亚硫酸盐纸浆废液等中的1种或2种或以上物质作为碳源，使用选自于尿素，氨，硫酸铵，氯化铵或磷酸铵等无机盐和玉米浆(CSL)，酪蛋白，酵母提取物或蛋白胨等含氮有机物等中的1种或2种或以上物质作为氮源。进而，还可以在培养基中添加磷酸成分，钾成分，镁成分，作为这些成分，可以是过磷酸钙，磷铵(リン安)，氯化钾，氢氧化钾，硫酸镁，盐酸镁等常规的工业用原料。此外，也可以添加锌，铜，锰，铁离子等无机盐。此外，还可以添加维生素，核酸相关物质等。
作为培养形式，可以是分批培养、流加培养或连续培养的任一种，但是工业中采用流加培养或连续培养。
培养温度可以按照一般的酵母的培养条件，理想的是，例如20-40℃，优选25-35℃，pH3.5-8.0，尤其是4.0-6.0。
由本发明的方法获得了在酵母菌体中含有高浓度谷胱甘肽的培养物，但是也可以从培养物中获得含有谷胱甘肽的级分物。作为从培养物中分级含有谷胱甘肽的级分物的方法，可以是常规进行的方法的任一种，但是可以列举有通过热水提取，通过菌体破碎提取等。此外，通过使获得的提取物吸附在载体中，可以浓缩为含有高浓度谷胱甘肽的级分。
此外，还可以从经上述方法培养的培养物中制备酵母提取物。作为制备酵母提取物的方法，可以是常规进行的方法的任一种方法，但是工业中采用自溶法，酶分解法或碱提取法等。
此外，也可以从经上述方法培养的培养物中制备干燥酵母菌体。作为制备干燥酵母菌体的方法，可以是常规进行的方法的任一种方法，但是工业中采用冷冻干燥法，喷雾干燥法法或转鼓式干燥法等。
进而，本发明还涉及含有通过在有氧条件下培养上述酵母变异株获得的培养物、包含谷胱甘肽的前述培养物的级分物的饮食品。
作为这种饮食品，只要是可添加常规干燥酵母、酵母提取物的饮食品即可，可例举有酒精饮料，清凉饮料，发酵食品调味料，汤类，一般食品，糕点等。
为了制备本发明的饮食品，可以在饮食品的制造过程中添加在好氧条件下培养上述酵母变异株获得的培养物、包含谷胱甘肽的前述培养物的级分物。
因此，通过本发明可以有效制造含有高浓度谷胱甘肽的饮食品。
以下，通过列举实施例来说明本发明。本发明并不受这些实施例的限定。
另外，菌体重量的测定是在用离心分离机2次水洗培养液后，使之在105℃干燥5小时后的重量求得。合并还原型和氧化型谷胱甘肽的总谷胱甘肽的定量按照Titze等人的方法(“Analytical Biochemistry”第27卷，第502页，1969年)测定。干燥菌体中的总谷胱甘肽量(％(w/w))是获得的总谷胱甘肽量与干燥菌体重量的比例计算获得的百分率。
实施例1在含有YPD培养基(2％葡萄糖，2％蛋白胨，1％酵母提取物)的试管中培养产朊假丝酵母直至对数生长期。然后，回收菌体，按照常规方法用EMS进行变异处理。变异处理在死亡率成为约70％的条件下进行。
将如上所述实施了变异处理的15-10株接种于含有0.2mg/ml镉的YPD培养基中，30℃下静置培养48小时。其结果，分离了200株镉抗性变异株。对于这些镉抗性变异株，按照上述方法进行总谷胱甘肽量测定，获得了菌体内谷胱甘肽量增强的产朊假丝酵母ABYC1560(保藏号FERM P-20094)。
实施例2在YPD培养基中预培养获得镉抗性的ABYC1560株(保藏号FERMP-20094)及其亲本株15-10株18小时后，接种于YPD培养基中，30℃下进行本培养18小时。通过离心分离回收培养后的菌体，水洗2次后，在沸水浴中煮沸5分钟，提取菌体内的谷胱甘肽，按照上述方法实施总谷胱甘肽量的测定。干燥菌体中的总谷胱甘肽量，亲本株(15-10)是0.52wt％，与之相对，镉抗性株(ABYC1560株(保藏号FERM P-20094))为1wt％。
实施例3在含有YPD培养基(2％葡萄糖，2％蛋白胨，1％酵母提取物)的试管中培养产朊假丝酵母直至对数生长期。然后，回收菌体，按照常规方法用EMS进行变异处理。变异处理在死亡率成为约70％的条件下进行。
将如上所述实施了变异处理的ABYC1560株接种于含有1μg/ml的雷帕霉素的YPD琼脂培养基中，30℃下静置培养48小时。其结果，分离了745株雷帕霉素抗性变异株。对于这些抗性株，按照上述方法进行总谷胱甘肽量测定，获得了菌体内谷胱甘肽量增强的产朊假丝酵母ABYC1561(保藏号FERM P-20095)。
实施例4在YPD培养基中预培养获得雷帕霉素抗性的ABYC1561株及其亲本株ABYC1560株18小时后，接种于YPD培养基中，30℃下进行本培养18小时。通过离心分离回收培养后的菌体，水洗2次后，在沸水浴中煮沸5分钟，提取菌体内的谷胱甘肽，按照上述方法实施总谷胱甘肽量的测定。干燥菌体中的总谷胱甘肽量，亲本株(ABYC1560)是1.00％，与之相对，雷帕霉素抗性株(ABYC1561株(保藏号FERM P-20095))为1.82％。
工业上的利用可能性本发明在以下方面存在工业上的利用可能性。
本发明的新型酵母变异株可以在菌体内含有高浓度谷胱甘肽，通过有氧培养本发明的新型酵母变异株可以使谷胱甘肽在该酵母菌体内积累成高浓度。
因此，通过在有氧条件下培养本发明的新型的酵母变异株可以获得含有高浓度谷胱甘肽的培养物或级分物。
此外，通过在有氧条件下培养本发明的新型的酵母变异株可以获得含有高浓度谷胱甘肽的酵母提取物。
进而，通过使饮食品含有通过在有氧条件下培养本发明的新型的酵母变异株获得的培养物、包含谷胱甘肽的前述培养物的级分物或经加热处理的前述培养物或级分物，可以成为含有谷胱甘肽的饮食品。
权利要求
1.具有镉抗性或大环内酯类抗生素抗性、可以含有高浓度谷胱甘肽的酵母变异株。
2.根据权利要求1记载的酵母变异株，前述酵母变异株的谷胱甘肽的菌体内含量在0.3wt％或以上。
3.根据权利要求1记载的酵母变异株，前述具有镉抗性的酵母变异株是产朊假丝酵母(Candida utilis)ABYC1560(保藏号FERM P-20094)。
4.根据权利要求1记载的酵母变异株，前述大环内酯类抗生素是雷帕霉素。
5.根据权利要求1记载的酵母变异株，前述具有大环内酯类抗生素抗性的酵母变异株是产朊假丝酵母ABYC1561(保藏号FERM P-20095)。
6.谷胱甘肽高含量酵母的制备方法，其特征在于有氧培养权利要求1至5任一项中记载的酵母变异株，使谷胱甘肽在该酵母菌体内累积成高浓度。
7.培养物，其是通过在有氧条件下培养权利要求1至5任一项中记载的酵母变异株而获得的。
8.通过在有氧条件下培养权利要求1至5任一项中记载的酵母变异株而获得的含有谷胱甘肽的上述培养物的级分物。
9.酵母提取物，其是使用通过在有氧条件下培养权利要求1至5任一项中记载的酵母变异株获得的培养物制备的。
10.干燥酵母菌体，其是使用通过在有氧条件下培养权利要求1至5任一项中记载的酵母变异株获得的培养物而制备的。
11.含有谷胱甘肽的饮食品，其特征在于其含有通过在有氧条件下培养权利要求1至5任一项中记载的酵母变异株而获得的培养物、包含谷胱甘肽的前述培养物的级分物。
全文摘要
提供了在菌体内具有大量谷胱甘肽的酵母。具有镉抗性或大环内酯类抗生素抗性、可以含有大量谷胱甘肽的酵母变异株。
文档编号A23L1/305GK1977039SQ20058002212
公开日2007年6月6日 申请日期2005年7月22日 优先权日2004年8月2日
发明者山本佳津惠, 吉村香 申请人:朝日啤酒股份有限公司