具有改良生长特性的植物及其制备方法

专利名称：具有改良生长特性的植物及其制备方法
技术领域：
本发明一般涉及分子生物学领域，并且涉及改良植物生长特性的方法。更具体的，本发明涉及通过增加SNF1相关蛋白激酶(SnRK2)或其同源物在植物中的活性来增加植物产量和/或生物量的方法。本发明还涉及具有SnRK2蛋白激酶或其同源物的编码核酸表达增加的植物，该植物相对于对应的野生型植物具有改良的生长特性。本发明还提供了可用于本发明方法的构建体。
鉴于不断增长的世界人口和农业用地面积的缩小，增加农业效率和增加园艺植物的多样性一直是农业研究的主要目标。作物和园艺改良的常规手段利用选育技术来鉴定具有期望特性的植物。然而，这种选育技术具有若干缺点，即这些技术一般是劳动密集型的，而且产生通常含有异质遗传成分的植物，这并非总是产生自亲本植物传递过来的期望性状。分子生物学的发展已经允许人类操作动物和植物的种质。植物的遗传工程需要分离和操作遗传物质(一般是DNA或RNA的形式)，随后把该遗传物质引入到植物中。此种技术导致具有多种改良的经济学、农艺学或园艺性状的植物的开发。具有特殊经济利益的性状是生长性状，例如高产量。产量通常定义为作物产生的可衡量经济价值。这可以从数量和/或质量方面定义。产量直接取决于一些因素，例如，器官的数量和尺寸，植物结构(例如，枝条的数量)，种子产量等等。根的发育、营养吸收和胁迫耐受性也是确定产量的重要因素。可以通过优化上述因素之一来提高作物产量。
据报道酵母蛋白激酶SNF1参与对葡萄糖饥饿应激的应答。假设它通过磷酸化阻抑蛋白Mig1来激活葡萄糖阻抑的基因。在其他生物中SNF1具有直系同源物，如哺乳动物中AMP-活化的蛋白激酶(AMPK)。ATP减少产生的增加的5’-AMP浓度使得AMPK被激活，所述的ATP减少由应激条件如热激或葡萄糖饥饿引起。植物也具有SNF1相关激酶，称为SnRK。植物SnRK分为3个亚组SnRK1到SnRK3。SnRK1亚组在结构和功能上均与SNF1最紧密相关；而亚组SnRK2和SnRK3对植物是独特的。SnRK2蛋白质缺少在SNF1中发现的C端调节结构域，但是在其C端具有谷氨酸和天冬氨酸的酸性序列段。SnRK2蛋白质具有约40kDa的分子量并且由小基因家族编码据报道拟南芥属(Arabidopsis)和稻都具有10个SnRK2基因。第一个植物SNF1相关蛋白激酶2(SnRK2)(称作PKABA1)是由Anderberg和Walker-Simmons分离的(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89，10183-10187，1992)。发现其是脱落酸(ABA)和脱水作用诱导的。之后，分离出了相关蛋白质，如ASK1和ASK2(Park等人，Plant Molecular Biology22，615-624，1993)。据报道这些基因在一些植物器官中表达，但是在叶中是最丰富的。SnRK2亚组的另一个成员是OST1(Mustilli等人，Plant Cell14，3089-3099，2002)。OST1在气孔保卫细胞和维管组织中表达，并且认为它在脱落酸(ABA)感受和引发气孔闭合的活性氧中间体产生之间发挥作用。在稻中，发现所有的SnRK2蛋白质被高渗胁迫激活，并且它们中的一些还被ABA激活(Kobyashi等人，Plant Cell 16，1163-1177，2004)。据报道REK(又命名为SAPK3，Kobyashi等人，2004)在叶和成熟的种子中表达，但是不在茎或根中表达。重组REK蛋白质在Ca2+存在时表现出增加的自磷酸化作用。
WO98/05760公开了20多个参与磷摄取和新陈代谢的蛋白质(psr蛋白质)的编码核苷酸序列。这些psr蛋白质之一是蛋白激酶psrPK——在磷酸盐饥饿时表达的SnRK2的相关蛋白质。据推测，此蛋白质及其他psr蛋白质可用于操作磷新陈代谢，但是没有实现所建议的表型(它们中的一些与增加的胁迫抗性相关)。Assmann和Li(WO01/02541)描述了另一个与SnRK2相关的蛋白激酶AAPK。据报道AAPK功能的丧失减少了对脱落酸诱导的气孔闭合的敏感性。因此建议其反过来(增加的AAPK表达或增加的活性)会使植物具有增加的干旱胁迫抗性。但是作者没有说明这确实是这种情况。至今为止，可用的SnRK2相关蛋白质的实验数据主要表明其在植物胁迫应答中的作用。
先前的本领域文献没有证实或提示相对于对应的野生型及无胁迫的植物，增加的SnRK2蛋白质表达，或增加的活性和/或表达导致产量增加。
现在令人惊讶的发现相对于对应的野生型植物，植物中SnRK2蛋白质增加的活性和/或表达使得植物具有改良的生长特性，尤其是产量。这些结果是在标准植物生长条件下得到的，并且产量增加不是由于抗胁迫性增加。
在结构上，SnRK2蛋白质是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其具有归为SMART数据库中的S_TKc类型(SMART登录号SM00220)的催化结构域。活性位点对应PROSITE特征，PS00108(Prosite，Swiss Institute ofBioinformatics，http://us.expasy.org)[LIVMFYC]-x-[HY]-x-D-[LIVMFY]-K-x(2)-N-[LIVMFYCT](3)。C端部分包含未知功能的一段聚(Glu和/或Asp)残基。
本发明的一个实施方案提供了改良植物生长特性的方法，其包括在植物中增加SnRK2多肽或其同源物的活性和/或表达，以及任选选择具有改良生长特性的植物。
有利的，实施本发明的方法得到了具有多种改良生长特性的植物，如改良的生长、改良的产量、改良的生物量、改良的构造或改良的细胞分裂，每种都是相对于对应的野生型植物。优选的，改良的生长特性至少包括比对应的野生型植物增加的产量。优选的，增加的产量是增加的生物量和/或增加的种子产量，包括下列一种或多种增加的(饱满)种子数，增加的种子总重量、增加的千粒重和增加的收获指数。要注意的是产量增加不是由于抗胁迫性增加。
本文所定义的术语“增加的产量”意指分别相对于对应的野生型植物，如下任何一个或多个方面的增加(i)植物的一个或多个部分增加的生物量(重量)，特别是地上(可收获)部分、增加的根生物量或任何其他可收获部分的增加的生物量；(ii)增加的总种子产量，其包括种子生物量(种子重量)的增加并且其可以是每株植物种子重量的增加或单个种子基础上的增加；(iii)增加的(饱满)种子数；(iv)增加的种子尺寸；(v)增加的种子体积；(vi)增加的单个种子面积；(vii)增加的单个种子长度；(viii)增加的收获指数，它表示为可收获部分如种子的产量对总生物量的比例；(ix)每个圆锥花序小花增加的数量，其从所计数的种子总数以及初级圆锥花序的数量推论出来；以及(x)增加的千粒重(TKW)，其从所计的饱满种子数和它们的总重量推论出来。增加的TKW可源于增加的种子尺寸(长度、宽度或其二者)和/或种子重量。增加的TKW可源于胚胎尺寸和/或胚乳尺寸的增加。
以谷类为例，产量增加可以表现为下列一种或多种每公顷或英亩植物数量增加、每株植物穗数量的增加、畦数、每畦种子数、粒重、TKW、穗的长度/直径的增加等。以稻为例，产量增加可以表现为下列一种或多种的增加每公顷或英亩植物数量、每株植物的圆锥花序数量、每个圆锥花序的小穗数量、每个圆锥花序花的数量，种子饱满率的增加、TKW的增加等。产量的增加还可产生改变的构造或可以作为改变的构造的结果发生。
优选的，实施本发明的方法使得植物具有增加的产量，更具体的，具有增加的生物量和/或增加的种子产量。优选的，增加的种子产量包含分别相对于对照植物，在下列一种或多种中的增加(饱满)种子数、总种子重量、种子尺寸、千粒重和收获指数。因此，本发明提供了增加植物产量的方法，该方法包括在植物中增加SnRK2多肽或其同源物的活性和/或表达。
由于根据本发明的改良植物具有增加的产量，因此，相对于在其生活周期对应阶段的相应野生型植物的生长速度，这些植物很可能表现出增加的生长速度(至少是在其生活周期的一部分)。生长速度增加可以是对植物的一个或多个部分或细胞类型(包括种子)特异性的，或者可以基本遍布整株植物。具有增加的生长速度的植物可以具有更短的生活周期。植物的生活周期意指从干的成熟种子生长到植物产生干的成熟种子(类似于起始物质)的阶段所需的时间。此生活周期可以受到如早期活力、生长速度、开花时间和种子成熟速度等因素的影响。生长速度的增加可以发生在植物生活周期的一个或多个阶段或者基本遍布整个植物生活周期期间。在植物生活周期的早期阶段增加的生长速度反映了增强的活力。生长速度的增加可以改变植物的收获周期，这使得植物可以比可能的情形更晚播种和/或更早收获。如果生长速度充分增加，可以允许播种相同植物物种的更多种子(例如在播种和收获稻植物后，接着播种和收获更多的稻植物，所有这些都在一个常规生长期内)。类似的，如果生长速度充分增加，可以允许播种不同植物物种的更多种子(例如在播种和收获稻植物后，例如接着播种和任选收获大豆、马铃薯或任何其他适当的植物)。在一些植物的情形下，从同一根状茎收获多次也是可能的。改变植物的收获周期可以使得每英亩每年生物量的产出增加(由于任何特定植物可以生长和收获次数(指在一年中)的增加)。生长速度的增加还使得转基因植物可以比它们的野生型对应物在更广的地域栽培，这是因为生长作物的区域性限制通常决定于种植时(初期)或收获时(晚期)的不利环境条件。如果收获周期缩短，那么可以避免此类不利条件。可以通过生长实验测绘生长曲线，得到多个参数来确定生长速度，此类参数可以是T-Mid(植物达到其最大尺寸的50％时所用的时间)以及T-90(植物达到其最大尺寸的90％时所用的时间)等。
本发明方法的实施提供了具有增加的生长速度的植物。因此，本发明提供了增加植物生长速度的方法，该方法包括在植物中增加SnRK2多肽或其同源物的活性和/或表达。
与对照植物相比，无论植物是否在无胁迫条件下或植物是否接触多种胁迫，产生产量和/或生长速度的增加。植物一般通过生长更加缓慢来应答所接触的胁迫。在严重的胁迫条件下，植物甚至完全停止生长。另一方面，本文将中等胁迫定义为植物所接触的不引起植物完全停止生长且没有能力恢复生长的任何胁迫。根据农业实践(灌溉、施肥、杀虫剂处理)的发展，在栽培的作物植物中通常不会遇到严重胁迫。因而，中等胁迫诱导的受损生长通常是农业所不希望的特征。中等胁迫是植物所接触的典型胁迫。这些胁迫可以是植物所接触的日常生物和/或非生物(环境)胁迫。典型的非生物或环境胁迫包括由反常的热或寒冷/冻结温度引起的温度胁迫；盐胁迫；水胁迫(干旱或过量的水)。非生物胁迫还可以由化学制剂引起。生物胁迫通常是那些由病原体，如细菌、病毒、真菌和昆虫引起的胁迫。
在任何植物中可以有利地改良上述生长特性。
本文所用的术语“植物”包括整株植物、植物的祖代和后代以及部分植物，包括种子、枝条、茎、叶、根(包括块茎)、花，以及组织和器官，其中前述每种包括目的基因/核酸，或在目的基因/核酸中的遗传修饰。术语“植物”还包括植物细胞、悬浮培养物、愈伤组织、胚胎、分生组织区、配子体、孢子体、花粉和小孢子，同样的，其中每种前述包含目的基因/核酸。
尤其可用于本发明方法中的植物包括藻类、蕨类植物以及属于植物界(Viridiplantae)超家族的所有植物，尤其是单子叶植物和双子叶植物，包括选自如下物种的饲料或饲料豆科植物、观赏植物、粮食作物、乔木或灌木秋葵属物种(Abelmoschus spp.)、槭树属物种(Acer spp.)、猕猴桃属物种(Actinidia spp.)、冰草属物种(Agropyron spp.)、葱芹属物种(Allium spp.)、苋属物种(Amaranthus spp.)、凤梨(Ananas comosus)、番荔枝属物种(Annona spp.)、芹菜(Apium graveolens)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、落花生属物种(Arachis spp.)、木波罗属物种(Artocarpus spp.)、石刁柏(Asparagus officinalis)、燕麦(Avenasativa)、阳桃(Averrhoa carambola)、冬瓜(Benincasa hispida)、巴西栗(Bertholletia excelsea)、甜菜(Beta vulgaris)、芸苔属物种(Brassicaspp.)、Cadaba farinosa、大叶茶(Camellia sinensis)、美人蕉(Cannaindica)、辣椒属物种(Capsicum spp.)、番木瓜(Carica papaya)、大果假虎刺(Carissa macrocarpa)、红花(Carthamus tinctorius)、山核桃属物种(Carya spp.)、栗属物种(Castanea spp.)、苦苣(Cichoriumendivia)、樟属物种(Cinnamomum spp.)、西瓜(Citrullus lanatus)、柑橘属物种(Citrus spp.)、椰子属物种(Cocos spp.)、咖啡属物种(Coffeaspp.)、Cola spp.、芋(Colocasia esculenta)、榛属物种(Corylus spp.)、山楂属物种(Crataegus spp.)、香瓜属物种(Cucumis spp.)、南瓜属物种(Cucurbita spp.)、菜蓟属物种(Cynara spp.)、胡萝卜(Daucuscarota)、山马蟥属物种(Desmodium spp.)、龙眼(Dimocarpus longan)、薯蓣属物种(Dioscorea spp.)、柿树属物种(Diospyros spp.)、稗属物种(Echinochloa spp.)、穇子(Eleusine coracana)、枇杷(Eriobotryajaponica)、红仔果(Eugenia uniflora)、荞麦属物种(Fagopyrum spp.)、山毛榉属物种(Fagus spp.)、无花果(Ficus carica)、金桔属物种(Fortunella spp.)、草莓属物种(Fragaria spp.)、银杏(Ginkgo biloba)、大豆属物种(Glycine spp.)、陆地棉(Gossypium hirsutum)、向日葵属物种(Helianthus spp.)、木槿属物种(Hibiscus spp.)、大麦属物种(Hordeum spp.)、甘薯(Ipomoea batatas)、核桃属物种(Juglans spp.)、莴苣(Lactuca sativa)、山黧豆属物种(Lathyrus spp.)、浮萍属物种(Lemna spp.)、兵豆(Lens culinaris)、亚麻(Linum usitatissimum)、荔枝(Litchi chinensis)、百脉根属物种(Lotus spp.)、棱角丝瓜(Luffaacutangula)、羽扇豆属物种(Lupinus spp.)、硬皮豆属物种(Macrotylomaspp.)、西印度樱桃(Malpighia emarginata)、苹果属物种(Malus spp.)、曼密苹果(Mammea americana)、芒果(Mangifera indica)、木薯属物种(Manihot spp.)、人心果(Manilkara zapota)、紫苜蓿、草木樨属物种(Melilotus spp.)、薄荷属物种(Mentha spp.)、苦瓜属物种(Momordicaspp.)、黑桑(Morus nigra)、芭蕉属物种(Musa spp.)、烟草属物种(Nicotianum spp.)、木犀榄属物种(Olea spp.)、仙人掌属物种(Opuntiaspp.)、Ornithopus spp.、稻属物种(Oryza spp.)、稷(Panicummiliaceum)、鸡蛋果(Passiflora edulis)、欧防风(Pastinaca sativa)、鳄梨属物种(Persea spp.)、香芹(Petroselinum crispum)、菜豆属物种(Phaseolus spp.)、刺葵属物种(Phoenix spp.)、酸浆属物种(Physalisspp.)、松属物种(Pinus spp.)、阿月浑子(Pistacia vera)、豌豆属物种(Pisum spp.)、早熟禾属物种(Poa spp.)、杨属物种(Populus spp.)、牧豆树属物种(Prosopis spp.)、李属物种(Prunus spp.)、番石榴属物种(Psidium spp.)、石榴(Punica granatum)、西洋梨(Pyrus communis)、栎属物种(Quercus spp.)、萝卜(Raphanus sativus)、波叶大黄(Rheumrhabarbarum)、茶藨子属物种(Ribes spp.)、悬钩子属物种(Rubus spp.)、甘蔗属物种(Saccharum spp.)、接骨木属物种(Sambucus spp.)、黑麦(Secale cereale)、Sesamum spp.、茄属物种(Solanum spp.)、两色蜀黍(Sorghum bicolor)、菠菜属物种(Spinacia spp.)、蒲桃属物种(Syzygium spp.)、酸豆(Tamarindus indica)、可可树(Theobromacacao)、车轴草属物种(Trifolium spp.)、Triticosecale rimpaui、小麦属物种(Triticum spp.)、越桔属物种(Vaccinium spp.)、野豌豆属物种(Viciaspp.)、豇豆属物种(Vigna spp.)、葡萄属物种(Vitis spp.)、玉蜀黍(Zeamays)、北美洲野生稻(Zizania palustris)、枣属物种(Ziziphus spp.)等。
根据本发明优选的特征，植物是包含大豆、向日葵、油菜、苜蓿、油菜籽或棉花的作物植物。更优选的，本发明的植物是单子叶植物，如甘蔗。最优选的是谷类，如稻、玉米、小麦、粟、大麦、黑麦、燕麦或高粱。
可以通过增加SnRK2多肽的水平来增加SnRK2蛋白质的活性。可选的，当SnRK2水平没有变化或者甚至是当SnRK2水平减少时，活性也可以增加。当多肽的内部性质改变时，例如通过产生突变体或选择比野生型更有活性的变体，可以发生这种情况。
本文所定义的术语“SnRK2或其同源物”意指多肽，其包含(i)功能性丝氨酸/苏氨酸激酶结构域，(ii)保守性特征序列W(F/Y)(L/M/R/T)(K/R)(N/G/R)(L/P/I)(P/L)(A/G/V/R/K/I)(D/E/V)(SEQ IDNO6)和(iii)起始于SEQ ID NO6的末尾残基的酸性C端结构域。“SnRK2或其同源物”与SEQ ID NO2所代表的氨基酸具有一定的全序列同一性的多肽，所述全序列同一性按照增加的优选顺序为至少55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的全序列同一性。使用总体对比算法，如程序GAP(GCG Wisconsin Package，Accelrys)中的Needleman Wunsch算法，确定全序列同一性。
此外，与对应的野生型植物相比，当在稻(Oryza sativa)栽培种Nipponbare的GOS2启动子调控下表达时，此类“SnRK2或其同源物”增加地上的生物量和/或种子产量。种子产量的这种增加可以以一些方式测量，例如为千粒重的增加。
使用特型数据库可以鉴别SnRK2蛋白质中的多种结构域，所述的数据库如SMART(Schultz等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95，5857-5864；Letuni等人(2002)Nucleic Acids Res 30，242-244；http://smart.embl-heidelberg.de/)、InterPro(Mulder等人，(2003)Nucl.Acids.Res.31，315-318；http://www.ebi.ac.uk/interpro/)、Prosite(Bucher和Bairoch(1994)，A generalized profile syntax for biomolecular sequencesmotifs and its function in automatic sequence interpretation.(In)ISMB-94；Proceedings 2nd International Conference on Intelligent Systems forMolecular Biology.Altman R.，Brutlag D.，Karp P.，Lathrop R.，Searls D.，编著，53-61页，AAAI出版，Menlo Park；Hulo等人，Nucl.Acids.Res.32D134-D137，(2004)，http://www.expasy.org/prosite/)或Pfam(Bateman等人，Nucleic Acids Research 30(1)276-280(2002)，http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/)。
SnRK2的激酶结构域是S_TKc类型(SMART登录号SM00221，Interpro登录号IPR002290)，并且当其具有Ser/Thr激酶活性时是有功能的。预测的活性位点(ICHRDLKLENTLL，其中D是预测的催化残基)对应着PROSITE特征PS00108。ATP结合位点(IGAGNFGVARLMKVKNSKELVAMK)对应着PROSITE特征PS00107。
优选的，SEQ ID NO6的保守性特征序列具有序列W(F/Y)(L/M/R)K(N/R)(L/I)P(A/G/V/R/K/I)(D/E)，SEQ ID NO6的保守性特征序列更优选具有序列W(F/Y)LKNLP(R/K)E；SEQ ID NO6的保守性特征序列最优选具有序列WFLKNLPRE。
本文所用的酸性C端结构域定义为SnRK2蛋白质的C端部分，其起始于如上定义的保守性特征序列的末尾残基(SEQ ID NO6中的D或E)，并且该C端部分具有的等电点(pI)在2.6和4.1之间，优选在3.6和3.9之间，酸性C端结构域的pI最优选是3.7。使用EMBOSS包(Rice等人，Trendsin Genetics 16，276-277，2000)计算pI值。
搜索和鉴定SnRK2同源物的方法是本领域的技术人员所熟悉了解的。此类方法包括使用本领域熟知的用于比对或比较序列的算法，如GAP(Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48；443-453(1970))、BESTFIT(使用Smith和Waterman(Advances in Applied Mathematics 2；482-489(1981))的局部同源性算法)、BLAST(Altschul，S.F.，Gish，W.，Miller，W.，Myers，E.W.& Lipman，D.J.，J.Mol.Biol.215403-410(1990))、FASTA和TFASTA(W.R.Pearson和D.J.Lipman Proc.Natl.Acad.Sci.USA 852444-2448(1988))，比较计算机可读形式的SEQ ID NO 1或2代表的序列和在公共数据库如MIPS(http://mips.gsf.de/)、GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html)或EMBL Nucleotide Sequence Database(http://www.ebi.ac.uk/embl/index.html)中获得的序列。进行BLAST分析的软件通过National Centre for Biotechnology Information(NCBI)公开可用。下面提到的同源物是使用BLAST默认参数(BLOSUM62矩阵，空位开放罚分为11且空位延伸罚分为1)鉴定出的，优选使用全长序列用于分析。
落入“SnRK2多肽或其同源物”定义中的实例包括拟南芥蛋白质和来自其他物种如稻、大豆和烟草的蛋白质。
同源性的两种特殊形式，直系同源和旁系同源是用来描述基因遗传关系的进化概念。术语“旁系同源”涉及某物种基因组内的一个或多个基因复制产生的同源基因。术语“直系同源”涉及根据这些基因的遗传关系在不同的生物中的同源基因。
可以通过对一组来自与查询序列相同物种的序列进行BLAST分析，可容易的鉴定SnRK2多肽的旁系同源物。例如，单子叶植物物种中的直向同源物可以通过实施所谓的交互blast搜索很容易地找到。这可以通过第一次blast完成，其包括在任何序列数据库如可在http://www.ncbi.nlm.nih.gov中找到的公众可用的NCBI数据库中，对所讨论的序列(例如SEQ ID NO1或SEQ ID NO2，来自拟南芥(Arabidopsisthaliana))进行blast。如果寻找的是稻的直系同源物，所讨论的序列将再次与例如来自NCBI上可用的稻Nipponbare的28,469的全长cDNA克隆进行blast。当起始于核苷酸时可以使用BLASTn或tBLASTX，或者当起始于蛋白质时可以使用BLASTP或TBLASTN，并使用标准缺省值。可以过滤blast结果。之后将过滤结果或未过滤结果的全长序列与所讨论的序列所来源生物(有时是拟南芥)的序列进行反向blast(第二次blast)。然后对第一次和第二次blast的结果进行比较。当第二次blast的结果与查询SnRK2核酸或SnRK2多肽具有最高相似性时，就找到了直系同源物。如果对于具体的查询序列，最符合的是SnRK2的旁系同源物，那么此类查询序列也认为是SnRK2的同源物，倘若此同源物包含如上所定义的功能性丝氨酸/苏氨酸激酶结构域、SEQ ID NO6的保守性特征序列和酸性C端区域。在大家族的情况下，可以使用ClustalW，接着使用相邻连接树以帮助观察聚类(clustering)本文所用的术语“同源物”还包括可用于本发明方法中的蛋白质的旁系同源物和直系同源物。来自拟南芥的旁系同源物包括下列基因文库登录号所给出的蛋白质NP_172563、NP_849834(SEQ ID NO8)、NP_201170(SEQ ID NO10)、NP_196476(SEQ ID NO12)、NP_567945(SEQ ID NO14)、NP_179885(SEQ ID NO16)、NP_201489(SEQ ID NO18)、NP_974170(SEQ ID NO20)、NP_190619(SEQ ID NO22)、NP_195711(SEQ ID NO24)。使用交互BLAST方法鉴定了来自稻的直系同源物和旁系同源物(包括基因文库登录号BAD17997(SEQ ID NO26)、BAD17998(SEQ ID NO28)、BAD17999(SEQ ID NO30)、BAD18000(SEQ ID NO32)、BAD18001(SEQ ID NO34)、BAD18002(SEQ ID NO36)、BAD18003(SEQ ID NO38)、BAD18004(SEQ ID NO40)、BAD18005(SEQ ID NO42)、BAD18006(SEQ ID NO44))、来自油菜(B.napus)的直系同源物和旁系同源物(AAA33003(SEQ ID NO46)和AAA33004(SEQ ID NO48))、来自大豆的直系同源物和旁系同源物(AAB68961(SEQ ID NO50)和AAB68962(SEQ ID NO52))和来自烟草的直系同源物和旁系同源物(AAL89456(SEQ ID NO54))。可用于本发明的直系同源物和旁系同源物优选具有和SnRK2相同的结构和活性，并且在交互BLAST搜索中与SEQID NO2所代表的SnRK2具有最高的相似性。
应当理解的是术语SnRK2多肽或其同源物不限于SEQ ID NO2所代表的序列，也不限于上面列出的同源物，而是符合下列标准的任何多肽都适合用在本发明的方法中包含如上所定义的功能性丝氨酸/苏氨酸激酶结构域，以及SEQ ID NO6的保守性特征序列和C端酸性结构域，和/或是SnRK2的旁系同源物或直系同源物或与SEQ ID NO2的序列具有至少55％的序列同一性。
为了确定SnRK2的激酶活性，一些测定是可用的并且在本领域中众所周知(例如Current Protocols in Molecular Biology，1和2卷，Ausubel等人(1994)，Current Protocols；或者是在线的，例如http://www.protocol-online.org)。
简要的，激酶测定通常包括(1)使激酶蛋白质接触含有待磷酸化的靶位点的底物多肽；(2)在适当的条件下，在适当的激酶缓冲液中进行靶位点的磷酸化；(3)在恰当的反应期后将磷酸化的产物从未磷酸化的底物中分离出来。激酶活性的存在或缺乏是通过磷酸化的靶标的存在或缺乏来确定的。另外，可以进行定量测量。
纯化的SnRK2蛋白质，或者含有或富含SnRK2蛋白质的细胞提取物可以用作激酶蛋白质的来源。作为底物，小肽是尤其适合的。肽在磷酸化位点基序中必须含有一个或多个丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基。可以在Biochimica et Biophysica Acta 1314，191-225，(1996)中找到磷酸化位点的汇编。此外，肽底物可以优选具有净正电荷，以利于结合到磷酸纤维素滤器上(可用于将磷酸化的肽从未磷酸化的肽中分离出来并且检测磷酸化的肽)。如果不知道磷酸化位点基序，可以使用常规酪氨酸激酶底物。例如，“Src相关肽”(RRLIEDAEYAARG)是许多受体和非受体酪氨酸激酶的底物。为了确定合成肽磷酸化的动力参数，要求肽浓度的范围。对于起始反应，要使用0.7-1.5mM的肽浓度。
对于每种激酶，重要的是要确定活性的最佳缓冲液、离子强度和pH。标准5×激酶缓冲液通常含有5mg/ml BSA(防止激酶对测定管吸附的牛血清蛋白)、150mM Tris-Cl(pH7.5)、100mM MgCl2。绝大部分酪氨酸激酶需要二价阳离子，尽管一些酪氨酸激酶(例如胰岛素-、IGF-1-和PDGF受体激酶)需要MnCl2替代MgCl2(或除了MgCl2外还需要MnCl2)。要根据经验为每种蛋白激酶确定二价阳离子的最佳浓度。
常用的磷酰基(phophoryl)基团供体是放射性标记的[γ-32P]ATP(通常是0.2mM终浓度)。在肽中混合的32p可以通过在闪烁计数器中的硝化纤维素干垫上测量活性来确定。
可选的，SnRK2蛋白质或其同源物的活性可以通过在稻栽培种Nipponbare中，在GOS2启动子调控下表达SnRK2蛋白质或其同源物来测定，这使得植物比相应的野生型植物具有增加的地上生物量和/或增加的种子产量。可以以一些方式测量种子产量的这种增加，例如按照千粒重的增加。
SnRK2多肽或其同源物的编码核酸可以是任何天然或合成核酸。如本文所定义的SnRK2多肽或其同源物是由SnRK2核酸分子编码的。因此本文定义的术语“SnRK2核酸分子”或“SnRK2基因”是如上所定义的SnRK2多肽或其同源物的任何编码核酸分子。SnRK2核酸分子的实例包括由SEQID NO1所代表的那些核酸，以及编码上述同源物的那些核酸。SnRK2核酸及其功能性变体可适用于进行本发明的方法。SnRK2核酸的功能性变体包括部分SnRK2核酸分子和/或能够与SnRK2核酸分子杂交的核酸。在功能性变体的范围中，术语“功能性”指的是编码这种多肽的变体SnRK2核酸(即一部分或杂交序列)，所述的多肽包含如上所定义的功能性激酶结构域、SEQ ID NO6的保守性特征序列和酸性C端结构域。
植物中SnRK2型激酶具有模块结构，其由激酶结构域和酸性富含E和/或D结构域组成。因此，设想以保留或改变SnRK2蛋白质活性的这种方式改造激酶和/或酸性结构域可用于实施本发明的方法。优选的变体包括结构域缺失、堆积或改组产生的那些(参见例如He等人，Science 288，2360-2363，2000，或美国专利5,811,238和6,395,547)。
本文定义的术语部分指的是一段至少包含700个核苷酸的DNA，并且该部分包含如上所定义的功能性激酶结构域、SEQ ID NO6的保守性特征序列和酸性C端结构域。例如，可以通过对SnRK2核酸制造一个或多个缺失来制备部分。部分可以以分离的形式使用或者例如，它们可以融合到其他编码(或非编码)序列以产生组合了一些活性(它们中的一种是蛋白激酶活性)的蛋白质。当融合到其他编码序列时，由翻译产生得到的多肽要比所SnRK2片段预测的多肽大。可用于本发明方法的部分至少包含如上所定义的功能性激酶结构域、SEQ ID NO6的保守性特征序列和酸性C端结构域。功能性部分可以是SEQ ID NO7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51和53中任一项所代表的核酸的一部分。优选的，功能性部分是由SEQ ID NO1所代表的核酸的一部分。
本文所定义的术语“杂交”是基本同源的互补核苷酸序列相互退火的过程。杂交过程可以完全发生在溶液中，即互补核酸都在溶液中。杂交过程还可以如此进行，即其中互补核酸之一固定于基质如磁珠、琼脂糖珠子或任何其他树脂上。此外杂交过程可还可以如此进行，即其中互补核酸之一固定于固相支持物如硝化纤维素膜或尼龙膜上，或通过例如照相平版印刷术固定到例如硅酸玻璃支持物上(后者称之为核酸阵列或微阵列，或称之为核酸芯片)。为了使得杂交发生，通常使核酸分子热变性或化学变性，以使双链解链成两条单链和/或从单链核酸中除去发夹或其他二级结构。杂交的严格性受诸如温度、盐浓度和杂交缓冲液组成等条件的影响。
在诸如Southern杂交和Northern杂交的核酸杂交实验中，“严格杂交条件”和“严格杂交洗涤条件”是序列依赖性的，并且随环境参数而不同。本领域技术人员认识到在杂交和洗涤中可以改变多种参数，并且所述变化将保持或改变严格条件。
Tm是在确定的离子强度和pH下，50％的靶标序列与完全匹配的探针杂交时的温度。Tm依赖于溶液条件、碱基组成以及探针的长度。例如，较长的序列在较高温度下特异杂交。杂交的最大速率是在Tm低于大约16℃到32℃下得到的。杂交溶液中一价阳离子的存在降低了两条核酸链之间的静电排斥，从而促进杂交体的形成；对于高达0.4M的钠浓度，这个作用是明显的。甲酰胺降低了DNA-DNA和DNA-RNA双链体的解链温度，每百分数甲酰胺降低0.6至0.7℃，加入50％的甲酰胺虽然使杂交速率降低，但使杂交在30至45℃进行。碱基对错配降低了杂交速率和双链体的热稳定性。一般对于大探针，每％碱基错配使Tm降低大约1℃。取决于杂交体的类型，Tm可以使用下列公式计算·DNA-DNA杂交体(Meinkoth和Wahl，Anal.Biochem.，138267-284，1984)Tm＝81.5℃+16.6×log[Na+]a+0.41×％[G/Cb]-500×[Lc]-1-0.61×％甲酰胺·DNA-RNA或RNA-RNA杂交体Tm＝79.8+18.5(log10[Na+]a)+0.58(％G/Cb)+11.8(％G/Cb)2-820/Lc·寡-DNA或寡-RNAd杂交体对于＜20个核苷酸Tm＝2(ln)对于20-35个核苷酸Tm＝22+1.46(ln)a或对于其他一价阳离子，但是仅仅在0.01-0.4 M的范围精确。
b仅仅对30％至75％范围的％GC精确。
cL＝双链体中碱基对的长度。
d寡，寡核苷酸；ln，引物的有效长度＝2×(G/C数目)+(A/T数目)。
注解对于每1％甲酰胺，Tm降低大约0.6至0.7℃，而6M尿素的存在降低Tm大约30℃。
杂交的特异性通常是后杂交洗涤的作用。为了移除非特异性杂交产生的背景，用稀释的盐溶液洗涤样品。此类洗涤的关键因素包括最终洗涤溶液的离子强度和温度盐浓度越低以及洗涤温度越高，洗涤的严格性越高。洗涤条件通常在杂交严格性或低于杂交严格性下进行。总体上，对于核酸杂交测定或基因扩增检测方法恰当的严格条件如上述说明。也可以选择差不多的严格条件。总体上，低严格条件选择是大约比在确定的离子强度和pH下特异性序列的热解链温度(Tm)低50℃。中等严格条件是当温度比Tm低20℃时并且高严格条件时当温度比Tm低10℃时。例如，严格条件是那些至少与例如条件A-L一样严格的条件；并且减少的严格条件是至少与例如条件M-R一样严格的条件。非特异性的结合可以使用任意一种的一些已知技术(例如用含有溶液的蛋白质将膜封闭，添加异源的RNA、DNA和SDS到杂交缓冲液中，以及用RNA酶处理)来调控。
杂交和洗涤条件的实例在表1中列出表1
“杂交体长度”是杂交核酸的预期长度。当已知序列的核酸杂交时，可以通过比对序列和鉴别本文所述的保守区来确定杂交体长度。
杂交和洗脱缓冲液中可以用SSPE(1×SSPE是0.15M NaCl、10mM NaH2PO4和1.25mM EDTA，pH7.4)代替SSC(1×SSC是0.15MNaCl和15mM柠檬酸钠)；在杂交完成后洗脱15分钟。杂交和洗脱可以另外地包括5×Denhardt试剂、0.5-1.0％ SDS、100μg/ml变性的片段化的鲑精DNA、0.5％焦磷酸钠和高速50％甲酰胺。
*Tb-Tr对于预期长度少于50个碱基对的杂交体，杂交温度应该比杂交体的熔解温度Tm低5-10℃，根据上述公式确定Tm。
±本发明还包括用PNA或修饰的核酸取代任意一个或多个DNA或RNA杂交体配偶体。
为了定义严格性水平的目的，通常参考Sambrook等人(2001)Molecular Cloninga laboratory manual，第3版，Cold Spring HarborLaboratory Press，CSH，New York or to Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)。
例如，编码SEQ ID NO2或其同源物的核酸可以用在杂交实验中。可选的，其片段可以用作探针。根据鉴别SnRK2蛋白质的序列原料库，可以选择不同的杂交片段。例如，当需要有限数量的与SnRK2具有高序列同一性的同源物时，可以使用保守性较低的片段用于杂交。通过比对SEQID NO2及其同源物，可以设计可用作杂交探针的相当的核酸片段。
在杂交和洗涤后，依赖于探针标记的类型，可以通过放射自显影(当使用放射性探针时)或者通过化学发光、免疫检测、通过荧光或显色检测来检测双链体。可选的，可以进行核糖核酸酶保护试验来检测RNA:RNA杂交体。
SnRK2核酸分子或其功能性变体可以来自任何天然来源或人工来源。可以从微生物来源如细茵、酵母或真菌，或者从植物、藻类或动物(包括人)来源中分离核酸/基因或其功能性变体。可以通过严谨的人工操作在组成和/或基因组环境方面从其天然形式对核酸进行修饰。核酸优选是植物来源的，可以是来自相同的植物物种(例如来自其待引入的植物物种)或来自不同的植物物种。核酸可以分离自双子叶物种，优选的分离自十字花科(Brassicaceae)，更优选的分离自拟南芥。更优选的，分离自拟南芥的SnRK2是SEQ ID NO1所代表的并且SnRK2氨基酸序列是SEQ ID NO2所代表的。
SnRK2多肽或其同源物可以由SnRK2核酸分子或基因的可选的剪接变体编码。本文所用的术语“可选择的剪接变体”涵盖这样的核酸序列变体，即其中选定的内含子和/或外显子已经切除、置换或添加。这样的变体是其中上述蛋白质的生物学活性保持未受影响的那些变体，其可以通过选择性的保留蛋白质的功能片段来获得。此类剪接变体可以是天然发现的或人造的。制备此类剪接变体的方法是本领域熟知的。优选的剪接变体是来自SEQ ID NO3所代表的核酸的所有剪接变体，如SEQ ID NO1。更优选的剪接变体编码此类多肽，所述多肽具有如上所定义的SEQ ID NO6的保守性特征序列侧翼的功能性激酶结构域和C端酸性结构域。
同源物也可以由SnRK2多肽或其同源物的编码核酸的等位变体编码，优选由SEQ ID NO1所代表的核酸的等位变体编码。更优选的，由等位变体编码的多肽具有如上所定义的SEQ ID NO6的保守性特征序列侧翼的功能性激酶结构域和C端酸性结构域。等位变体天然存在，并且包括在本发明方法中的是这些天然等位基因的用途。等位变体包括单核苷酸多态性(SNP)以及小的插入/缺失多态性(INDEL)。INDEL的大小通常小于100bp。在大多数生物天然存在的多态性品系中SNP和INDEL形成了最大的一类序列变体。
可以通过以引入遗传修饰(优选在SnRK2基因的基因座中)来增加SnRK2多肽或其同源物的活性和/或表达。如本文中所定义的基因的基因座意指包括目的基因和编码区域上游或下游10kb的基因组区域。
例如，遗传修饰可以通过以下的任何一种(或多种)方法引入TDNA激活、TILLING、定点诱变、同源重组、定向进化或者通过在植物中引入和表达编码SnRK2多肽或其同源物的核酸。在引入遗传修饰后，接下来的步骤是选择SnRK2多肽增加的活性和/或表达，这种活性和/或表达的增加使得植物具有改良的生长特性。
T-DNA激活特征(Hayashi等人Science 258，1350-1353，1992)涉及在目标基因的基因组区域或基因编码区域上游或下游10KB中插入通常包含启动子(也可以是翻译增强子或内含子)的T-DNA，如此构型以便启动子指引靶基因表达。通常，破坏靶基因天然启动子对其的表达调控，而使该基因处于新引入的启动子的控制之下。该启动子一般嵌入到T-DNA中。例如，T-DNA通过农杆菌属感染随机插入到植物基因组中，并导致靠近该插入T-DNA的基因过量表达。由于接近引入的启动子的基因过量表达，所得的转基因植物显示出显性表型。待引入的启动子可以是能指导基因在所需的生物体(在本案中为植物)中表达的任何启动子。例如，组成型、组织偏好的、细胞类型偏好的以及诱导型启动子都适合用于T-DNA激活。
也可以使用TILLING技术(靶向诱导基因组局部损害技术)，把遗传修饰引入到SnRK2基因的基因座中。这是一种诱变技术，可用于产生和/或鉴定，并分离能显示SnRK2活性的SnRK2核酸分子的诱变变体。TILLING还能够选择携带这类突变变体的植物。这些突变变体甚至可表现出比该基因的天然形式所表现出的更高的SnRK2活性。TILLNG将高密度诱变与高通量筛选方法结合起来。TILLING一般遵循的步骤是(a)EMS诱变(Redei和Koncz(1992)，InC Koncz，N-H Chua，J Schell编著，Methods inArabidopsis Research.World Scientific，Singapore，16-82页；Feldmann等人，(1994)InEM Meyerowitz，CR Somerville编著，Arabidopsis.ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，137-172页；Lightner和Caspar(1998)，InJ Martinez-Zapater，J Salinas编著，Methodson Molecular Biology，82卷，Humana Press，Totowa，NJ，91-104页)；(b)DNA制备和个体合并；(c)目标区域的PCR扩增；(d)变性和退火以允许形成异源双链体；(e)DHPLC，其中库中异源双链体的存在检测为色谱图中额外的峰值；(f)鉴定突变个体；和(g)突变PCR产物的测序。TILLING的方法是本领域熟知的(McCallum Nature Biotechnol.18，455-457，2000，Stemple Nature Rev.Genet.5，145-150，2004)。
定点诱变可用于产生保留了活性(即蛋白激酶活性)的SnRK2核酸或其部分的变体。一些方法可用来实现定点诱变，最常用方法是基于PCR的方法(见例如Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology.Wiley编著，http://www.4ulr.com/products/currentprotocols/index.html)。
定向进化也可以用来产生具有上述增加的生物学活性的SnRK2多肽或同源物或其部分的编码SnRK2核酸分子的功能性变体。定向进化由下列组成DNA改组的重复，随后是适当的筛选和/或选择(Castle等人，(2004)Science 304(5674)1151-4；美国专利5,811,238和6,395,547)。
TDNA激活、TILLING、定点诱变和定向进化是能够产生保留了如上所述的SnRK2功能并因此可用于本发明方法中的新的SnRK2等位基因和功能性变体的技术的实例。
同源重组能够在基因组的指定选择位置引入选定的核酸。同源重组是生物学中通常使用的标准技术，用于较低等的生物体如酵母或苔藓physcomitrella。用于在植物中进行同源重组的方法不仅已在模式植物中描述(Offringa等人(1990)EMBO J.9，3077-3084)，而且在作物植物例如稻中描述(Terada等人，(2002)Nature Biotechnol.20，1030-1034；或Iida和Terada(2004)Curr.Opin.Biotechnol.15，132-138)。例如，待靶向的核酸(其可以是如上文所定义的SnRK2核酸分子或其功能性变体)不需要靶向到SnRK2基因的基因座中，但是可以被引入到高表达的区域。待靶向的核酸可以是改良的等位基因，用于替换内源基因，或另外引入到内源基因中。
根据本发明优选的实施方案，可以通过在植物中引入和表达编码SnRK2多肽或其同源物的核酸来改良植物的生长特性。
引入遗传修饰(在本案中不需要在SnRK2基因的基因座中)的优选方法是在植物中引入和表达编码SnRK2多肽或其同源物的核酸。上述SnRK2多肽或其同源物是具有激酶活性的一类，与SEQ ID NO2所代表的氨基酸序列具有一定的全序列同一性，所述全序列同一性按照增加的优选顺序为至少55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％，并且另外包含如上所定义的激酶结构域，SEQ ID NO6所代表的保守性特征序列和C端酸性结构域。
蛋白质的“同源物”涵盖相对于所讨论的未修饰蛋白质具有氨基酸取代、缺失和/或插入，且与其所衍生自的未修饰蛋白质具有相似的生物学活性和功能活性的肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶。
同源物可以是蛋白质“取代变体”的形式，即其中氨基酸序列中的至少一个残基已经被除去，并且不同的残基插入到它的位置上。氨基酸取代一般是单残基的，但是取决于对多肽构成的功能限制可以是成串的；插入片段通常是大约1到10个氨基酸残基。优选的，氨基酸取代包括保守性氨基酸取代(表2)。为了产生此类同源物，蛋白质的氨基酸可以被其他具有相似性质(如类似的疏水性、亲水性、抗原性、形成或破坏α-螺旋结构或β-折叠结构的倾向)的氨基酸所置换。保守性替换表是本领域所熟知的(见例如Creighton(1984)Proteins.W.H.Freeman and Company)。
表2保守性氨基酸取代的实例
在上述氨基酸性质不是很关键的情况下，可以产生保守性较低的取代。
同源物还可以是蛋白质的“插入变体”的形式，即将其中一个或多个氨基酸残基引入到蛋白质中的预定位点。插入可包括氨基端和/或羧基端融合，以及单个或多个氨基酸的序列内插入。通常，氨基酸序列内的插入将小于氨基或羧基端的融合，约为1到10个残基的数量。氨基或羧基端融合蛋白质或肽的实例包括如用于酵母双杂交系统的转录激活因子的结合结构域或激活结构域、噬菌体外壳蛋白、(组氨酸)6-标签、谷胱甘肽S-转移酶-标签、A蛋白、麦芽糖结合蛋白、二氢叶酸还原酶、Tag·100表位、c-myc表位、FLAG表位、lacZ、CMP(钙调蛋白结合肽)、HA表位、C蛋白表位和VSV表位。
蛋白质“缺失变体”形式的同源物的特征在于从蛋白质除去一个或多个氨基酸。
使用本领域熟知的肽合成技术，如固相肽合成等等，或通过重组DNA操作，可以很容易的制备蛋白质的氨基酸变体。对DNA序列进行操作以产生蛋白质的取代、插入或缺失变体的方法是本领域熟知的。例如，在DNA的预定位点产生突变的技术是本领域技术人员熟知的，包括M13诱变、T7-Gen体外诱变(USB，Cleveland，OH)、快速变换的定点诱变(Stratagene，San Diego，CA)、PCR-介导的定点诱变或其他定点诱变方案。
SnRK2多肽或其同源物可以是衍生物。“衍生物”包括肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶，与蛋白质天然存在形式的氨基酸序列相比，例如，如SEQID NO2所示的，其可以包括天然和非天然存在氨基酸残基的取代、缺失或添加。蛋白质的“衍生物”包括肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶，与多肽天然存在形式的氨基酸序列相比，其可以包括天然存在的改变的、糖基化的、酰基化的氨基酸残基或非天然存在的氨基酸残基。与其所衍生自的氨基酸序列相比，衍生物还可包括一个或多个非氨基酸取代基，例如与氨基酸序列共价或非共价结合的报道分子或其他配体，如结合以便于其检测的报道分子，以及相对于天然存在蛋白质的氨基酸序列而言非天然存在的氨基酸残基。
根据本发明优选的方面，希望增强或增加SnRK2核酸分子或其功能性变体的表达。得到基因或基因产物表达增强或增加的方法在本领域中详细记载并且包括例如用适当的启动子驱动的过量表达、转录增强子或翻译增强子的使用。可以将作用为启动子或增强子元件的分离的核酸引入至多核苷酸非异源形式的适当位置上(一般为上游)，从而上调SnRK2核酸或其功能性变体的表达。例如，可以通过突变、缺失和/或取代来体内改变内源启动子(参见Kmiec，美国专利5,565,350号；Zarling等人，PCT/US93/03868)，或者可以将分离的启动子以适当的方向和与本发明基因的距离引入植物细胞中，从而调控基因的表达。
如果希望多肽表达，通常需要在多核苷酸编码区的3’-端包含聚腺苷酸化作用区域。聚腺苷酸化作用区域可以来自天然基因、来自多种其他植物基因或来自T-DNA。待添加的3’端序列可以来自例如胭脂氨酸合成酶或章鱼碱合酶基因，或可选的来自其他植物基因，或较小优选的来自其他真核基因。
还可以将内含子序列添加到5’非翻译区或部分编码序列的编码序列以增加在细胞溶胶中聚集的成熟信息的量。已经表明在植物和动物表达构建体中的转录单位中包含可剪接的内含子能在mRNA和蛋白质水平上使基因表达增加达1000倍(Buchman和Berg，Mol.Cell Biol.8，4395-4405(1988)；Callis等人，Genes Dev.1，1183-1200(1987))。当将内含子置于转录单位的5’端附近时，基因表达的此类内含子增强通常是最大的。本领域已知玉米内含子Adh1-S内含子1、2和6，Bronze-1内含子的用途。总体上参见The Maize Handbook，116章，Freeling和Walbot编著，Springer，N.Y.(1994)。
本发明还提供了遗传构建体和载体，以便于引入和/或表达可用于本发明方法中的核苷酸序列。
因此，本发明提供了基因构建体，其包含(i)SnRK2核酸分子或其功能性变体(ii)能驱动(i)中核酸序列表达的一个或多个调控序列；及可选的
(iii)转录终止序列。
可用于本发明方法的构建体可以使用本领域技术人员熟知的重组DNA技术构建。基因构建体可插入到载体中，该载体可以是商购的，适于转化到植物中并适于在转化的细胞中表达目的基因。
植物使用包含目的序列(即SnRK2核酸或其功能性变体)的载体转化。目的序列与一个或多个调控序列(至少与启动子)有效连接。术语“调节元件”、“调控序列”和“启动子”在文中都可以互换使用，且应当取其广义，是指能影响与它们连接的序列表达的调节核酸序列。上述术语包括来源于经典真核生物基因组基因的转录调节序列(包括精确转录起始所需的TATA框，带或不带CCAAT框序列)以及根据发育和/或外界刺激，或以组织特异性方式改变基因表达的另外的调节元件(即上游激活序列、增强子和沉默子)。该术语还包括经典原核基因的转录调节序列，在这种情况下它可以包括-35框序列和/或-10框转录调节序列。术语“调节元件”也包括合成的融合分子或衍生物，其使得核酸分子能够在细胞、组织或器官中表达，激活或增强这种表达。如本文所用的术语“有效连接”指启动子序列与目的基因之间的功能性连接，使得启动子序列能起始目的基因的转录。
有利地，可以使用任何类型的启动子来驱动核酸序列的表达。启动子可以是诱导型启动子，即对发育、化学、环境或物理刺激应答而具有诱导的或增加的转录起始。作为胁迫诱导型启动子(即当植物接触多种胁迫条件时激活的启动子)的诱导型启动子的实例是水胁迫诱导型启动子WS118。另外的或可选的，启动子可以是组织特异性启动子，即能够优选的在特定组织如叶、根、种子组织等中起始转录的这种。种子特异性启动子的实例是稻油质蛋白18kDa启动子(Wu等人(1998)J Biochem 123(3)386-91)。
优选的，SnRK2核酸或其功能性变体有效连接到组成型启动子。本文所定义的术语“组成型”指的是在植物的至少一个组织或器官中显著性表达，以及在植物的任何生命阶段显著性表达的启动子。该启动子优选在整株植物中显著性表达。优选的，能够使核酸在整株植物中显著性表达的组成型启动子具有与GOS2启动子相当的表达模式。更优选的，组成型启动子具有与稻GOS2启动子相同的表达模式，最优选的，能有使核酸在整株植物中显著性表达的启动子是SEQ ID NO55代表的来自稻的GOS2启动子。要明确的是本发明的适用性并不限于由SEQ ID NO1所代表的SnRK2核酸，本发明的适用性也不限于由GOS2启动子所驱动的SnRK2核酸的表达。其他也可以用来驱动SnRK2核酸表达的组成型启动子的实例在下表3中显示。
表3组成型启动子的实例
任选的，一个或多个终止子序列也可引入植物的构建体中。术语“终止子”包括调控序列，其位于转录单位末端的DNA序列，标志初级转录本的3′加工和聚腺苷酸化以及转录的终止。其他调节元件可以包括转录增强子以及翻译增强子。本领域技术人员知晓适合用于实施本发明的终止子和增强子序列。此类序列是已知的，或本领域技术人员可以很容易的获得。
本发明的遗传构建体还可以包括在特定细胞类型中维持和/或复制所需要的复制原点序列。一个实例是需要遗传构建体在细菌细胞中作为附加型基因元件(如质粒或黏粒)维持的情况。优选的复制原点包括但不局限于f1-ori和colE1。
遗传构建体任选地可包含选择标记基因。如本文所用，术语“选择性标记基因”包括赋予表达该基因细胞表型，以便于鉴定和/或选择用本发明的核酸构建体转染或转化的细胞的任何基因。合适的标记可选自赋予抗生素或除草剂抗性的标记，其引入新的新陈代谢性状或允许可视选择。选择标记基因的实例包括能赋予抗生素抗性的基因(如使新霉素和卡那霉素磷酸化的nptII，或磷酸化潮霉素的hpt)、赋予除草剂抗性的基因(例如提供Basta抗性的bar；提供草甘膦抗性的aroA或gox)的基因，或提供陈代谢性状的基因(如允许植物利用甘露糖作为唯一碳源的manA)。可视标记基因导致颜色的形成(例如β-葡糖苷酸酶，GUS)、发光(如荧光素酶)或荧光(绿色荧光蛋白GFP及其衍生物)。
本发明还包括通过本发明方法获得的植物。本发明因此提供了可通过本发明方法获得的植物，该植物在其中引入了SnRK2核酸或其功能性变体，或者该植物在其中引入了遗传修饰，优选在SnRK2基因的基因座中。
本发明还提供了产生具有改良生长特性的转基因植物的方法，其包括在植物中引入和表达SnRK2核酸或其功能性变体。
更具体的，本发明提供了产生具有改良的生长特性的转基因植物的方法，该方法包括(i)向植物或植物细胞中引入SnRK2核酸或其功能性变体；并且(ii)在促进植物生长和发育的条件下培养植物细胞。
核酸可以直接引入到植物细胞或植物本身(包括引入到植物的组织、器官或任何其他部分)之中。根据本发明优选的特征，核酸优选通过转化引入植物中。
本文所涉及的术语“转化”包括把外源多核苷酸向宿主细胞中的转移，而不管转移所用的方法如何。无论是通过器官发生还是胚胎发生能够随后克隆繁殖的植物组织，可以用本发明的遗传构建体转化，并从其再生出整株植物。选择的特定组织将根据可用于且最适于待转化的特定物种的克隆繁殖系统而不同。例示性的靶标组织包括叶圆盘、花粉、胚胎、子叶、下胚轴、雌配子体、胼胝体组织、已存在的分生组织(例如，顶端分生组织，腋生的芽和根分生组织)以及诱导的分生组织(例如，子叶分生组织和下胚轴分生组织)。多核苷酸可以瞬时或稳定的被引入到宿主细胞中，并可保持非整合状态，例如，作为质粒。可选择的，它可以整合到宿主基因组中。以本领域技术人员所知的方法，所得的转化植物细胞然后可用来再生转化植物。
植物物种的转化目前是一种相当常规的技术。有利的，任何转化方法都可用于将目的基因引入到合适的祖代细胞中。转化方法包括使用脂质体、电穿孔、能增加游离DNA摄入的化学品、直接注射DNA到植物中、基因枪颗粒轰击、使用病毒或花粉进行转化以及显微注射。方法可选自用于原生质体的钙/聚乙二醇方法(Krens等人，(1982)Nature 296，72-74；Negrutiu等人(1987)Plant Mol.Biol.8，363-373)；原生质体的电穿孔(Shillito等人，(1985)Bio/Technol 3，1099-1102)；显微注射到植物材料中(Crossway等人，(1986)Mol.Gen.Genet.202，179-185)；DNA或RNA包被颗粒轰击(Klein等人，(1987)Nature 327，70)；用(非整合型)病毒感染等等。优选使用任何用于稻转化的熟知方法，通过农杆菌属(Agrobacterium)介导的转化产生表达SnRK2转基因的转基因稻植物，所述的方法例如在任何以下文献中描述的方法公开的欧洲专利申请EP 1198985 A1，Aldemita和Hodges(Planta，199，612-617，1996)；Chan等人(Plant Mol.Biol.22(3)491-506，1993)，Hiei等人(Plant J.6，271-282，1994)，其公开的内容以其全文在此引用作为参考。在谷类转化情形下，优选的方法如Ishida等人(Nature Biotechnol.14，745-50，1996)或Frame等人(Plant Physiol.129，13-22，2002)中所述，其公开的内容以其全文在此引用作为参考。
通常在转化以后，选择存在有与目的基因共转移的植物可表达基因所编码的一个或多个标记的植物细胞或细胞群，接着将转化的材料再生成整株植物。
DNA转移和再生之后，可评价推定转化植物中目的基因的存在、拷贝数和/或基因组结构，例如使用Southern分析。可选的或另外的，新引入DNA的表达水平可使用Northern和/或Western分析进行监控，两种技术都是本领域普通技术人员所熟知的。因此将转化的植物细胞培养为成熟植物包括步骤选择和/或再生和/或生长至成熟。
产生的转化植物可通过多种方法进行繁殖，如通过克隆繁殖或经典育种技术。例如，第一代(或T1)转化植物可以自花授精以产生纯合的第二代(或T2)转化体，并且T2植物可进一步通过经典的育种技术进行繁殖。
产生的转化生物可以是多种形式的。例如，它们可以是转化细胞与非转化细胞的嵌合体；克隆转化体(例如，所有的细胞都被转化以含有表达盒)；转化与未转化组织的嫁接体(例如，在植物中，转化的根茎被嫁接到未转化的接穗中)。
本发明显然延及由文中描述的任何方法产生的任何植物细胞或植物，以及所有的植物部分及其繁殖体。本发明还延及囊括由任何上述方法产生的原代转化或转染细胞、组织、器官或整株植物的后代，唯一的要求是该后代表现出与由本发明方法在亲代中产生的基因型和/或表型特征相同的基因型和/或表型特征。本发明还包括含有分离的SnRK2核酸或其功能性变体的宿主细胞。根据本发明优选的宿主细胞是植物细胞。本发明还延及本发明植物的可收获部分，例如但不限于种子、叶、果实、花、茎、根茎、块茎和鳞茎。本发明另外涉及直接来自此类植物的可收获部分的产物，如干的颗粒或粉、油、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白质。
本发明还包括SnRK2核酸或其功能性变体的用途，以及SnRK2多肽或其同源物的用途。
一种此类用途涉及改良植物的生长特性，尤其是改良产量，如增加的生物量和/或增加的种子产量。种子产量可以包括下列一种或多种增加的(饱满)种子数、增加的种子重量、增加的收获指数、增加的千粒重等。
SnRK2核酸或其变体，或SnRK2多肽或其同源物可以用在育种方案中，其中鉴定了与SnRK2基因或其变体遗传连锁的DNA标记。SnRK2或其变体，或SnRK2蛋白质或其同源物可以用来定义分子标记。之后可以将此DNA或蛋白质标记用在育种方案中以选择具有改良的生长特性的植物。例如，SnRK2基因或其变体可以是由的SEQ ID NO1所代表的核酸，或编码任意上述同源物的核酸。
还发现SnRK2基因的等位变体在标记辅助的育种方案中的用途。此类育种方案有时需要通过植物的诱变处理引入等位变异，例如使用EMS诱变；可选的，该方案可以开始于收集无意引起的“天然”来源的等位变体。之后通过例如PCR进行等位变体的鉴定。接着是选择步骤，用于选择所讨论序列的优良等位变体，其在植物中产生改良的生长特性。通常通过监控含有所讨论序列的不同等位变体的植物的生长特性来进行选择，所述的所讨论序列的等位变体如SEQ ID NO1的不同等位变体，或编码任意上述同源物的核酸的不同等位变体。监控生长特性可以在温室或野外进行。此外可选的步骤包括使已鉴定优良等位变体的植物与另一种植物杂交。例如，这可用于产生目标表型特征的组合。
SnRK2核酸或其变体还可用作探针，以对基因进行遗传和物理作图，这些基因是与之连锁的性状的一部分和标志。此类信息可用于植物育种，以开发具有所需表型的品系。SnRK2核酸或其变体的此类用途仅需要长度至少为10个核苷酸的核酸序列。SnRK2核酸或其变体可用作限制性片段长度多态性(RFLP)标记。限制性消化的植物基因组DNA的Southern印迹可使用SnRK2核酸或其变体进行探测。然后可以使用计算机程序如MapMaker(Lander等人(1987)Genomics 1174-181)对所得的带型进行遗传分析，以构建遗传图谱。此外，该核酸可用于探测Southern印迹，该Southern印迹含有代表亲本和确定的遗传杂交后代的一组个体的限制酶处理的基因组DNA。记录DNA多态性的分离，并用来计算SnRK2核酸或其变体在之前使用该群体获得的遗传图谱中的位置(Botstein等人(1980)Am.J.Hum.Genet.32314-331)。
在遗传作图中植物基因来源的探针的制备和用途在Bematzky和Tanksley(Plant Mol.Biol.Reporter 4，37-41，1986)中描述。众多出版物描述了使用上述方法或其变通形式对特定的cDNA克隆进行遗传作图。例如，F2杂交群体、回交群体、随机交配群体、近亲同基因系及其他的个体组可用于作图。这类方法是本领域技术人员熟知的。
核酸探针也可用于物理作图(即将序列置于物理图上；参见Hoheisel等人，在Non-mammalian Genomic AnalysisA Practical Guide，Academic press 1996，第319-346页，以及其中引用的参考文献)。
在另一个实施方案中，核酸探针可用于直接荧光原位杂交(FISH)作图(Trask(1991)Trends Genet.7149-154)。虽然现在的FISH作图方法偏向于使用大的克隆(几个到几百kb；参见Laan等人(1995)Genome Res.513-20)，但是灵敏度的提高允许使用较短的探针进行FISH作图。
遗传和物理作图的多种基于核酸扩增的方法可以使用所述核酸进行。实例包括等位基因特异性扩增(Kazazian(1989)J.Lab.Clin.Med 1195-96)、PCR扩增片段的多态性(CAPS；Sheffield等人(1993)Genomics 16，325-332)、等位基因特异性连接(Landegren等人(1988)Science 2411077-1080)、核苷酸延伸反应(Sokolov(1990)Nucleic Acid Res.183671)、放射杂交作图(Walter等人(1997)Nat.Genet.722-28)和Happy作图(Dear和Cook(1989)Nucleic Acid Res.176795-6807)。为实施这些方法，使用核酸序列设计和制备引物对，以用于扩增反应或引物延伸反应。此类引物的设计是本领域技术人员所熟知的。在采用基于PCR的遗传作图方法中，有必要鉴定跨越了对应于此核酸序列区域作图的亲代之间的DNA序列差异。但是，这对作图方法通常不是必要的。
在此方式中，可以实施产生、鉴定和/或分离具有改变的SnRK2活性和/或表达，表现出改良的生长特性的改良植物。
SnRK2核酸或其功能性变体，或SnRK2多肽或其同源物还可以用作生长调节剂。由于已经表明这些分子可用于改良植物的生长特性，它们也是有用的生长调节剂，如除草剂或生长刺激物。本发明因此提供了一种用作生长调节剂的组合物，其包含SnRK2核酸或其功能性变体，或SnRK2多肽或其同源物以及合适的载体、稀释剂或赋形剂。
根据本发明的方法产生如上所述的具有改良生长特性的植物。这些改良的生长特性也可与其他经济学上有利的性状组合，如进一步增产性状、对各种胁迫的耐受性、修饰各种结构特征和/或生化和/或生理学特征的性状。


本发明现在将参考以下附图进行描述，其中图1给出了SnRK2的全图。五角星形代表了激酶结构域，而浅灰色的C端区域代表了富含Asp和/或Glu的酸性区域。
图2显示了二元载体，其用来在稻中转化和表达受到稻GOS2启动子(内参PRO0129)调控的拟南芥SnRK2(内参CDS0758)的。
图3详细描述了可用于进行本发明方法的序列的实例。SEQ ID NO1和SEQ ID NO2代表了用于实施例中的SnRK2的核苷酸和蛋白质序列。SEQ ID NO3代表了SnRK2未剪接的DNA序列。SEQ ID NO4和SEQ IDNO5是用来分离SnRK2核酸的引物序列。SEQ ID NO6代表了在SnRK2蛋白质中保守部分的共有序列。SEQ ID NO7到53是SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所给出的SnRK2编码序列和蛋白质序列的同源物的核苷酸和蛋白质序列。
实施例本发明现在将参考以下实施例进行描述，其仅仅是为了例证说明。
DNA操作除非另外说明，否则重组DNA技术按照(Sambrook(2001)Molecular Cloninga laboratory manual，第3版，Cold Spring HarborLaboratory Press，CSH，New York)或Ausubel等人(1994)，CurrentProtocols in Molecular Biology，Current Protocols的卷1和2(http://www.4ulr.com/products/currentprotocols/index.htmD中描述的标准方案进行。用于植物分子工作的标准材料和方法描述于R.D.D Croy的Plant Molecular Biology Labfase(1993)，由BIOS Scientific PublicationsLtd(UK)和Blackwell Scientific Publications(UK)出版。
实施例1基因克隆使用拟南芥幼苗cDNA文库(Invitrogen，Paisley，UK)作为模板，PCR扩增拟南芥SnRK2(内部编码CDS0758)。对从幼苗提取的RNA进行逆转录以后，把cDNA克隆到pCMV Sport6.0中。文库的平均插入大小为1.5kb，并且克隆的原始数为1.59×107cfu。原始滴度确定为9.6×105cfu/ml，并且在第一轮扩增以后变成6×1011cfu/ml。质粒提取以后，将200ng的模板用于50μl PCR混合物。用于PCR扩增的引物prm02295(SEQ IDNO4，正义)和prm02296(SEQ ID NO5，反向互补)包含用于Gateway重组的AttB位点。使用Hifi Tag DNA聚合酶，在标准条件下进行PCR。同样使用标准方法扩增和纯化1130bp的PCR片段(无attB位点)。然后进行Gateway方法的第一步，即BP反应，在此期间，PCR片段与pDONR201质粒体内重组以产生“进入克隆”(entry clone)”(根据Gateway术语)。质粒pDONR201作为Gatewaytechnology的一部分购自Invitrogen。
实施例2载体构建和稻的转化继之在LR反应中使用进入克隆p028和用于稻转化的目的载体p03069。该载体包含位于T-DNA边界内的以下部分作为功能性元件植物选择性标记；可视标记表达盒；旨在与已克隆到进入克隆中的目的序列进行LR体内重组的Gateway盒。用于组成型表达的稻GOS2启动子位于该Gateway盒的上游。
LR重组步骤之后，将得到的表达载体p033(图2)转化到农杆菌属菌株LBA4404中，并且随后转化到稻植物中。使转化的稻植物生长，并且然后检验实施例3中所述的参数。
实施例3转化体的评估生长测量产生了大约15到20个独立的T0转化体。将初级转化体从组织培养箱转移到温室中生长，并收获T1种子。5个事件得以保留，其中T1后代发生3∶1的转基因存在/缺乏分离。对于这些事件中的每一个，通过可视标记选择，选择了10个包含转基因的T1幼苗(杂合子和纯合子)，以及10个缺乏转基因的T1幼苗(失效合子)。将选择的T1植物转移到温室中。每个植物具有一个唯一的条形标签以将表型数据与对应植物明确联系起来。所选择的T1植物在10cm直径花盆的土壤中并在下列环境状态下生长光周期＝11.5小时、日光强度＝30,000勒克斯或更多、日间温度＝28℃或更高、夜间温度＝22℃、相对湿度＝60-70％。转基因植物和相应的失效合子在随机位置上并排生长。从播种期到成熟期，植物几次通过数字成像箱。在每个时间点上对每株植物从至少6个不同的角度取得数字图像(2048×1536像素，1千6百万色)。
收获成熟的初级圆锥花序、装袋并贴上条码标签，然后在37℃烤箱中干燥三天。随后将圆锥花序脱粒并且收集所有的种子。使用鼓风装置将饱满外壳和空外壳分开。在分离后，使用可商购的计数仪器对两批种子进行计数。弃去空外壳。在分析天平上称重饱满的外壳并且使用数字成像测量种子的截面积。此方法得到一组下面描述的种子相关参数。
这些参数是使用图像分析软件，以自动方式从数字图像中得到并且进行统计分析的。将对不平衡设计进行修正的双因素ANOVA(方差分析)用作统计模型，用于植物表型特征的全面评估。对用本发明基因转化的所有植株的所有事件的所有测量参数进行F测验。进行F检验以检查基因对所有转化事件的效应，并检验基因的总效应，亦称之为整体基因效应。如果F检验的值显示数据具有显著性，那么结论是有“基因”效应，这意味着基因的存在或定位引起了效应。真实整体基因效应的显著性阈值设置为F测验的5％概率水平。
为了检查基因在事件中的效应，即品系特异性效应，在每一事件中使用来自转基因植物和相应无效植物的数据集进行t检验。“无效植物”或“无效分离子”或“无效合子”是以与转基因植物相同的方式处理的，但是转基因已经从中分离的植物。也可以将无效植物描述为纯合的阴性转化植物。将t检验显著性的阈值设定为10％概率水平。一些事件的结果可以高于此阈值或低于此阈值。这是基于这种假设，即基因可以仅在基因组中的某些位置中具有效应，并且此位置依赖性效应的发生不是罕见的。本文中此类基因效应也称为“基因的线性效应(line effect of the gene)”。通过比较t值和t分布得到p值，或者通过比较F值和F分布得到p值。p值给出了零假设(即没有转基因的作用)为正确的概率。
将在第一个实验中得到的数据在使用T2植物的第二个实验中来证实。选择了具有正确表达模式的3个品系用于进一步分析。通过监控标记基因表达来筛选T1中的来自阳性植物(杂合子和纯合子)的一批种子。对于每一个所选事件，随后保存几批杂合种子用于T2评估。在每批种子中，在温室中种植等量的阳性和阴性植物用于评估。
在T2代中评估了总数为120的SnRK2转化的植物，即每个事件有40个植物，其中有20个转基因阳性以及20个阴性。
由于进行了具有重叠事件的两个实验，进行组合分析。这可用于检查两个实验中效应的一致性，并且如果在这种情形下，其可用于从两个实验中收集证据从而增加结论的可信性。使用的方法是考虑到数据的多级结构(即实验-事件-分离子)的混合模型方法。通过对比卡方分布的似然比测定得到p值。
实施例4转化体的评估产量相关参数的测量当对上述种子进行分析时，发明人发现用SnRK2基因构建体转化的植物比缺乏SnRK2转基因的植物具有更高的生物量(表示为总Areamax)和增加的千粒重(TKW)。在T1代中植物所得的阳性结果(增加的千粒重以及9％的生物量增加(p值为0.0309))在T2代中再次得到。在表4中，数据显示了生物量和TKW的总％增加(从T2代的单独品系的数据中计算出来)以及来自F检验的各个p值。这些T2数据在与T1代结果的组合分析中进行再次评估，并且得到的p值显示观察到的效应是显著性的。
表4

地上生物量
通过计算区别于背景的来自地上植物部分的像素总数来确定植物地上面积。平均在同一时间点从不同的角度取得的图片得到此值，并且通过校准将此值转变为以平方毫米表示的物理表面值(总Areamax)。实验表明以此方式测量的地上植物面积与地上植物部分的生物量相关。在T1代中，存在地上生物量的显著性增加，并且其在T2代中得到的确认(p值分别在T1中是0.0309，T2中是0.0158)。组合分析还显示在生物量中得到的增加是高显著性的(p值0.0006)。
千粒重千粒重(TKW)是从所计的饱满种子数和它们的总重量推断出来的。在T1代和T2代中有TKW增加的倾向，这表明增加是可靠的总效应并且是显著性的。具体的，4个测试的T2品系中的2个表现出显著性的TKW增加。
序列表<110>克罗普迪塞恩股份有限公司<120>具有改良生长特性的植物及其制备方法<130>CD-119-prio<150>EP 04103421.6<151>2004-07-16<150>US 60/589,765<151>2004-07-21<160>55<170>PatentIn版本3.3<210>1<211>1092<212>DNA<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)<400>1atggacaagt acgagctggt gaaagacata ggtgctggga attttggagt tgccaggctc 60atgaaggtca aaaactctaa ggaacttgtt gccatgaagt acatcgagcg tggtcctaag 120attgatgaga atgtggcaag agagatcatt aatcacagat cacttcgcca tccgaatata 180atccggttca aggaggtggt gttgactcca acccatcttg ccattgccat ggaatatgct 240gctggtggtg aactattcga gcgtatatgc agtgctggaa gatttagtga ggatgaggcg 300agatatttct tccagcagct tatatcaggt gttagctatt gccatgctat gcaaatatgc 360catagagatc tgaagctcga gaatacgctc ttggatggaa gtcctgctcc acgtctgaaa 420atctgtgatt ttggttattc caagtcctct ctgctgcact ctaggcccaa atcaacagtt 480ggaactccag catatattgc acctgaggtc ctttctcgaa gagaatatga tggcaagatg 540gctgatgtat ggtcttgtgg tgtgactctt tatgtcatgc tggttggagc atacccattt 600gaagaccagg aagaccccaa gaacttcagg aaaacaatac aaaaaataat ggctgtccag 660tacaagatcc cggactacgt ccatatctca caggattgta aaaatctcct ttcccgtata 720tttgtcgcca attcactcaa gaggatcacc attgcagaaa tcaagaaaca ttcatggttc 780ctaaagaatt tgccaaggga actcacagag acagctcaag ctgcatattt caagaaagag 840aacccaacct tctcccttca gaccgttgaa gagatcatga agatagtggc tgacgccaaa 900acaccgcctc ctgtttcccg atccatcgga ggttttggct ggggaggaaa tggggatgca 960gatggaaaag aggaagatgc agaagacgtg gaggaggaag aggaggaggt ggaagaagag1020gaagacgatg aggatgaata cgataagact gtaaaggaag tacacgcaag tggagaagtg1080agaataagtt ga1092<210>2<211>363<212>PRT<213>拟南芥<400>2Met Asp Lys Tyr Glu Leu Val Lys Asp Ile Gly Ala Gly Asn Phe Gly1 5 10 15Val Ala Arg Leu Met Lys Val Lys Asn Ser Lys Glu Leu Val Ala Met20 25 30
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Glu Val His Ala Ser Gly Glu Val Arg Ile Ser355 360<210>3<211>3121<212>DNA<213>拟南芥<400>3caaacatgta tggatcgcat ggaaacttgt gggtccctct ttcttttaaa aaatctcgta 60ttaattaaat aaatggaaaa aaaaacatga tgggagtttg tttaggcagg ggagattctt 120cttcattctc atcattattt ctctattaat ttcaccccaa aaaagaaaaa agaaaaattc 180caacaagaaa aaaaaaagaa aaagaaagtt gattcttcgc ttaggcttga aatctctcca 240atccaaatct caaattaacc ttccatcgtc atctctttcc cttttttttt cccactttct 300ttgcgaatcg cgagatctcg gaatcgcatc cttgattttg ggatactgtt tttttttttt 360ttaatcttgt ttcattttca cgtgaaattc ttagctgcta gaactggact tgaatttcaa 420cgagaatttt ggagattttt tttttgtttg ggtttttcct ttctgttttg tgtgtttgga 480attagggttg tcgagcgaga atggacaagt acgagctggt gaaagacata ggtgctggga 540attttggagt tgccaggctc atgaaggtca aaaactctaa ggaacttgtt gccatgaagt 600acatcgagcg tggtcctaag gtatattcct ctctgttttt gtgttttcat tgctctccat 660gagctggtga tcctataccc agatatgcat aattggaatg aattgctatt aagcagaaga 720gtcgattttt ttttgtaaat ttcttatcgt tagctgattg ggtgtttaac gtaacgttag 780ttatcttgta gttgtaatat ttttcctgaa aagatttgta caatgagtat ttgctttgtt 840tgtttttttt gatacagatt gatgagaatg tggcaagaga gatcattaat cacagatcac 900ttcgccatcc gaatataatc cggttcaagg aggttagtga atttcttgtt gcttgacatg 960ggtggtgttc ttgctatgaa aaagtttgtt gataatctct tatatctttc atcttgcatt1020ccttgttggg tttatggatt ttataggtgg tgttgactcc aacccatctt gccattgcca1080tggaatatgc tgctggtggt gaactattcg agcgtatatg cagtgctgga agatttagtg1140aggatgaggt gagcttgcca tttgaaaaat tgtgctgtgc ttttgcgaat atgaaattac1200tagtatttag gataatctgc atggtctttg gaaagattag gaggaaggga acaagagaaa1260acatgtgaac ctccttttat ttagtatcag gcattaaaca gttagggtct acgttctaat1320cctttctctc ttttccaggc gagatatttc ttccagcagc ttatatcagg tgttagctat1380tgccatgcta tggtaatgta gagacaatga cttaagcaaa atttacttat ccattggctg1440tttgaagtcg ttttttttta atcatgtgtt gactattttg ttgcagcaaa tatgccatag1500agatctgaag ctcgagaata cgctcttgga tggaagtcct gctccacgtc tgaaaatctg1560tgattttggt tattccaagg tctgacacta aaaaaaaatc caagttcccc ccttgtcgac1620gagatcctct tttgtgattt gttattctct tttttttagt cctctctgct gcactctagg1680cccaaatcaa cagttggaac tccagcatat attgcacctg aggtcctttc tcgaagagaa1740tatgatggca aggtaatcaa gcatcatgca caatgcaatg aacttccata aacccatgag1800tatttatgat attgtcatgc tctttacatt tttacttttg aatttaaaaa gtcatctttg1860tggaagtcgc taagatttga agcatttttt cttctttcag atggctgatg tatggtcttg1920tggtgtgact ctttatgtca tgctggttgg agcataccca tttgaagacc aggaagaccc1980caagaacttc aggaaaacaa tacaagtagg tttctttttt gaagccatgt atctgcatat2040ctcgctttcg ccacatccta ttcgtcaatg tgtgatcttg ttatacagaa aataatggct2100gtccagtaca agatcccgga ctacgtccat atctcacagg attgtaaaaa tctcctttcc2160cgtatatttg tcgccaattc actcaaggta tacatcaatc aactgaacta aatgttttca2220aagatgcctt ttgatttttc tgaacaattg agctacttgt tgtttcgtag aggatcacca2280ttgcagaaat caagaaacat tcatggttcc taaagaattt gccaagggaa ctcacagaga2340cagctcaagc tgcatatttc aagaaagaga acccaacctt ctcccttcag accgttgaag2400agatcatgaa gatagtggct gacgccaaaa caccgcctcc tgtttcccga tccatcggag2460gttttggctg gggaggaaat ggggatgcag atggaaaaga ggaagatgca gaagacgtgg2520aggaggaaga ggaggaggtg gaagaagagg aagacgatga ggatgaatac gataagactg2580taaaggaagt acacgcaagt ggagaagtga gaataagttg atattttggt ttttggtctg2640tgtaagaaag aagtcgtcgt tggtttgttg aaactgaaaa gtctctgttc tcgtgtttgc2700ctttacaatg ctttggctaa ggttttggtt ctggttttgg agatttgtaa aatttgcagt2760ataagatgaa caaacagaga ggttgatgat gagaatgagt cctttgctac gcatggtact2820atgaacattg tgacctccaa taaatatttt tgtaaattag attttatttt ccgaaaagat2880tcatgtattt gatttttgga tttcttattt ttattttttt tcgttcctta tcattttttt2940
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<223>正向引物prm02295<400>4ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cacaatggac aagtacgagc tggt54<210>5<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反向引物prm02296<400>5ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc gacgacttct ttcttacaca g 51<210>6<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>保守性特征序列<220>
<221>混合特征<222>(2)..(2)<223>Xaa可以是Phe或Tyr<220>
<221>混合特征<222>(3)..(3)<223>Xaa可以是Leu、Met或Thr<220>
<221>混合特征<222>(5)..(5)<223>Xaa可以是Asn、Gly或Arg<220>
<221>混合特征<222>(6)..(6)<223>Xaa可以是Leu、Pro或Ile<220>
<221>混合特征<222>(7)..(7)<223>Xaa可以是Pro或Leu<220>
<221>混合特征<222>(8)..(8)<223>Xaa可以是Ala、Gly、Val、Arg、Lys或Ile<220>
<221>混合特征<222>(9)..(9)<223>Xaa可以是Asp、Glu或Val<400>6Trp Xaa Xaa Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1 5<210>7<211>1086<212>DNA<213>拟南芥<400>7atggacaagt acgagcttgt taaagacatc ggtgctggga attttggagt ggcgaggctc 60atgagagtca aaaactccaa ggaactcgtt gctatgaagt acatcgagcg tggacctaag 120attgatgaga acgtggcgag agagattatt aaccacagat cacttcgtca tcccaatatt 180atccggttta aggaggtggt tttgacacca acgcacatcg ccattgctat ggaatatgct 240gctggcggtg agctatttga gcgtatatgt agcgctggaa gattcagtga ggatgaggca 300agatactttt tccagcagct tatctcagga gtcagctatt gtcatgctat gcaaatatgc 360cacagagatc tgaagcttga aaataccctc ttagatggaa gtcctgctcc acgcctgaag 420atctgtgatt ttggttattc caagtcctca ctgttgcact ctatgcccaa atcaactgtt 480ggaactccag catatattgc acctgaggtt ctttctcgcg gagagtatga tggcaagatg 540gctgatgtat ggtcttgtgg tgtgactctt tatgtcatgc tggtgggagc atacccattt 600gaagaccaag aggatcccaa aaacttcaaa aaaacaatac aaagaataat ggctgtcaag 660tacaagatcc cggactatgt ccatatctca caagattgca aacatctoct ctcccgtata 720tttgtcacca actcgaataa gaggattacg ataggtgaca tcaagaaaca tccatggttc 780ctaaagaacc tgccaaggga acttacagaa atagctcaag ctgcatactt caggaaagag 840aacccgacat tctcactcca aagcgtcgaa gagataatga agattgtgga agaggcaaaa 900actccagctc gtgtttctcg gtcgattgga gcatttgggt ggggaggagg agaagatgcc 960gagggcaagg aggaagatgc agaggaagaa gttgaggaag tagaagaaga agaagacgaa1020gaagatgagt atgataagac ggtgaagcaa gtgcatgcta gcatgggaga agtccgagtc1080agttaa 1086<210>8<211>361<212>PRT<213>拟南芥<400>8Met Asp Lys Tyr Glu Leu Val Lys Asp Ile Gly Ala Gly Asn Phe Gly1 5 10 15Val Ala Arg Leu Met Arg Val Lys Asn Ser Lys Glu Leu Val Ala Met20 25 30
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Ala Ser Met Gly Glu Val Arg Val Ser355 360<210>9<211>1083<212>DNA<213>拟南芥<400>9atggacaagt atgaggttgt gaaggatttg ggagctggaa attttggtgt ggctcgtctt 60cttagacaca aagagaccaa agagctcgtt gctatgaaat acattgagag aggtcgcaag 120attgatgaga atgtggcaag agagattatc aatcatagat cacttaggca tcctaatatc 180atcagattca aggaggtgat tctgactcca actcatcttg caattgtaat ggagtatgct 240tctggaggag agctctttga aagaatctgt aatgctggta gattcagtga agctgaggct 300agatacttct ttcagcagct gatttgtggc gtggattact gtcattcact gcaaatatgt 360catagagatt tgaagcttga gaatacactg cttgatggta gtccagcccc gcttttgaaa 420atctgtgatt ttggttactc caagtcatct ctgcttcact ctagacctaa atcaactgtt 480ggtactccag cttatatcgc acctgaagtt ctttcccgaa gagaatatga cggaaagcat 540gcggatgttt ggtcctgtgg tgtgactctt tatgtgatgt tagttggagg ttatccgttt 600gaagacccgg atgatccgag aaacttcagg aaaacaatcc aacgtataat ggctgtccag 660tacaagatcc cggattacgt tcatatatcg caggagtgca gacaccttct ctctcgcata 720tttgtcacta attcagctaa gagaatcaca cttaaagaga tcaagaagca tccatggtac 780ttaaagaact tgccaaagga gcttacagag cctgctcaag cggcgtacta caagagagaa 840accccaagct tttccctcca aagcgtagag gacataatga agatcgttgg agaagccagg 900aatccagctc cgtcttctaa tgccgtcaag ggctttgatg atgatgagga agatgtggag 960gacgaggttg aagaagaaga agaagaagaa gaagaagagg aggaagaaga ggaagaggaa1020gaagatgaat acgagaagca tgttaaagag gcccattctt gtcaagagcc tcccaaagct1080taa 1083<210>10<211>360<212>PRT<213>拟南芥<400>10Met Asp Lys Tyr Glu Val Val Lys Asp Leu Gly Ala Gly Asn Phe Gly1 5 10 15Val Ala Arg Leu Leu Arg His Lys Glu Thr Lys Glu Leu Val Ala Met20 25 30Lys Tyr Ile Glu Arg Gly Arg Lys Ile Asp Glu Asn Val Ala Arg Glu35 40 45Ile Ile Asn His Arg Ser Leu Arg His Pro Asn Ile Ile Arg Phe Lys50 55 60Glu Val Ile Leu Thr Pro Thr His Leu Ala Ile Val Met Glu Tyr Ala65 70 75 80Ser Gly Gly Glu Leu Phe Glu Arg Ile Cys Asn Ala Gly Arg Phe Ser85 90 95Glu Ala Glu Ala Arg Tyr Phe Phe Gln Gln Leu Ile Cys Gly Val Asp100 105 110
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aggtacttct ttcaacagct gatttgtggt gttgattact gccattcctt gcaaatatgt 360catagagacc tgaagcttga gaacacactg ctcgatggga gccctgctcc gcttttgaaa 420atctgtgatt ttggttactc taagtcatct atactacatt ctaggcctaa atcaactgtt 480ggaactccag cttacatagc acctgaagtt ctttcacgga gagaatatga tggcaagcac 540gcggatgtgt ggtcatgtgg agtaaccctt tatgtgatgc tggtgggagc ttacccgttt 600gaggacccta atgatccaaa aaacttcagg aaaacaatcc agcgcataat ggctgtacaa 660tacaagatcc cggactatgt tcacatatct caggaatgca aacatcttct ctctcgcata 720ttcgtcacta actctgctaa gagaatcaca cttaaggaga tcaagaatca tccgtggtac 780ttgaagaatt tgccaaagga gctgctagag tcggctcaag cggcgtatta caagagagac 840acaagcttct ctcttcaaag cgtagaggac ataatgaaga tagttggaga agcaaggaat 900ccagctccat caactagtgc tgtcaaaagc tcgggctcag gagctgatga agaagaggaa 960gaggacgttg aagctgaagt ggaagaggaa gaagatgatg aagacgaata cgagaagcat1020gtcaaagagg cacagtcttg tcaagagtct gacaaagctt aa 1062<210>12<211>353<212>PRT<213>拟南芥<400>12Met Asp Lys Tyr Asp Val Val Lys Asp Leu Gly Ala Gly Asn Phe Gly1 5 10 15Val Ala Arg Leu Leu Arg His Lys Asp Thr Lys Glu Leu Val Ala Met20 25 30Lys Tyr Ile Glu Arg Gly Arg Lys Ile Asp Glu Asn Val Ala Arg Glu35 40 45Ile Ile Asn His Arg Ser Leu Lys His Pro Asn Ile Ile Arg Phe Lys50 55 60Glu Val Ile Leu Thr Pro Thr His Leu Ala Ile Val Met Glu Tyr Ala65 70 75 80Ser Gly Gly Glu Leu Phe Asp Arg Ile Cys Thr Ala Gly Arg Phe Ser85 90 95Glu Ala Glu Ala Arg Tyr Phe Phe Gln Gln Leu Ile Cys Gly Val Asp100 105 110Tyr Cys His Ser Leu Gln Ile Cys His Arg Asp Leu Lys Leu Glu Asn115 120 125Thr Leu Leu Asp Gly Ser Pro Ala Pro Leu Leu Lys Ile Cys Asp Phe130 135 140Gly Tyr Ser Lys Ser Ser Ile Leu His Ser Arg Pro Lys Ser Thr Val145 150 155 160Gly Thr Pro Ala Tyr Ile Ala Pro Glu Val Leu Ser Arg Arg Glu Tyr165 170 175Asp Gly Lys His Ala Asp Val Trp Ser Cys Gly Val Thr Leu Tyr Val180 185 190Met Leu Val Gly Ala Tyr Pro Phe Glu Asp Pro Asn Asp Pro Lys Asn195 200 205
Phe Arg Lys Thr Ile Gln Arg Ile Met Ala Val Gln Tyr Lys Ile Pro210 215 220Asp Tyr Val His Ile Ser Gln Glu Cys Lys His Leu Leu Ser Arg Ile225 230 235 240Phe Val Thr Asn Ser Ala Lys Arg Ile Thr Leu Lys Glu Ile Lys Asn245 250 255His Pro Trp Tyr Leu Lys Asn Leu Pro Lys Glu Leu Leu Glu Ser Ala260 265 270Gln Ala Ala Tyr Tyr Lys Arg Asp Thr Ser Phe Ser Leu Gln Ser Val275 280 285Glu Asp Ile Met Lys Ile Val Gly Glu Ala Arg Asn Pro Ala Pro Ser290 295 300Thr Ser Ala Val Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ala Asp Glu Glu Glu Glu305 310 315 320Glu Asp Val Glu Ala Glu Val Glu Glu Glu Glu Asp Asp Glu Asp Glu325 330 335Tyr Glu Lys His Val Lys Glu Ala Gln Ser Cys Gln Glu Ser Asp Lys340 345 350Ala<210>13<211>1089<212>DNA<2l3>拟南芥<400>13atggatcgac cagcagtgag tggtccaatg gatttgccga ttatgcacga tagtgatagg 60tatgaactcg tcaaggatat tggctccggt aattttggag ttgcgagatt gatgagagac 120aagcaaagta atgagcttgt tgctgttaaa tatatcgaga gaggtgagaa gatagatgaa 180aatgtaaaaa gggagataat caaccacagg tccttaagac atcccaatat cgttagattc 240aaagaggtta tattaacacc aacccattta gccattgtta tggaatatgc atctggagga 300gaacttttcg agcgaatctg caatgcaggc cgcttcagcg aagacgaggc gaggtttttc 360ttccagcaac tcatttcagg agttagttac tgtcatgcta tgcaagtatg tcaccgagac 420ttaaagctcg agaatacgtt attagatggt agcccggccc ctcgtctaaa gatatgtgat 480ttcggatatt ctaagtcatc agtgttacat tcgcaaccaa aatcaactgt tggaactcct 540gcttacatcg ctcctgaggt tttactaaag aaagaatatg atggaaaggt tgcagatgtt 600tggtcttgtg gggttactct gtatgtcatg ctggttggag catatccttt cgaagatccc 660gaggaaccaa agaatttcag gaaaactata catagaatcc tgaatgttca gtatgctatt 720ccggattatg ttcacatatc tcctgaatgt cgccatttga tctccagaat atttgttgct 780gaccctgcaa agaggatatc aattcctgaa ataaggaacc atgaatggtt tctaaagaat 840ctaccggcag atctaatgaa cgataacacg atgaccactc agtttgatga atcggatcaa 900ccgggccaaa gcatagaaga aattatgcag atcattgcag aagcaactgt tcctcctgca 960ggcactcaga atctgaacca ttacctcaca ggaagcttgg acatagatga cgatatggag1020gaagacttag agagcgacct tgatgatctt gacatcgaca gtagcggaga gattgtgtac1080gcaatgtga1089<210>14<211>362<212>PRT
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gataaactca ctaaagagct tgttgctgtc aagtacatcg agagaggaga caagattgat 180gaaaatgttc aaagggagat cattaaccac aggtcactaa ggcatcctaa tattgtcaga 240tttaaagagg tcattttgac gccgactcat ctggctatca taatggaata tgcttctggc 300ggtgaacttt acgagcggat ttgcaatgca ggacggttta gtgaagatga ggctcggttc 360ttctttcagc agcttctatc tggagtcagt tattgtcatt cgatgcaaat ttgccatcgt 420gacctgaagc tagagaatac attgttggat ggaagtcctg ctcctcgatt aaaaatttgt 480gattttggat attcaaagtc ttctgttctt cattcacaac caaagtcaac tgttggtact 540cctgcataca tcgctccaga ggtactgctt cgtcaggaat atgatggcaa gattgcagat 600gtatggtcat gtggtgtgac cttatacgtc atgttggttg gagcgtatcc gttcgaagat 660ccagaagagc caagagacta tcggaaaaca atacagagaa tccttagcgt taaatactca 720atccctgatg acatacggat atcacctgaa tgctgtcatc ttatttcaag aatcttcgtg 780gctgatcccg ctaccagaat aagcatacca gagatcaaaa cccatagttg gttcttgaag 840aatctccctg ctgatctaat gaacgagagc aacacaggaa gccagttcca ggagcctgaa 900caaccaatgc aaagccttga cacaatcatg caaatcatct ctgaagccac aattcccgct 960gttcgaaacc gttgcctaga cgatttcatg actgacaatc ttgatcttga cgatgacatg1020gatgactttg actctgaatc tgaaatcgac attgacagta gcggagagat agtttacgct1080ctctaa 1086<210>18<211>361<212>PRT<213>拟南芥<400>18Met Asp Arg Ala Pro Val Thr Thr Gly Pro Leu Asp Met Pro Ile Met1 5 10 15His Asp Ser Asp Arg Tyr Asp Phe Val Lys Asp Ile Gly Ser Gly Asn20 25 30Phe Gly Val Ala Arg Leu Met Arg Asp Lys Leu Thr Lys Glu Leu Val35 40 45Ala Val Lys Tyr Ile Glu Arg Gly Asp Lys Ile Asp Glu Asn Val Gln50 55 60Arg Glu Ile Ile Asn His Arg Ser Leu Arg His Pro Asn Ile Val Arg65 70 75 80Phe Lys Glu Val Ile Leu Thr Pro Thr His Leu Ala Ile Ile Met Glu85 90 95Tyr Ala Ser Gly Gly Glu Leu Tyr Glu Arg Ile Cys Asn Ala Gly Arg100 105 110Phe Ser Glu Asp Glu Ala Arg Phe Phe Phe Gln Gln Leu Leu Ser Gly115 120 125Val Ser Tyr Cys His Ser Met Gln Ile Cys His Arg Asp Leu Lys Leu130 135 140Glu Asn Thr Leu Leu Asp Gly Ser Pro Ala Pro Arg Leu Lys Ile Cys145 150 155 160Asp Phe Gly Tyr Ser Lys Ser Ser Val Leu His Ser Gln Pro Lys Ser165 170 175Thr Val Gly Thr Pro Ala Tyr Ile Ala pro Glu Val Leu Leu Arg Gln180 185 190
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Glu Glu Asp Glu Tyr Asp Lys Thr Val Lys Glu Ala His Ala Ser Gly340 345 350Glu Val<210>49<211>1056<212>DNA<213>大豆(Glycine Max)<400>49atggataagt atgaggctgt caaggatttg ggagctggga attttggggt ggctaggctc 60atgaggaaca aggagaccaa ggagcttgtt gccatgaaat acatcgagcg tggccaaaag 120attgatgaga atgtggcaag agagattatc aaccacagat cccttcggca ccccaatata 180attcgcttca aggaggtggt tttgaccccc acccatttgg ccatagtgat ggagtatgcg 240gctggaggag agctctttga gaggatatgc aatgctggca ggttcagtga agatgaggct 300agatatttct ttcagcagct gatttctggt gtacattact gtcatgccat gcaaatatgt 360cacagagatt tgaagctaga aaataccctt ttagatggaa gccctgcacc ccgcctgaaa 420atttgtgact ttggttattc caagtcatca ttacttcatt cacggccaaa atcaactgtt 480ggaactccag cttatatagc accagaggtt ctttccagga gggagtatga tggcaagttg 540gctgatgtat ggtcatgtgg agtgactctt tatgtcatgc tggttggagc ttatcccttt 600gaggatcagg atgaccctag gaattttagg aaaacaattc agcgtataat ggctgttcaa 660tacaaaatcc ctgattatgt tcacatatct caagactgca gacacctcct ttctcgtata 720tttgtagcaa atccattaag gaggatctct cttaaggaaa ttaagagcca cccatggttt 780ttaaagaatc ttccaagaga gctgactgaa tcagctcaag ctgtctatta ccagagaggc 840aatccaagct tttcaattca aagtgtggag gagatcatga agattgtggg agaggcaagg 900gaccctcctc cagtatctag acctgtcaaa ggttttggct gggatggcga agaagatgaa 960ggggaagaag acgtggagga agaggaggac gaagaagacg agtatgacaa gagggtcaaa1020gaggttcatg caagtggaga atttcaaatc agttaa 1056<210>50<211>351<212>PRT<213>大豆<400>50Met Asp Lys Tyr Glu Ala Val Lys Asp Leu Gly Ala Gly Asn Phe Gly1 5 10 15Val Ala Arg Leu Met Arg Asn Lys Glu Thr Lys Glu Leu Val Ala Met20 25 30Lys Tyr Ile Glu Arg Gly Gln Lys Ile Asp Glu Asn Val Ala Arg Glu35 40 45Ile Ile Asn His Arg Ser Leu Arg His Pro Asn Ile Ile Arg Phe Lys50 55 60Glu Val Val Leu Thr Pro Thr His Leu Ala Ile Val Met Glu Tyr Ala65 70 75 80Ala Gly Gly Glu Leu Phe Glu Arg Ile Cys Asn Ala Gly Arg Phe Ser85 90 95Glu Asp Glu Ala Arg Tyr Phe Phe Gln Gln Leu Ile Ser Gly Val His100 105 110
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1.相对于对应的野生型植物，改良植物生长特性的方法，其包括增加SnRK2多肽或其同源物的活性，和/或通过增加SnRK2编码核酸分子的表达，以及任选选择具有改良生长特性的植物。
2.权利要求1的方法，其中所述增加活性和/或增加表达通过优选在SnRK2多肽或其同源物的编码基因的基因座中引入遗传修饰来实现。
3.权利要求2的方法，其中所述遗传修饰通过定点诱变、同源重组、TILLING、定向进化和T-DNA激活中的一种来实现。
4.相对于对应的野生型植物，改良植物生长特性的方法，其包括在植物中引入和表达SnRK2核酸分子或其功能性变体。
5.权利要求4的方法，其中所述功能性变体是部分SnRK2核酸分子或能够与SnRK2核酸分子杂交的序列，其中所述功能性变体包含激酶结构域、SEQ ID NO6的保守性序列特征以及酸性C端结构域。
6.权利要求4或5的方法，其中所述SnRK2核酸分子或其功能性变体在植物中过量表达。
7.根据权利要求4到6中任一项的方法，其中所述SnRK2核酸分子或其功能性变体是植物来源的，优选来自双子叶植物，进一步优选来自十字花科，所述核酸更优选来自拟南芥。
8.根据权利要求4到7中任一项的方法，其中所述功能性变体编码SnRK2的直系同源物或旁系同源物。
9.根据权利要求4到8中任一项的方法，其中所述SnRK2核酸分子或其功能性变体与组成型启动子有效连接。
10.根据权利要求9的方法，其中所述组成型启动子是GOS2启动子。
11.根据权利要求1到10中任一项的方法，其中所述改良的植物生长特性是增加的产量。
12.根据权利要求11的方法，其中所述增加的产量是增加的生物量和/或增加的种子产量。
13.根据权利要求12的方法，其中所述增加的种子产量选自(i)增加的种子生物量；(ii)增加的(饱满)种子数；(iii)增加的种子尺寸；(iv)增加的种子体积；(v)增加的收获指数(HI)；以及(vi)增加的千粒重(TKW)中的任一项或多项。
14.根据权利要求1到13中任一项的方法获得的植物或植物细胞。
15.构建体，其包括(i)SnRK2核酸分子或其功能性变体；(ii)能够驱动(i)中核酸序列表达的一个或多个调控序列；及任选的(iii)转录终止序列。
16.根据权利要求15的构建体，其中所述调控序列是组成型启动子。
17.根据权利要求16的构建体，其中所述组成型启动子是GOS2启动子。
18.根据权利要求15到17中任一项的构建体转化的植物或植物细胞。
19.制备具有改良生长特性的转基因植物的方法，所述方法包括(i)向植物中引入SnRK2核酸分子或其功能性变体；(ii)在促进植物生长和发育的条件下培养植物细胞。
20.相对于对应的野生型植物，具有改良生长特性的转基因植物或植物细胞，所述改良生长特性由引入所述植物或植物细胞中的SnRK2核酸分子或其功能性变体产生，或由优选在SnRK2多肽或其同源物的编码基因的基因座中的遗传修饰产生。
21.根据权利要求14、18或20的转基因植物或植物细胞，其中所述植物是单子叶植物，如甘蔗，或其中植物是谷类，如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、燕麦或高粱；或其中所述植物细胞来自单子叶植物，如甘蔗，或其中所述植物细胞来自谷类，如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、燕麦或高粱。
22.根据权利要求14、18、20或21中任一项的植物的可收获部分，和/或直接来自其的产物。
23.根据权利要求22的可收获部分，其中所述可收获部分是种子。
24.SnRK2核酸分子或其功能性变体的用途，或者SnRK2多肽或其同源物的用途，其用于改良植物的生长特性，特别是改良产量，尤其是改良生物量和/或种子产量。
25.根据权利要求24的用途，其中所述改良的种子产量至少包括增加的千粒重。
26.SnRK2核酸分子或其功能性变体作为分子标记的用途。
27.用于改良植物的生长特性，优选用作生长调节剂的组合物，其包含SnRK2核酸分子或其功能性变体。
28.用于改良植物的生长特性，优选用作生长调节剂的组合物，其包含SnRK2蛋白质或其同源物。
全文摘要
本发明涉及改良植物生长特性的方法，其通过增加植物中SnRK2激酶或其同源物的活性和/或表达来实现。此类方法之一包括将SnRK2核酸分子或其功能性变体引入植物。本发明还涉及具有改良生长特性的转基因植物，该植物具有调节的SnRK2激酶编码核酸的表达。本发明还涉及可用于本发明方法中的构建体。
文档编号C12N15/82GK101018865SQ200580030860
公开日2007年8月15日 申请日期2005年7月14日 优先权日2004年7月16日
发明者V·弗兰卡德, V·米罗诺夫 申请人:克罗普迪塞恩股份有限公司