对酶进行筛选和选择的新方法

专利名称：对酶进行筛选和选择的新方法
目前用于新的酶产品开发的策略是由假设来驱动的。首先，指定特定应用所需要的酶活性，接着使用针对所指定的酶活性的酶活性试验作为筛选工具来检索相关的酶。典型地，所述检索包括对可能表达想要的酶活性的一种或多种生物进行筛选。通常这些生物是微生物，例如细菌、酵母和真菌。
或者，可针对编码或预期编码具有想要的酶活性的蛋白的基因，通过检索序列数据库来鉴定相关的酶。这些检索依赖于基于被编码的基因产物与已知基因产物之间的同源性，向新的基因指派功能(注解(annotation))。当目标基因已被鉴定出，可使用本领域已知的技术对其进行克隆和表达，可针对想要的活性对其产生的蛋白加以测试。
这些方案最终导致对具有想要的活性的一种或多种酶的鉴定。一旦这些酶被鉴定出，可在最终的应用中针对正确的功能性对它们加以测试。该方案，尤其是通过数据库检索的途径，受益于大量的、并仍逐步增加的被注解基因的库，所述的库可从目前的测序程序获得。
但是，由假设驱动的方案也具有若干缺点。例如，在最终应用中对相关酶的测试仅发生在筛选的最后阶段，这表明，大量的劳动，包括对大量微生物的培养是否成功仅能在筛选的末尾得到验证。通常其转变为工作假设是错误的，这就导致了针对错误的酶活性的检索以及筛选努力的失败。
此外还通常发生如下情况因为缺少对应用系统的理解，针对特定最终应用的相关酶活性完全不能被预先指定。在此类情况下，筛选试验也不能被指定，对于相关酶的检索是不可行的。
在被注解基因用作为用于鉴定新的酶的来源的情况下，对于注解的质量有强依赖性。可能发生注解是错误的这种情况。此外，使用被注解的基因从本质上是保守的方案，其不会导致对全新的、意想不到的基因产物的鉴定。
虽然(可能的)功能现在能被指派给多种基因，但仍有相当数量的基因不能被注解。未被注解的基因的百分比在不同生物中有所不同，其可能在20-70％的范围内。这意味着，相当数量的基因没有包括在以数据库方案针对相关酶的检索中，由此在基于假设的筛选中没有被利用上。
在基于假设的筛选中，一直需要酶试验来鉴定相关的酶。试验的开发是复杂的过程，事实上通常会形成酶筛选中的瓶颈。试验开发通常包括合成可用于鉴定相关酶的合适底物。合成正确的底物通常是试验开发的主要障碍。或者，用于酶的天然底物可被化学或酶促修饰，使得其成为用于筛选目的的合适底物(例如，染料化合物结合到天然底物上)。但是，如果合成的底物与天然底物不同，鉴定出的对合成底物展示活性的酶可能在天然底物上不能展示出活性。
为克服由假设驱动的方案的缺点，本发明提供了一种筛选的补充形式应用基质筛选。
在根据本发明的应用基质筛选中，筛选参数是应用基质中的功能性改变。
在根据本发明的应用基质筛选中，酶活性不需要预先指定，即，其无须在筛选过程之前已知。这与基于假设的筛选在原理上就有所不同，在基于假设的筛选中，首先指定酶活性，所述酶活性应当产生想要的基质功能性的指定改变，由此选择或制备能用于探测前面指定的酶活性的合适的底物。
国际申请WO 00/67025公开了此类基于假设的方案的例子其公开了对可用于筛选脂肪酶的合成荧光标记酰基甘油酯底物的制备。由此，这些底物被特意开发，以筛选指定的酶，即，脂肪酶的活性，此外，这些底物与其中将使用脂肪酶的最终应用不相似。相反，根据本发明的应用基质筛选不以任何方式受限于提前指定酶活性的需要，因此允许对在基于假设的方案中没有被鉴定为相关的酶加以鉴定。根据本发明的方案将大大增加酶筛选的命中率。
例如，当针对应用基质中特定功能性改变(例如，大豆原浆粘度的降低)对表达文库进行筛选时，在筛选过程中会鉴定出编码能完成此功能性改变的酶的所有克隆。相反，在基于假设的筛选中，首先指定能完成此改变的酶活性，例如，蛋白酶或一种或一组特定的细胞壁降解酶(或其组合)，据此开发用于在筛选中找到此类酶的酶试验。
在一个方面，本发明因此提供了用于鉴定目标酶的方法，其中，在应用基质上对一组候选酶进行筛选，优选地，以至少中等的处理量水平进行，针对在应用基质中产生功能性改变的能力对酶加以选择。
在本发明的上下文中，在应用基质中的功能性改变被定义为可通过任何分析方法测量或探测的酶反应导致的应用基质中的任何物理或化学变化。此类功能性改变的例子是聚集状态、颜色、水结合、粘度、凝胶形成、香味情况、臭味形成等的改变。
相关酶活性可以是但不限于，蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶、氧化还原酶、转移酶、异构酶、连接酶、酯酶、水解酶、糖酶、单加氧酶、双加氧酶所施加的活性中的至少一种。
具体地，本发明的方法包括下述步骤a)提供一组侯选酶，b)在应用基质上筛选所述候选酶的组，优选地，以至少中等的处理量水平进行，c)选出在应用基质中产生功能性改变的酶的亚组，d)从所述酶的亚组中选出在进一步的应用检验中具有想要的活性的酶，e)确定酶的活性。
对酶活性的确定可以在本发明方法的任何阶段来进行。但是，无须之前针对待筛选酶活性的本质对应用基质进行调节。
可以以若干种方式产生候选酶的组。例如，候选酶的组通过在有益于一种或多种酶的表达的条件下培养的一组微生物来提供。微生物组的成员可以是不同的微生物物种和/或可以是来自特定微生物物种的不同菌株。一种或多种酶可以细胞内积累或者可以分泌到培养基中。
为根据本发明对候选酶进行筛选，培养各个克隆(表达文库内)，直到达到想要的生物质浓度或者想要的细胞密度。取决于候选酶是细胞内产生还是分泌到培养基中，分别制备细胞提取物或培养上清液用于筛选。
为筛选细胞内积累的酶，需要对细胞进行处理，以将细胞内的酶释放出来，在根据本发明的筛选中与应用基质发生相互作用。典型地，根据本领域技术人员已知的方法来制备不含细胞的提取物。为筛选细胞外的酶，通过离心，可选地，接着进行超滤步骤，将细胞从培养液中移出，由此对培养上清液进行筛选。
优选地，通过在合适的宿主生物中克隆和表达的一组相应基因或cDNA来提供候选酶的组，即通过表达文库来提供。对于编码候选酶的组的基因或cDNA的组的来源和/或宿主生物的选择将还取决于待选择的酶的预期应用。
编码候选酶的组的基因或cDNA的组可以来自任何目标生物，即，动物(包括人)或植物物种或微生物。表达文库可以在多种宿主生物中制得，例如细菌(例如，Escherichia coli、Bacillus subtilis)、酵母(例如，Pichia pastoris、Saccharomyces cerevisiae、Kluyveromyces lactis)、有丝真菌(例如，Aspergillus niger、Aspergillus oryzae)、昆虫细胞或本领域已知的其它蛋白质表达系统，例如不含细胞的表达系统。
优选地，在Bacillus subtilis或Escherichia coli中表达来自细菌的基因或cDNA的组，在Pichia pastoris、Saccharomyces cerevisiae或Kluyveromyces lactis中表达来自酵母的基因或cDNA的组，在例如Aspergillus niger或Aspergillus oryzae中表达来自真菌的基因或cDNA的组，在合适的微生物宿主(对宿主的选择可以例如取决于被编码的酶的大小和性质)中表达来自动物或植物的基因或cDNA的组。
尤其对于具有大基因组的生物，例如真核生物而言，优选使用cDNA来提供候选酶的组。可选地，制备和组合来自在不同条件下培养的生物的不同的cDNA文库。
对于一次命中而言，待筛选的克隆的量除了其它因素之外还取决于基因的组的来源生物。
在原核生物的情况下，可以从在特定环境下获得的mRNA群来构建表达文库。通过在多种培养条件下培养细胞以及在多个时间点取样，可以获得相当全面的mRNA谱。用于此的方法是本领域公知的。或者，已经描述了一些方法用于构建基因组细菌(表达)文库，这是通过用特定内切核酸酶切割基因组DNA并在合适的载体中克隆获得的DNA片段来进行的。这些方案导致了对细菌表达文库的构建。
在真核生物(有丝真菌、酵母、植物等)的情况下，表达文库通常以cDNA文库的形式来构建。构建此类cDNA表达文库的方法是本领域已知的。因为真核生物中的基因数量(范围从烘焙酵母的大约6,000至植物的大约30,000或更多)比细菌(大约2,500至大约4,500的范围内)高得多，并且因为获得真核生物基因组的完全展示所需的培养条件的数量也比原核生物高得多，所以给出真核生物基因组的完全展示的表达文库的文库大小(克隆的数量)通常是原核生物所需的10-100倍。结果，对真核生物而言，来自需要被筛选以鉴定特定基因的表达文库的克隆数量通常比原核生物要大得多。
通过cDNA的文库构建方法固有地暗示了表达库的高重复率大量基因将出现超过1次。随着文库中所有基因的展示达到完全，该重复率将大幅增加。因此，在本发明的一种实施方式中，候选酶的组，例如表达文库可被精练，以降低候选对象的数量，产生经精练的候选酶的组，其也被称为候选酶的轻巧(smart)组，例如，轻巧型表达文库。
精练过程可以去除在文库中展示了不止一次的大部分克隆，即可以去除重复克隆。结果，每种克隆仅有一个或几个代表物留在经精练的文库中，即，候选酶的精练组。候选酶的精练组将因此含有最小数量的被认为与筛选目的相关的成员。对于策略性理由而言，重复可被有目的地重新引入表达文库，例如，使得对整个表达文库培养期间特定克隆的生长失败最小化。
精炼过程还可以从表达文库中去除没有或没有显著蛋白质过量表达的克隆。结果，用于根据本发明的筛选的经精练表达文库富含蛋白质过量生产者的克隆。蛋白质过量生产者是经过转化的克隆，其表达来自克隆基因的蛋白，表达水平使得克隆的蛋白质表达情况与未转化的表达宿主生物的背景蛋白质表达情况可区分开。
根据本发明的精练过程，即例如对表达文库针对重复率和/或蛋白质过量表达进行的成员筛选可以以多种方法进行。
蛋白质过量表达可以例如作为SDS-PAGE上一条或多条额外条带的出现被识别。但是，SDS-PAGE需要付出大量劳动，96孔SDS-PAGE具有低分辨率。SDS-PAGE的类似方法，例如，芯片上实验室(lab-on-a-chip)系统，例如Agilent出售的那些，更适用于至少中等处理量的筛选。
看起来良好适用于对表达文库成员进行中等或者甚至高处理量筛选的系统是质谱。可以基于在例如蛋白水解消化或对待测文库的克隆进行质谱分析之后所获得的独特印记开展精练过程。此类分析可以在细胞外(分泌的)以及在细胞内蛋白质上进行。
用于分析细胞外蛋白的典型程序如下所述。首先通过离心，以及可选地随后进行超滤步骤和/或适合去除副产品(例如碳水化合物和盐)的样品预处理，从培养液中除去细胞，对不含细胞的上清液进行缓冲，以优化蛋白水解消化的条件。通过合适的蛋白酶，例如胰蛋白酶对样品进行处理，可选地，接着(色谱)脱盐，并注射进质谱仪。得到的质谱由具有取决于克隆的蛋白组分的分子量分布的肽图组成。相似克隆将给出相似的图，允许对重复克隆加以鉴定。当克隆过量表达特定蛋白质时，较之不含过量表达的蛋白质的克隆而言这将导致质谱中额外的肽。额外的肽的分子量与它们的片段化谱一起成为过量生产的蛋白质的独特印记。
为分析细胞内蛋白，可以按照本领域技术人员已知的技术来制备不含细胞的提取物。优选地，使用尽量少与随后的筛选步骤相互影响的方法来制备提取物。
各种质谱仪都是目前可获得的，其离子化方法(例如，电喷雾离子化(ESI)或基质辅助激光解吸附离子化(MALDI))以及质量测定的方法(例如，飞行时间(TOF)、四极(Q)、三级式四极(TQ)或四极飞行时间(QTOF)、离子回旋加速共振(ICR)、(线性)离子阱等)有所不同。优选地，使用具有高分辨率以及工作循环(duty cycle)的质谱仪。在一种设定中，选用的质谱仪与作为离子化技术的MALDI，以及TOF、QTOF或两级或三级式Q或(线性)离子阱质量分析仪一起操作。
上文所述的精练过程可用于任何表达文库。因此，本发明提供了一种方法，用于通过去除重复和/或通过去除没有或没有显著蛋白质过量表达的克隆来精练表达文库。
在合适的应用基质上对未精练的，或优选精练的候选酶的组加以筛选，选出能在应用基质中产生功能性改变的酶的亚组。功能性改变可以是由任何酶反应导致的、可被分析方法测量或探测到的应用基质中的任何物理或化学改变。
用于根据本发明的筛选的合适的应用基质原则上可以是类似目标特定最终应用的任何基质。由此无须特意针对筛选特定的预定酶活性对应用基质加以调节。优选地，目标最终应用是食品和/或饲料应用。
因此，对用于筛选的应用基质的选择还由其中待筛选酶应当具有活性的、想要的最终应用来确定。
优选地，应用基质应当尽可能接近最终(大规模)应用，即，应当与最终应用的底物具有基本相同的组分，和/或至少是最终应用的经验证代表物。
技术人员将理解，在不背离本发明宗旨的情况下，应用基质可以例如含有与相应最终应用中存在的量略有不同的量的例如蛋白质、碳水化合物和/或脂类。例如，可能必须使用比最终应用含有更大量的水的应用基质。或者或此外，应用基质的组分，例如在相关于蛋白、碳水化合物和/或脂类含量或比例的方面，与最终应用的组合物略有不同。
优选地，应用基质的组分与最终应用的组分至少70重量％(基于应用基质以及最终最终的干物质含量)对应，更优选地，至少80％，进一步更优选地，至少90％，最优选地，至少95％。
优选地，应用基质还应当在时间上可再现地生产。在时间上可再现生产指，应用基质的生产应当产生随时间基本相同总组分的基质，和/或应用基质的生产不应经历不能被调节的季节性改变。应用基质还应当优选与在至少中等处理量水平(例如，微滴定板形式)上进行的筛选相容，以及优选与移液和泵吸过程相容(例如，没有大的块状物)。应用基质应当优选具有稳定的物理状态。
例如，对于面包制作而言，应用基质可以是可由其制造面包的特定面团，或者，可由其制造面包的面团的经验证代表物，例如，小麦(或者其它目标谷物)面粉或原浆；对奶酪制造而言，应用基质可以是全脂(牛)奶或凝乳；对于酱油去粘化而言，应用基质可以是浓缩的大豆原浆。
典型地，以中等处理量水平筛选指每周筛选至少一千，例如一千至十万份样品(克隆)。当然，根据本发明的筛选还适于在低处理量水平上进行，即，小于每周一千份样品。
本发明包括若干种实施方式，用于在目标应用基质上筛选一组候选酶并且随后选出在应用基质中产生功能性改变的酶的亚组。
在本发明的一种实施方式中，选出在应用基质中产生一般功能性改变的酶的亚组。一般功能性改变是不预先指定也不限制为特定性质的改变的功能性改变。其可以是可被任何分析方法测量或探测到的酶反应导致的应用基质中的任何物理或化学改变。由此不需要指定在目标应用基质中待选择的酶将获得何种类型的功能性改变。
对在应用基质中产生一般功能性改变的酶的亚组进行选择需要非常普适性的探测方法和/或技术，即，能探测在应用基质中发生的任何功能性改变的方法和/或技术。若干方法和/或技术可用于该目的，例如下述这些。
热探测，例如，微量热分析，原则上是合适的技术，因为几乎所有(化学)反应都伴随热量产生的改变(放热和吸热)。热探测技术的缺点是其可能不是一直都足够敏感。
可用于鉴定应用基质中的一般功能性改变的另一参数是基质的介电常数。介电探针是可获得的，其能非常敏感地测量媒介，例如应用基质中介电常数的改变。
基于半导体测量的技术，例如电子鼻(electronic nose)和/或嘴(mouth)尤其适合于产生小分子的情况。
合适的技术还有基于红外和RAMAN光谱的技术，例如，Fourier变换红外光谱(FTIR)。这是探测红外光束造成的振动跃迁的技术。光谱中吸收条带的频率与振动基态和激发态之间的能量差相关。这些吸收条带对于特定的原子组是特异的。FTIR产生的光谱可由于应用基质中的一般功能性改变而变化。
非常适合用于测量应用基质中普通改变的技术是高分辨率超声波光谱(HRUS)。高分辨率超声波光谱测量基于对通过应用基质传播的、高的超声波频率的声波的速率和衰减加以测量。HRUS提供了对广范围基质属性的迅速的非破坏性分析。该技术的优点是超声波通过光学不透明的应用基质传播的能力。HRUS使用压电式换能器产生了纵向变形的超声波。测定这些波传播的主要特征是超声波速率和超声波衰减系数。超声波速率的值是密度和纵向调制弹性模量的函数。超声波的吸收和散射决定超声波衰减系数的值。
总之，HRUS技术基于测量当超声波通过应用基质时超声波发生的变化。因此，超声波测量代表了探测应用基质中一般功能性改变的优选技术。
因此，在另一个方面，本发明提供了超声波光谱，优选地，HRUS用于筛选酶活性的用途。特别地，在合适的底物上对上述候选酶的组加以筛选，针对能在底物中产生功能性改变的能力选出酶，其中，使用超声波光谱，优选是HRUS来测量所述功能性改变。合适的底物可以是想要发现在其上具有活性的酶的任何底物。优选地，合适的底物是上述应用基质。优选地，超声波光谱以动力学方式进行，按照下文所述。
在一种优选的实施方式中，对(普通)功能性改变的探测用所谓的动力学分析来进行，即，其中反应随时间进行的分析。反应进行的时间段可从数分钟，例如2或5或10分钟，变动至数小时，例如，2或4或8至24小时。优选地，反应从起始点开始，即，从酶加入到应用基质中的时刻开始(T＝0)。动力学分析有利地允许了对相对背景活性筛选的酶活性的正确测定，所述背景活性可内在性地存在于候选酶的组的成员中和/或存在于应用基质自身中。
在本发明的一种实施方式中，如上所述针对应用基质中一般功能性改变的第一次筛选和选择的结果实际上是候选酶的组(例如，表达文库)的基质特异性亚组。有利地，对特定应用基质而言，针对每种生物，此类基质特异性表达文库仅必须产生一次。表达文库可被贮藏，使得在新的应用问题被提出的情况下它们可被直接获得。
在本发明的另一种实施方式中，在对提供应用基质中一般功能性改变的这些酶进行选择之后，再在应用基质上对获得的酶的亚组(例如，基质特异性表达文库)进行筛选，选出能在应用基质中产生指定功能性改变(即，更类似和/或更接近最终应用中的想要的功能性改变的功能性改变)的酶的进一步亚组。
应用基质中的指定功能性改变被预先指定，这取决于在最终应用中想要的功能性改变。其可以例如是选自由聚集状态、颜色、水结合、粘度、凝胶形成、香味情况、臭味形成等的改变的一种功能性改变。
用于探测指定功能性改变的技术类型取决于指定的功能性改变。可使用多种测量和/或其组合来探测应用基质中指定的功能性改变，例如用DH测量、多种色度和光谱技术、使用热敏电阻、介电属性测量、超声测量、质谱测量、介电常数测定、粘度测量、流变测量等来进行。
对这些相对于未处理基质的改变的探测可以通过直接测量基质或其提取物来进行。对基质的直接测量可以，例如通过流变测量、反射或吸光度测量、粘度测量等来进行。
一些时候可能需要间接测量，即不在基质本身上进行的测量，例如，在从不可溶基质来测量低分子量组分的释放的情况下。在此类情况下，可以从基质中提取低分子量组分以允许进行定量。或者，间接测量可以包括对酶处理时从基质释放的可挥发组分的组成的改变加以测定(例如，使用GC-MS)。
在本发明的另一种实施方式中，在应用基质上对候选酶的组加以筛选，直接针对在应用基质中产生指定功能性改变的能力加以选择。省略掉针对应用基质中一般功能性改变的第一次筛选。
在又一种实施方式中，针对在应用基质中产生指定功能性改变的能力对候选酶的(亚)组进行的筛选重复至少一次。在这种实施方式中，与进一步的筛选相比，针对应用基质中指定改变的第一次筛选可以针对较不严格的改变。在第一次筛选中，做出粗略选择，其中用于选择的条件并不非常严格。在该步选出的候选者可以以更严格的筛选标准被进一步选择。此种两阶段选择可实现更高处理量的筛选，因此可能是人们想要的。其中可能与两阶段选择相关的应用的例子是，通过特定氨基酸在奶酪中产生风味。在第一阶段，选择能产生提高的水平的游离氨基酸的候选酶的组，这是使用，例如通过茚三酮染色探测来进行的。然后在进一步筛选中，针对特定游离氨基酸的产生对选出的候选者加以测试。对于奶酪应用而言，这些特定氨基酸可以是，例如，甲硫氨酸或苯丙氨酸，它们在很多奶酪种类中是重要的香味前体。
有利地，本发明允许可在本发明的任何阶段指定与一种或多种酶分子相关的酶活性，而不必针对待鉴定酶活性的性质对应用基质进行预先调节。
对酶的酶活性的指定可以以本领域技术人员已知的多种方法来进行。例如，其可被建立为何种产物在应用基质中作为(选出的)酶的酶活性的结果而形成。其还可被建立为选出的酶在何种特定(模型)底物上展示出活性。还可以测定选出的酶的氨基酸序列并且分析序列与已知序列的同源性。后一种可能性可以已经在精练表达文库的阶段进行。
在应用基质上的筛选通常在微滴定板或试管规模(100μl至5ml)上发生。对样品培养和转移而言，可以使用移液设备，可选地，与机器手和流通系统相结合。对样品操纵的选择很大程度上由所涉及的应用基质的物理参数来确定。
在应用基质上筛选一组候选酶之后获得的酶的亚组或进一步亚组可以以更大的规模在进一步的应用试验中被筛选。虽然不必是完全规模，但进一步的应用筛选通常较之以克计的规模或更低规模的应用基质筛选的规模要大得多。此类进一步应用试验的例子是微型奶酪和幼面包块。在该进一步应用筛选中展示出积极性能的候选者被选出，在代表最终应用的完全规模应用试验中对其进行测试。
通常，在本发明的方法中进行的筛选的规模会增大。结果，典型地，处理量能力随着规模增加降低，这是因为后勤(logistical)和操作方面的原因。通常以几个至成百上千微升的量培养表达文库，以同样的规模进行分析。该水平上的处理量为至少千的数量级，例如每周千至十万份样品(克隆)，其是中等处理量。在用于本发明的方法时，表达文库的大小通常降低至制备表达文库的生物基因组中存在的基因总数的大约20-30％。这表明，相关候选者的数量降低至数百至数千，精确数量取决于待测生物。本发明的方法有利地允许在进一步应用试验中对最多数百候选者进行筛选。在进一步应用试验中筛选之后，通常留下最多10-20个候选者用于完全规模的应用试验。总的来说，这导致了表达文库和完全规模应用检验之间有效的选择途径(funnel)，其中，仅针对特定应用中的有效性对蛋白加以选择。使用本发明的方法鉴定的(选出的)酶具有很大机会在完全规模的应用中正确并且有效的表现。
在完全规模的应用中，通常需要大量的酶和底物。此外，这种规模的花费通常很高，限制了该阶段的处理量。根据本发明在应用基质上进行的预先筛选有利地降低了在完全规模应用上待测酶的量。
本发明的方法有利地用于鉴定不能通过基于假设的筛选方法来鉴定的新颖的酶活性。
本发明的方法可被用于选择或鉴定一种酶活性，还可用于选择或鉴定两种或多种酶活性的混合。通常，酶活性混合由不同酶分子提供。但是，单种酶分子可提供不同类型的活性也是可能的。
本发明显示，应用基质中的功能性改变可以有利地被用作为筛选参数，用于选择想要的酶活性。
在第二个方面，本发明涉及一种方法，用于生产通过第一个方面的方法选出的酶。所述方法包括在有益于生产所述酶的条件下培养能表达所述选出的酶的微生物，以及回收产生的酶。对酶的回收可以包括下述步骤例如，分离微生物细胞，产生不含细胞的培养上清液，通过例如超滤来浓缩不含细胞的上清液，通过合适的稳定剂对液体培养物的上清液或超滤滤出物进行稳定，对来自液体培养物上清液或超滤滤出物的酶进行进一步纯化，通过制粒和/或干燥技术制备固体酶组合物。优选地，能表达所述选出的酶的微生物是用下述多核苷酸转化的宿主生物，所述多核苷酸含有编码选出的酶的表达盒。


图1.在奶基质中对三种酶的活性进行的超声测量。
图2.在奶酪凝乳基质中对脂肪酶的活性进行的超声测量。
图3.在小麦面粉悬浮液中对五种酶的活性进行的超声测量。
图4.在大豆-WUS基质中对果胶酶的活性进行的超声测量。
图5.对培养上清液和不含细胞的提取物中强化(spiked)的酶的活性进行的超声测量。
实施例1 制备奶酪凝乳基质制备奶酪凝乳基质的代表性方法如下所示。在离心管中于30℃加热全脂牛奶(250克)。在该温度，轻柔搅拌下，直接加入165μl CaCl2，接着加入54.4μl Maxiren180(从DSM Food Specialties，The Netherlands获得)。然后停止搅拌，混合物在30℃保持60分钟。然后在Sorvall GS-3旋转器中对离心管进行离心(5500rpm，25℃)，小心去除上清液。用以1cm的间隔安装在框架上的拉伸线切刀(cutters of stretched wire)，手工切割沉淀。测量沉淀体积，加入等体积的NaCl/乳酸溶液(NaCl 90g/L，12.75ml乳酸/L)。使用Ultra-Turrax对混合物进行均化。均化期间，加入按照下文所述制备的63μl细胞裂解物。测量总体积，通过加入等于该体积33％的量的NaCl溶液(4.5％w/v)，稀释均质物。现在奶酪凝乳基质即可用于应用筛选。
制备细胞裂解物按照下述方法来制备细胞裂解物；将45ml生理盐溶液加入到5mlDELVO-TECLL55D(从DSM Food Specialties，The Netherlands获得)细胞悬浮液中，离心(5000rpm，Sorvall GS3，10分钟，25℃)。弃去上清液，将沉淀重新悬浮于5ml生理盐溶液中，重新离心。最后的循环重复三次，沉淀最终被悬浮于5ml生理盐溶液中。然后，加入630μl裂解酶(从Sigma，the Netherlands获得)溶液(20mg/ml)，混合物贮藏于30℃(1小时)，紧接着在室温下额外孵育(1小时)。对最终的溶液进行离心(4000rpm，10分钟)；小心取出上清液(＝细胞裂解物)，贮藏于-20℃。
实施例2制备小麦面粉基质制备小麦面粉基质的代表性方法如下所示。使用Kolibri面粉(从MENEBA，the Netherlands获得)来制备面粉悬浮液；将6.9g面粉加入到11g去离子水中，同时用旋转振荡器混合。用Ultra-Turraz混合器对面粉悬浮液进行均化，并将其在正弦Coulter混合器(从Coulter ElectronicsLimited，United Kingdom获得)上放置10-30分钟。
该制备之后紧接着，必须将面粉悬浮液在30℃水浴中孵育至少30分钟，这在有或没有酶的情况下进行。然后用超声波水浴(从SonicorInstrument Cooperation，USA获得)对样品进行脱气。小麦面粉基质即可在基质筛选中被测量。
实施例3 制备从大豆获得的水不溶性底物(WUS)基质制备从大豆获得的WUS基质的代表性方法如下所示。在H2O中制得5％w/v大豆WUS制备物。在连续搅拌下，将大豆-WUS在室温下孵育过夜。大颗粒沉淀之后，收集上清液，其即可用于应用筛选。
实施例4使用超声波光谱在奶基质中测量酶活性按照下文所述在奶中对三种酶的活性进行超声测量。运行超声波光谱仪HR-US102，按照厂商(Ultrasonic Scientific，Ireland)说明书进行设置。
将牛奶装入HR-US102超声波光谱仪(Ultrasonic Scientific，Ireland)的1ml超声波小腔(cell)，令其在30℃平衡。温度平衡之后，加入酶，接着进行反应。按照下文所述测试了多种酶和添加物A.以1∶100稀释Maxiren180，加入到奶中(20μl酶/1ml奶)B.以1∶100稀释PiccantaseR8000，加入到奶中(30μl酶/1ml奶)C.以1∶100稀释Maxilact2000，加入到奶中(10μl酶/1ml奶)D.以1∶1000稀释Maxilact2000，加入到奶中(10μl酶/1ml奶)
所有酶都从DSM Food Specialties，The Netherlands获得。活性曲线示于图1中图A至D。
数据显示，超声技术能在一种基质(牛奶)中测量非常多样的酶活性，例如蛋白酶(Maxiren180)、脂肪酶(PiccantaseR8000)和β-乳糖酶(Maxilact2000)。因此，超声波光谱方法非常适合用作为普适性的探测方法，用于根据本发明的基质筛选方案。此外，信号改变的速率取决于加入的酶的量，这由两条Maxilact曲线(高及低剂量)清楚显示。针对Maxiren和PiccantaseR8000的图A和B还显示了8分钟平衡期。
实施例5 使用超声波光谱在奶酪凝乳基质中测量酶活性按照下文所述，在根据实施例1制备的奶酪凝乳中，对一种酶的活性进行超声测量。运行超声波光谱仪HR-US102，按照厂商(UltrasonicScientific，Ireland)说明书进行设置。
将奶酪凝乳+PiccantaseR8000装入HR-US102超声波光谱仪的小腔1，将奶酪凝乳单独装入HRUS的小腔2，在30℃对两个小腔都进行反应。
图2显示，超声技术能在奶酪凝乳基质中测量酶活性，例如脂肪酶(PiccantaseR8000)。
实施例6 使用超声波光谱在小麦面粉基质中测量酶活性按照下文所述，在小麦面粉悬浮液中，对五种酶的活性进行超声测量。
按照实施例2所述制备面粉悬浮液。随后，将面粉悬浮液在30℃水浴中孵育至少30分钟，这在有或没有酶的情况下进行。然后用超声波水浴(从Sonicor Instrument Cooperation，USA获得)对样品进行脱气。
运行超声波光谱仪HR-US102，按照厂商(Ultrasonic Scientific，Ireland)说明书进行设置。将面粉悬浮液+酶装入HR-US102的小腔1，小腔2装入没有酶的面粉悬浮液。在30℃下对样品进行平衡之后，按照厂商说明书来测量样品的超声波速率。
按照下文所述测试了多种酶和添加物A.与500ppm*Bakezyme GO1500孵育的面粉悬浮液B.与300ppm*Bakezyme HS2000孵育的面粉悬浮液C.与38ppm*Bakezyme P500孵育的面粉悬浮液D.与171ppm*Bakezyme B500孵育的面粉悬浮液E.与60ppm*Lipopan-F孵育的面粉悬浮液注意*ppm是mg酶/kg面粉所有Bakezyme酶都从DSM Bakery Ingredient，The Netherlands获得，Lipopan-F从Noyozymes，Denmark获得。
活性曲线示于图3，图A至E。
数据显示，超声技术能在小麦面粉基质中测量非常多样的酶活性，例如葡萄糖氧化酶(Bakezyme GO1500)、木聚糖酶(BakezymeHS2000)、淀粉酶(Bakezyme P500)、蛋白酶(Bakezyme B500)和脂肪酶*(Lipopan F)。
实施例7使用超声波光谱在大豆-WUS基质中测量酶活性按照下文所述，在根据实施例3制备的大豆-WUS中，对两种酶的活性进行超声测量。运行超声波光谱仪HR-US102，按照厂商(UltrasonicScientific，Ireland)说明书进行设置。
将大豆-WUS+酶装入HR-US102超声波光谱仪的小腔1，将大豆-WUS单独装入HRUS的小腔2，反应进程之后是在30℃测量相对超声波速率。
PectinexUltra SP(Novozymes，Denmark)，稀释为10μl/500mlWUSRapidasePress(DSM Food Specialties，The Netherlands)，稀释为50μl/500ml WUS图4显示，超声技术能在大豆-WUS基质中测量酶活性，例如果胶酶(RapidasePress和PectinexUltra SP)。
实施例8使用超声波光谱在奶基质中测量在上清液和不含细胞的提取物中强化的酶活性通过超声波测量来测定Bacillus subtilis培养上清液(A)和Bacillussubtilis不含细胞的提取物(B)中强化的酶活性。运行超声波光谱仪HR-US102，按照厂商(Ultrasonic Scientific，Ireland)说明书进行设置。
将牛奶装入HR-US102超声波光谱仪(Ultrasonic Scientific，Ireland)的1ml超声波小腔，令其在30℃平衡。温度平衡之后，加入从标准的48小时Bacillus subtilis发酵获得的100μl上清液(A)或从同样的48小时Bacillus subtilis发酵获得的100μl不含细胞的提取物(B)，接着进行反应。在两种实验中，在强化或不强化乳酸酶的情况下，对上清液和不含细胞的提取物进行分析。为进行强化，在B.subtilis样品中以1∶1000稀释Maxilact2000。
数据显示，超声波技术能在复杂的蛋白制剂中测量酶活性。
按照下文所述来制备上清液和不含细胞的提取物将B.subtilis菌株从冷冻试管直接接种到100ml TY培养液(16克胰蛋白胨/l，10克酵母提取物/l，5克NaCl/升；用NaOH调节pH至7)，在37℃和250rpm下培养48小时。48小时的发酵之后，通过在5000rpm离心10分钟来收获细胞。收集上清液，用一次性0.22μm无菌过滤真空系统(Millipore，Bedford USA)进行过滤，贮藏于-20℃。
将细胞沉淀悬浮于磷酸缓冲的盐溶液(PBS)中，针对48小时培养物的光密度来校正所用的PBS的量。将细胞悬浮液在含有用于细胞破碎的玻璃珠的试管中分为1ml一份的小份。使用供应商推荐的Blue基质方案，在Fastprep(Q-Biogen，Illkirch，France)中进行破碎。破碎进行两次，其间将样品放在冰上预冷和冷却。破碎之后，通过在10,000个离心1分钟去除细胞碎片和基质。不含细胞的提取物被贮藏于-20℃。
权利要求
1.一种方法，用于鉴定目标酶，所述方法包括在应用基质上筛选一组候选酶，优选地，以至少中等的处理量水平进行，并且针对在所述应用基质中产生功能性改变的能力对酶进行选择。
2.如权利要求1所述的方法，包括a)提供一组侯选酶，b)在应用基质上筛选所述候选酶的组，优选地，以至少中等的处理量水平进行，c)选出在所述应用基质中产生功能性改变的酶的亚组，d)从所述酶的亚组中选出在进一步的应用检验中具有想要的活性的酶，e)确定选出的酶的酶活性。
3.如权利要求2所述的方法，其中，特征c)的所述功能性改变是所述应用基质中的一般功能性改变。
4.如权利要求2所述的方法，其中，特征c)的所述功能性改变是所述应用基质中的指定功能性改变。
5.如权利要求2所述的方法，其中，使用超声波光谱来测量特征c)的所述功能性改变。
6.如权利要求2所述的方法，还包括重复步骤c)，以选出进一步的酶的亚组，所述进一步的酶的亚组能在所述应用基质中产生较特征c)的前面测量的功能性改变而言更严格的功能性改变。
7.如前述权利要求中任意一项所述的方法，其中，所述候选酶的组由在合适的宿主细胞中克隆和表达的一组基因提供，即，由表达文库提供。
8.如权利要求7所述的方法，其中，通过去除重复克隆和/或去除没有或没有显著的蛋白质过量表达的克隆来所述精练表达文库。
9.如前述权利要求中任意一项所述的方法，其中，所述应用基质是全脂奶、凝乳、奶酪浆体、面包面团、谷物面粉悬浮液、谷物原浆或大豆原浆。
10.一种方法，用于生产按照前述权利要求中任意一项所述的方法选出的酶，所述方法包括在有益于生产所述酶的条件下培养能表达所述酶的微生物，以及回收产生的酶。
11.如权利要求10所述的方法，其中，所述微生物是用下述多核苷酸转化过的宿主生物，所述多核苷酸包含编码所述选出的酶的表达盒。
12.将应用基质中功能性改变作为筛选参数用于选择想要的酶活性的用途。
13.超声波光谱在筛选酶活性中的用途。
全文摘要
本发明涉及用于鉴定目标酶的方法，所述方法包括在应用基质上筛选一组候选酶，优选地，以至少中等的处理量水平进行，并且针对能在应用基质中产生功能性改变的能力对酶进行选择。在应用基质中，本发明的筛选方法无须在应用所述筛选方法之前指定待筛选的酶活性。
文档编号A23C19/00GK1981050SQ200580022211
公开日2007年6月13日 申请日期2005年6月30日 优先权日2004年7月1日
发明者阿伯图斯·阿拉德·蒂克·范, 马赛力斯·威廉默斯·伊丽莎白·玛丽亚·帝勒勃格·范, 约特·史蒂文·约翰·格里帝斯玛, 莫伦·马莎·安格塔·欧勒斯通, 鲍克·佛克尔茨玛, 利嘉·韦斯特拉肯 申请人:帝斯曼知识产权资产管理有限公司