专利名称：新型调节蛋白质的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物中的myb调节蛋白质。更具体地说，本发明涉及R2R3 型myb蛋白质，编码该蛋白质的基因，以及该蛋白质及其编码基因的应 用。
背景技术：
出于多种原因，气味是植物非常重要的一种性状。例如，花朵产生 挥发性化合物，这在繁殖过程中对吸引传粉昆虫并成功产生大量种子起 了重要作用。或者，植物在其生殖部分或营养部分产生的挥发性化合物 也吸引了有害昆虫或者它们的捕食者。在该过程中，挥发物的情况决定 了对有害生物如有害昆虫、线虫或真菌的敏感性或抗性。干扰和改变挥 发物的合成和释放可成为干预植物/昆虫关系的有效途径，从而改善繁 殖过程或者提高对有害昆虫的抗性。气味在园艺产业中也是重要的性 状。在许多情况下，由于在育种程序中对该性状普遍忽视，致使气味不 存在或不再存在。 一个很好的例子是玫瑰，我们看到，在多数栽培种中 已经失去了气味。将气味(重新)引入商业观赏植物品种中是一种趋势 和普通关心的问题。这可通过常规育种来实现。然而这样需要耗费大量 的时间和精力。类似地，蔬菜作物比如番茄的味道也受挥发物浓度的影 响。同样，通过常规育种来改变番茄的味道也很费时间。挥发物对于香料和香味、食品和化妆品工业也很重要，在许多情况 下，从作为香料和香味成分来源的花朵、香草、果实和香料中生产天然 挥发性化合物，并用于香水、食品、化妆品等等。很重要的一类植物挥发性化合物是所谓的苯环型化合物 (benzenoids)。这些酚类化合物具有基本的C6骨架，由莽草酸途径产 生，并且通常在特定器官或特定细胞类型中产生。多种植物一一如兰花 和碧冬茄属(/7e""/a) _ —的花能够产生苯环型化合物作为其香味的
主要来源。在许多矮牵牛(户e^7/ /a A76W&)林系中，苯环型挥发性 化合物在昼夜节律的傍晚开始以及整个夜间由花瓣特异地释放。至今， 对该途径中涉及的分子和遗传过程只有有限的了解。已经克隆和表征了 仅仅几个结构基因，并且至今没有识别出调节基因。因此，对于植物如 何调节苯环型化合物的生物合成和释放仍然知之甚少。
如果在植物或其他(微)生物中通过可靠途径能够实现可重现地、 有效地并且低成本地阻断、增强或改变气味的生物合成，那么将极具优 势。
图1: Mitchell (W115)散发的挥发性苯环型化合物的定量分析。四 种RNAi系显示挥发物的散发减少(TA-1、 TA-3、 TA-12和TA-35 ), — 种RNAi系(40)显示苯环型化合物的散发未减少。
图2:对Mitchell (M)和RNAi系l、 3、 12、 35和40进行RNA凝胶 印迹分析，以显示和合成苯丙氨酸和反式肉桂酸的莽草酸途径的 基因，例如DAHP合酶(DAHPS)、 EPSP合酶(EPSPS)、分支酸变位酶(CM) 和两个苯丙氨酸解氨酶基因(PALI和2 );显示苯曱酸千酯转移酶(BEBT ) 和苯曱酸/水杨酸甲基转移斷BSMT)。示出花结合蛋白l( floral binding protein 1, FBP1)的转录水平来显示RNAi系中^W7抑制的特异性。
图3: 同源物(homolog)的R2R3区域的比对，显示出表明功
能上保守的保守性(暗影)残基。
发明内容
本发明涉及具有DNA结合活性的多肽，具有SEQ ID NO. l所示的多 肽序列，或其变体或衍生物。
本发明的这些多肽属于R2R3型MYB家族，可调节莽草酸途径。莽草 酸途径是合成三种芳香族氨基酸一一酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的途 径。由这些化合物可形成其他的芳香族化合物。这是首次识别出生成苯 环型化合物的莽草酸途径中的调节蛋白质。因此，本发明的优点之一是 首次提供了莽草酸途径中的调节蛋白质，以及对无法由动物合成的三种
必需氨基酸的生物合成进行调节的方法。同时，它为由这些必需氨基酸 衍生的芳香族和非芳香族化合物的生物合成的调节开辟了道路。由这三 种芳香族氨基酸衍生的最重要的化合物的实例包括例如肉桂酸、香豆
酸、咖啡酸、阿魏酸等的化合物；来自莽草酸途径的化合物，它们本身 是许多其他工业用化合物的中间体。试举几例苯环型化合物包括苯曱 酸曱酯、水杨酸曱酯、苯曱醛、乙酸爷酯、苯甲酸千酯、香草醛、异丁 香油酚，类苯丙酸(phenyl propanoids )包括黄酮醇和花色素苷。由 于这些化合物参与初级和次级代谢，技术人员可以理解，本发明的蛋白 质提供了影响多种生物合成过程的方法。这包括调节参与防卫病原体的 化学物质(主要是酚类来源物质)，以及调节挥发性苯环型化合物的散 发。由于莽草酸途径也存在于某些细菌和真菌中，本发明的教导也适用 于这些系统。
本发明多肽的变体和^f生物
本发明所用的"变体"或"衍生物"包括这样一些肽或非肽化合物， 它们通过替换、缺失、添加一个或多个氨基酸，或者与一个或多个氨基 酸融合而不同于所引述的多肽，同时又保留有所引述多肽的性质。这些 术语还包括这样一些肽或非肽化合物，它们通过引入或修饰 一些糖基化 位点而不同于所引述的多肽，同时又保留有所引述多肽的性质。这些术 语还包括这样一些肽或非肽化合物，它们通过将修饰基团与肽结构相偶 联(共价或非共价)而不同于所引述的多肽，同时又保留有所引述多肽 的性质。尤其是，变体和衍生物保留有操控生成苯环型化合物的莽草酸 途径的基因的转录水平的能力，包括3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸-7-磷 酸合酶(Z^mS)、 5-烯醇-丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶C57V户5)、分支酸变 位酶(6助和L-苯丙氨酸解氨酶(川Z)基因的转录水平。
在一个实施方案中，变体或衍生物包括与SEQ ID NO. 1氨基酸序 列具有至少50%、 55%、 60%、 65%、 70%、 75%、优选80%、 85%、 90%、 95%、 97%、 98%或99%同一性的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，变体或衍生物包括与SEQ ID NO. 1的氨基 酸13-116具有至少90%、 95%、 97%、 98%或99%同一性的氨基酸序列。 该区域的氨基酸对应于本发明多肽的DNA结合结构域，为！Ul3型myb DM 结合结构域。关于此类型myb结构域的更多信息，参见Stracke et
al. (2001) Current Opinion in Plant Biology 4: 447-456。
在另一个实施方案中，变体或衍生物包括与SEQ ID NO. 1的氨基 酸128至氨基酸294区域具有至少70%、75%或80%同一性的氨基酸序列。 优选地，变体或衍生物包括与SEQ IDN0. 2的氨基酸128至氨基酸294 区域具有至少85%、 87%、 89%或90%同一性的氨基酸序列。最优选地， 变体或衍生物包括与SEQ ID NO. 1的氨基酸128至氨基酸294区域具 有至少94%、 97%、 98%或99。/。同一性的氨基酸序列。
在另 一个实施方案中，变体或衍生物是与所引述的多肽相比差别仅 在于保守性置换的多肽。本文使用的"氨基酸的保守性置换"是指一个 氨基酸被具有相似性质的另一个氨基酸所置换。例如， 一个疏水性氨基 酸被另一个疏水性氨基酸所代替。术语肽和多肽在本文中基本可互换使 用，是指含有一连串氨基酸的分子。
氨基酸同一性可用已知方法容易地计算，包括但不限于下列文献中 记载的方法Computational Molecular Biology, Lesk， A. M. ， ed.， Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Infomatics and Genome Projects, Smith, D. W. ， ed. ， Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I， Griffin, A. M. ， and Griffin, H. G. ， eds. ， Humana Press, New Jersey' 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heine, G.， Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov， M. and Devereux， J. ， eds.， M Stockton Press, New York, 1991; 和 Carillo, H.， and Lipman, D., SIAM J. Applied Math. ， 48:1073 (1988)。确定同 一性的优选方法被设计为可在待测序列间给出最大匹 配。确定同一性的方法已被编写成公众可得到的计算机程序。确定两条 序列间同一性和相似性的优选的计算机程序包括但不限于GCG程序包 (Devereux, J. ， et al. ， Nucleic Acids Research 12 (1):387 (1984))、 BestFit、 BLASTP、 BLASTN和FASTA (Altschul， S. F. et al. , J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)。 BLAST X程序公众可从NCBI和其他来源 获得(BLAST Manual, Altschul, S. ， et al. ， NCBI NLM NIH Bethesda， MD 20894; Altschul, S. ， et al. ， J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)。 公知的Smith Waterman算法也可用于确定同一性。多肽序列比较时优 选的参数包括1)算法Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol.
另一方面，本发明提供一种分离、重组或合成的多核普酸，包括具 有SEQ ID NO. 2所示序列的核苷酸序列或其变体，它与SEQ ID NO. 2具 有至少50°/。、 55%、 60%、 65%、 70%、 75°/。、优选80%、 85%、 90%、 95%、 97%、 98%或99%同一性，并且它编码的蛋白质具有对生成苯环型化合物的莽草酸 途径的调节活性。
在一个实施方案中，本发明的多核苷酸包括这样一种多核苷酸序列， 它编码具有SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列的多肽或者该多肽的片段，所 述片段具有对生成苯环型化合物的莽草酸途径的调节活性。
还包括在本发明范围内的有这样一些多核苷酸序列，其序列与SEQ ID NO. 2的多核苷酸序列互补，如反义RNA或其他抑制性RNA，例如用 于RNAi的RNA;或者它在严格条件下可与SEQ ID NO. 2序列的一部分杂 交。这些互补和杂交序列可为任何长度，本领域技术人员能够理解，合 适的长度应该与使用序列的目的相适应。例如，对于转录后沉默，可在 植物中使用任何长度的双链RNA。
两条核苷酸序列的同一性可由上述方法确定。术语核苷酸序列、核
酸和多核苷酸在本申请中基本上可互换使用，是指核普酸的序列。
本发明的多核苷酸可包括基因组序列、基因组外和质粒编码的序 列，以及可表达或者适于表达蛋白质、多肽、肽等物质的较小的经基因 工程改造的基因节段。本发明的多核苷酸可为单链(编码链或反义链)
或者双链，可为DNA(基因组、cDNA)或RNA分子。它们可为分离的、 重组的或者合成的。RNA分子可包括异质核RNA (hnRNA)分子和mRM 分子，hn RNA分子含有内含子并与DNA分子——对应，而mRNA分子不 含内含子。本发明的多核苷酸中可以但不必须存在其他的编码或非编码
序列，多核苷酸可以但不必须与其他分子和/或支持材料相连接。
本文使用的"分离的"是指一种多核苷酸中基本不含其他的核酸序 列，并且该多核苷酸中不含无关序列的较大部分，例如大染色体片段或 其他功能基因或多肽编码区域。当然，这是指最初分离的多核苷酸分子， 并不排除后来以人工方式在该节段中添加的基因或编码区域。
本发明的栽体
另一方面，本发明涉及包含本发明的多核苷酸的载体。可使用的理 想载体包括公知的植物载体，如pK7GWIG2(I)和pGreen，以及用于在微: 生物中转化和表达蛋白质的现有技术中的载体。另外参见Arabidopsis, A laboratory manual Eds. Weigel & Glazebrook， Cold Spring Harbor Lab Press (2002) 以及Maniatis et al. Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Ub (1982)。
本发明的宿主细胞
又另 一方面，本发明涉及含有本发明的多核苷酸或者载体的宿主细 胞。根据本发明的合适的宿主细胞包括植物细胞、酵母细胞、真菌细胞、 藻类细胞、人细胞和动物细胞。合适的植物细胞的例子包括番茄和鼠耳 芥属(Jra6/cTo/^/s )。合适的酵母细胞的例子包括酿酒酵母 (5^cc力"o迈yces cere7/s2'ae)和巴斯德毕赤酵母(/7c力/.a ; a"or/s)。 合适的真菌细胞的例子包括曲霉属(J^7erg///ws0 。合适的动物细胞 的例子包括昆虫细胞，如来自草地贪夜蛾(5^ocTo/^era ) 的细胞；哺乳动物细胞，如中国仓鼠卵巢细胞或者PERC6细胞。可以使 用多种现有技术中的细胞系，例如Flp-In细胞系(Invitrogen)。如
上所述，可以使用多种将本发明的多核苷酸引入宿主细胞的载体。这些
栽体可为克隆栽体、表达载体、沉默载体，它们可以选自例如质粒DNA 载体、病毒DNA载体(如腺病毒或腺相关病毒栽体)、病毒RNA载体(如 反转录病毒)或植物病毒载体，如烟草脆裂病毒(tobacco rattle virus ) 和马铃薯X病毒(potato virus X)。
由无细胞提取物制备本发明的多肽也涵盖在本发明之中。无细胞提 取物中的制备方法在本领域中已知。参见例如Pelman and Jackson (1976) Eur. J.Biochem 67: 247-56。
本发明的宿主细胞可用于制备本发明的多肽。它包括在可以产生多 肽的条件下培养本发明的宿主细胞，以及任选地，回收所述多肽。在优 选的实施方案中，制备的是具有DNA结合活性的重组多肽。
在一个实施方案中，宿主细胞是这样一种转基因植物，其中编码本 发明的蛋白质的基因被沉默。结果，生成苯环型化合物的莽草酸途径中 的酶被下调，例如3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸-7-磷酸合酶(Z^历y)、 5-烯醇-丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(^户57，5)、分支酸变位酶(fife)和L-苯 丙氨酸解氨酶(川Z)基因的转录水平降低，植物的挥发物情况发生变化。
在另一个实施方案中，宿主细胞是这样一种转基因植物，其中编码 本发明的蛋白质的基因过表达，并且莽草酸途径的酶上调，例如3-脱 氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸-7-磷酸合酶("^^5)、5-烯醇-丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶U7Wy)、分支酸变位酶(6劝和L-苯丙氨酸解氨酶(^Z)基因
的转录水平提高，挥发物情况发生变化而产生更多的香味。EPSPS的产 生水平提高的转基因植物在化学防御手段方面特别有用。尤其是在那些
使用含有草甘膦的植物保护产品的防御手段中特别有用，因为EPSPS 的水平提高后，植物对草甘膦的抵抗力也提高。
在另一个实施方案中，宿主细胞是这样一种转基因植物，其中编码 本发明的蛋白质的基因过表达，并且挥发物情况发生变化，通过提高苯 环型化合物的产量来加强植物对病原性生物体的化学防御体系。它包括 用作杀虫剂、杀真菌剂、杀线虫剂、杀软体动物剂或杀啮齿动物剂的苯 环型化合物。
在另一个实施方案中，宿主细胞是导致这样一种转基因植物的转基 因植物细胞，其中编码本发明的蛋白质的基因过表达，以致发生共抑制。 结果导致该基因被沉默(Jorgensen et al. (1996) Plant Mol Biol 31:
957-973 )以及产生苯环型化合物的莽草酸途径的基因i /M/V、 f户i7^、 6￥和,JZ的转录水平降4氐。在另 一个实施方案中，宿主细胞是导致这样一种转基因植物的转基 因植物细胞，其中编码本发明的蛋白质的基因以本领域所知的其他方式 被沉默。在另一个实施方案中，宿主细胞是导致这样一种转基因植物的转基 因植物细胞，其中编码本发明的蛋白质的基因被沉默，并且挥发物情况 发生变化，导致对昆虫的吸引消失或减少。在另一个实施方案中，宿主细胞是导致这样一种转基因植物的转基 因植物细胞，其中编码本发明的蛋白质的基因被引入该宿主中，该宿主 在引入该基因前不含有该基因，或者该基因处于非活性状态。这样，就 可以调节莽草酸途径，从而调节芳香族化合物的生物合成途径。抗体针对本发明的多肽的抗体也涵盖于本发明之中。产生多克隆和单克 隆抗体的方法已为本领域所公知(参见例如Harlow and Lane (1988) 力/7〃6od/e51, J Za6or"o/y #a/zwa7, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)。 抗体可直接使 用，但优选以可检测性标记对抗体进4亍标记。适合的抗体标记为本领域 技术人员所熟知，包括但不限于放射性标记、电子致密标记、酶标记和 荧光标记。在优选的实施方案中，使用酶标记或荧光标记，例如碱性磷 酸酶、辣根过氧化物酶和荧光素。细胞内产生的抗体，即所谓的内抗体也涵盖于本发明之中。内抗体 的构建在本领域中已有记载，例如美国专利6, 004, 940和W0 01/48017。本发明的抗体可用于识别或检测有气味花朵的方法中。该方法包括 将植物材料与本发明的抗体相接触；然后检测是否发生与本发明的多肽 相结合。该方法也涵盖于本发明之中。蛋白质可4吏用本领域中已知的回收4支术回收，例如记栽于Methods Enzymol. vol. 182， Guide to protein purification. Eds. M.P. Deutscher (1990) Academic Press Inc。本发明的方法
根据本发明的多肽、多核苷酸、载体或抗体或其片段(总称本发明 的化合物)可用于操控莽草酸途径的基因的转录水平的方法中，例如3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸-7-磷酸合酶(W历y) 、 5-烯醇-丙酮酸莽草 酸-3-磷酸合酶(^y775)、分支酸变位酶(C銷和L-苯丙氨酸解氨酶CPJZ) 基因的转录水平。通过这些酶，可影响下游的生物合成过程。例如，本 发明的化合物可用于调节花朵气味的方法中，或者用于调节对有害昆虫 或病原性生物体的抵抗力的方法中。因此，根据本发明的多肽、多核苷 酸、载体或者抗体或其片段在以下方面的用途也涵盖于本发明中改变 植物中挥发性气味化合物的情况；调节莽草酸苯丙氨酸合成途径的基因 的转录水平；调节类苯丙酸途径的基因的转录水平；调节涉及苯环型化 合物生物合成的基因的转录水平；调节芳香族氨基酸的生物合成，特别 是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成。在一个实施方案中，本发明的化合物用于一种制备挥发性气味化合 物的情况发生改变的植物的方法。该方法包括将本发明的多核苷酸引入 植物中。在一个实施方案中，将本发明的多核苷酸引入植物的基因组中。在另一个实施方案中，本发明的化合物用于一种区分有气味植物和无 气p未植物的方法。该方法包括-将植物与本发明的化合物接触；以及—检测与该化合物的结合情况，或检测本发明的核苷酸的多态性。 在另一个实施方案中，本发明的化合物在植物育种中用于遗传分析 或标记辅助选择。特别是，它们可适用于基于PCR的标记辅助选择，如 限制性片段长度多态性(RFLP)、扩增片段长度多态性(AFLP)、随机 扩增多态性DNA (RAPD)、单核苷酸多态性(SNP)和微卫星。对这些 :技术的更多叙述，参见例如Welsh&McClelland (1990) Nucleic Acids Research 18: 7213-7218; Vos et al. (1995) Nucleic Acids Research 23: 4407-4414以及Struss & Plieske (1998) Theoretical & Applied Genomics 97:308-315。通过比较两种繁殖系或栽培种的限制图镨或核 苷酸序列差异，可识别出编码本发明的多肽的基因内的多态性。这使得 能够极早地选择与本发明的多肽相关的性状，例如具有气味或者苯环型 化合物水平提高。在另 一个实施方案中，本发明的化合物用于通过下调本发明的多肽 来提高对有害昆虫的抗性的方法。这种下调会改变散发的挥发性苯环型
化合物的情况，结果将减少对有害昆虫的吸引，或者吸引有害昆虫的捕 食者。在另 一个实施方案中，本发明的化合物用于通过上调本发明的多肽 的表达来提高对病原性生物体的抗性的方法。这种上调会改变所产生的 苯环型化合物的情况，所述苯环型化合物是植物对病原性生物体如病原 性细菌和真菌等的化学防御机制的一部分。在植物和动物系统中上调和下调多肽表达的方法为本领域所公知。 上调是基于在全部植物或特定的植物部分如花瓣和叶中目的多肽的过 表达。下调可在DNA水平发生，通过干扰例如转录来进行。或者，它可在 RNA水平进行干扰，例如干扰RNA向蛋白质翻译位置的易位，或者干扰 由RM到蛋白质的翻译，或者干扰由RNA生成一种或多种mRNA的剪接。 这些干扰表达的总体效果是基因表达减少(抑制)。优选RNA水平的干 扰。实现RNA水平的干扰的适当的方法可以是使用双链或发夹RNA 的RNAi;使用siRNA进行沉默；或者通过共抑制。参见例如Hammond & Ha調n (2001) Nature Rev Gen 2: 110-119, Arabidopsis， A laboratory manual Eds. D. Weigel & J Glazebrook (2002)， CSHL Press and Cogoni & Macino (2000) Genes Dev 10: 638-643。下调还包括翻译抑制和翻译后抑制。翻译抑制和翻译后抑制的方法 在本领域已经/>知。适当情况下，为此目的，可使用内源性21-24 nt RNA 的miRNA，它主要用作翻译的阻抑物从而只影响蛋白质的表达水平；可 使用磷酸化、乙酰化、曱基化、糖基化、脯氨酰异构化、唾液酸化、羟 基化、氧化、谷胱甘肽化(glutathionylation)和遍在蛋白化；或者 也可使用抗体、抗体片段以及化学和肽抑制剂。识别抑制剂的方法在本领域已知并有记载，包括以下等方法肽和 肽模拟物(peptidomimetics )的筛选文库、DNA或cDNA表达文库、组 合化学以及特别有用的噬菌体呈现文库。可以通过将这些文库与基本纯 化的多肽、其片段或其结构类似物相接触，以在这些文库中筛选结合分 子。在优选的实施方案中，抑制剂靶向本发明的多肽的DNA结合结构域。 本文使用的术语"抑制剂，，包括这样一些分子，例如可与本发明的化合 物结合的肽、肽序列、肽样分子和非肽样分子。
具体实施方式
实施例植物材料和转化如先前在Verdonk et al.户一oc力e迈/"ry 62, 997-1008 (2003)中 所述，种植矮牵牛(户e^/7/a力y6W&)栽培种Mitchell (也称为W115系； 腋花矮牵牛x (腋花矮牵牛x玫瑰天堂矮牵牛)(户，a,/V/ar/;y x (户.x户.Rose of Heaven)))和W138植林。所有实验中 均选用带有至少三个成熟花朵的植林。由根癌农杆菌(Jgro6",eW咖 ^迈e/ac/'e"; )(菌林GV3101:: pMP90 )介导的转化，通过将叶切片浸入该 细菌培养物中(28X:过夜，IO倍稀释)来获得转基因矮牵牛。在含有150 mg/ml卡那霉素的MS培养基中选择转基因愈伤组织，然后从愈伤组织中再 生出植抹，如Lucker et al..户/a^ /oi/r/2a/ 27， 315—324 (2001)所述。 使用PCR测试生根植林中是否存在/7&//基因和RMi构建体。将阳性植抹 移入温室中。选择和识别0D01花瓣特异性DNA孩i阵列的构建、标记和分析在以前的Verdonk et al. 尸A^oc力e/zz/'"r/62， 997-1008 (2003)中已经记载。比较了下列三个实 验9. 00h的Mitchell花瓣与15. 00u的；12. 00h的花瓣与15. 00h 的；以及15. 00h的Mitchell花瓣与15. 00h的W138 (无气"未栽培种) 花瓣。对显著上调(参见Verdonk et al.脚&c力eiz7/s"762， 997-1008 U003))和与气味散发同时上调且在W138中不上调的cDM进行测序。 其中之一被识别为MYB同源物，但从这些微阵列实验中也选择出了 DAHPS、 EPSPS、 CM、 PALI和2以及BEBT。 RNA凝胶印迹分析按照Verdonk et al.户A^oc力e巡/; "7 62， 997-1008 (2003)所述的方法进^f亍；将特 异性3， UTR探针用于PALI和2。产生RMi沉默构建体设计两条包括 Gateway ( Invitrogen life technologies, Carlsbad, CA， USA)接头在内的引物，来扩增0D01可译框架的从核苷 酸573至876区域。正向引物5，-aaa aag cag get CAC CAC TGA TGA ATC CAA GC-3，；反向引物5，—aga aag ctg ggt CCT GTT CTC TAC GTT ATC-3，(小写字母表示引物中构建的GatewayTM接头)。将扩增的PCR
产物克隆至pD0NR207载体，并按厂商(Invitrogen life technologies ) 所述转移至大肠杆菌(E. col i) DH5a中的RNAi目标栽体pK7GWIWG2 (I) (其nptll基因为植物细胞提供卡那霉素抗性；VIB， Gent, Belgium) 中。对构建体进行测序，随后使用标准的分子生物学技术将其转化至根 癌农杆菌GV3101:: pMP90细胞中。 对挥发物取样将切碎的花朵放入装有水的玻璃Erlenmeyer瓶中，将Erlenmeyer 瓶放入1升的瓶中，然后用带有玻璃进气口和出气口的盖子将瓶子盖 好，以收集挥发物。通过在瓶子的出气口处施加真空，使经碳过滤的空 气进入瓶中。用150 mg Tenax TA置于5 mm宽的玻璃管中以捕获溢出 气体，连续20 h收集花朵的顶部空间气体，从而对花朵散发的挥发物 进行100 %采样。使用含有8.37 ng/y 1 a-萜品烯的2 ml戊烷二乙 醚(4: l)来洗脱tenax以作为内标。通过毛细管气相色语-质语来分析 洗脱液中的挥发物。在250'C下，将1 ji 1洗脱液注入Optic (ATAS, GL， International)的注入口中。分流(split flow)为0 ml min—、 2分 钟，然后25mlmin—\直到该过程结束。以He作为栽气在毛细管DB-5 柱(10 x 180 |nm,膜厚度0. 18 jim; Hewlett Packard )上分离4匕合物， 先在401C保持3 min,然后以30°Cmin—'升温至250*C。柱流速为3 ml min—\持续2 min，然后是1.5 ml mirf1。洗脱化合物的质镨在70 eV 产生(离子源200。C )，在Time-of-Flight MS (Leco， Pegasus HI, St. Joseph, MI， USA)上收集，在-1597 eV处捕获延迟90 s ,捕获速 率20镨s人如先前Kant， et al.户/a/^尸Am'o7o^r135， 483-495 (2004) 所述，基于内标和已知浓度的合成外标对化合物进行识别和定量。每一 林系至少测量3次。每一实验中均测定花朵鲜重。实施例1:涉及矮牵牛花朵气味调节的转录因子的识别和表达 为了识别矮牵牛中涉及花朵气味调节的元件，使用了定向转录组学 方法。使用专门的高特异性微阵列，将有气味花朵的转录组与即将产生 气味的花朵以及不产生气味的矮牵牛栽培种花朵相比较。选择在即将产 生气味前转录水平升高、在无气味矮牵牛中转录水平很低的转录因子。 在此详细叙述一个转录因子OZW7 (0/W^^7"力。在正午和14. OOh之间挥发性苯环型化合物开始散发时，朋W的转录水平升高，这与其调节花朵气味的作用相一致。议矽7的转录水平升 高时间短暂，第二天清晨回到其最低水平。朋W的表达仅限于花筒和 花瓣。在花朵发育过程中，从花朵刚刚开放，直到大约6天后花朵枯萎， 都可以检测到朋W的转录。在被认为是无气味林系的矮牵牛W138系中， 朋W的转录水平很低。实施例2:参与花朵气味调节的转录因子的表征对0"W进行测序表明，它编码一个294氨基酸的推测性蛋白质(SEQ IDNO.l),与R2R3型M^家族成员具有很高的同源性，没有核定位信 号。虽然N-末端R2R3结构域(SEQ ID NO. 1的氨基酸1-128)含有高 保守性基序，并且含有据推测参与与某些可变核心基序(variable core motives)的DNA结合、形成螺旋-转角-螺旋结构的氨基酸，但C-末端 在Genbank数据库中却没有同源序列。系统树分析表明，与 /7iz ;7//7e//a 6rac力/car/7a的#/^以及鼠耳芥(^ra6/do/^/s f力a7/a/7a) ^#^^和^#7^5的两种#/^的关系最近，而这些#/^的功能均未知。 R2R3结构域中17个可变性更高的氨基酸在这三种蛋白质中是保守的。实施例3:沉默0D01基因以证实它在花朵气味调节中的作用 为了研究^W7在花朵气味调节中的作用，采用了转基因方法。通 过RNAi抑制了 Mitchell中^W7的表达。由于^W7只在花筒和花瓣中 表达，而不在其他任何组织中表达，所以我们在RNAi构建体中使用了 组成型启动子。该启动子驱动编码0ZW7的C-末端的序列(它与数据库 中的其他基因没有同源性)，所以能够抑制^W7转录物的积累。我们 在RNAi构建体中使用了 0"W的内含子，也来转化Mitchell系用作阴 性对照。在17. OOh，分析各独立的转化林的花朵中OZW7的转录水平 (17. OOh时亲本Mitchell系的转录水平较高)。为了快速研究各转基 因系的各个花朵产生的挥发物，我们使用了如Verdonk et al. (2003) 户力7"c力eiZ7/;^/y 62， 997-1008所述的定向代谢组学方法。然后，对产 生挥发物较少的林系的花朵测定散发的挥发物的量，并与亲本林系散发 的挥发物进行比较。从这些转录和挥发物分析中，的转录水平和 挥发性苯环型化合物的散发之间看起来存在着明显的相关性。
实施例4:对沉默的转基因植林和对照植林散发的挥发物进行定量测定对独立的转基因林系散发的挥发物的定量分析示于图1中，表明散 发的苯曱酸曱酯、苯甲酸千酯和异丁香油酚是这些转基因林系中受影响 最大的挥发物。苯甲酸曱酯的散发减少最高达50%，苯曱酸节酯和异 丁香油酚的散发减少最高达95%。香草醛在Mitchell中的散发量较低， 而在RNAi-林系3的顶部空间检测不到。在散发量减少的林系中， 的抑制是最强的。没有WW7抑制的林系中，挥发物的散发量没有减少。 一种参与花朵发育的蛋白质一 一花结合蛋白1(/ 户力的转录水平没有受 到OiW7的明显影响，表明了 ^W7靶标的高度特异性。实施例5: 0D01基因的沉默对莽草酸途径的酶和L-苯丙氨酸解氨 酶CP^Z)的转录水平的影响合成苯曱酸甲酯、苯曱酸节酯和异丁香油酚的确切途径仍然未知， 但第一前体一一反式肉桂酸是通过L-苯丙氨酸解氨酶(AZ)转化L-苯丙 氨酸而得。莽草酸途径导致L-苯丙氨酸的生物合成。为了研究0/W/是 否影响莽草酸途径的酶和PAL酶的转录水平，我们进行了 RNA凝胶印迹 分析。图2显示，对于莽草酸途径中的第一种酶一一3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸-7-磷酸合酶(/^y户5)的转录水平而言，RNAi植抹要远低于 Mitchell植林。而且，对于5-烯醇-丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(^7V尸5) 和PAL的转录水平而言，RNAi植林也有减少(图2)。值得关注的是， 这些结果明显说明，不只调节花朵气味，还于此前调节莽草酸途 径的酶水平。
权利要求
1.一种具有DNA结合活性的多肽，选自(a)一种多肽，它与SEQ ID NO.1的氨基酸序列具有至少50％同一性；(b)一种多肽，它包含与SEQ ID NO.1的氨基酸13-116区域具有至少90％同一性的氨基酸序列；(c)一种多肽，它包含与SEQ ID NO.1的从氨基酸128至氨基酸294区域具有至少70％同一性的氨基酸序列。
2. —种重组或合成多核苷酸，包括选自下列的多核苷酸(a) —种多核苦酸，它与SEQ ID NO. 2所示的核苦酸序列或其片段 至少50%相同，所述片段所编码的肽具有对生成苯环型化合物的莽 草酸途径的调节活性；(b) —种多核苷酸，它编码权利要求1的多肽或者该多肽的片段， 所述片段具有对生成苯环型化合物的莽草酸途径的调节活性；(c) 一种多核苷酸，它具有与SEQ ID NO. 2多核苷酸序列互补的序 列；(d) —种多核普酸序列，它在严格条件下可与SEQ ID N0.2序列的一部分杂交。
3. —种载体，含有权利要求2的多核苷酸。
4. 一种宿主细胞，含有权利要求2的多核苷酸或者权利要求3的载体。
5. 根据权利要求4的宿主细胞，其中所述宿主细胞为植物细胞、细菌 细胞、酵母细胞、真菌细胞或者动物细胞。
6. —种转基因植物，含有权利要求2的多核苷酸。
7. —种化合物，它可与权利要求2的多核苷酸或者权利要求1的多肽 结合，其中所述化合物优选为抗体、其抗原结合片段或其衍生物； 或者序列与权利要求1的多核苷酸序列的一部分互补的多核苷酸。
8. —种生产具有对生成苯环型化合物的莽草酸途径的调节活性的重 组多肽的方法，包括在能够产生多肽的条件下培养权利要求3或 4的宿主细胞；以及回收所述多肽。
9. 权利要求2的多核苷酸、权利要求3的载体或者权利要求4或5的 宿主、权利要求1的多肽或者权利要求8的化合物在以下方面的用途改变植物中挥发性气味化合物的情况；调节莽草酸苯丙氨酸合 成途径的基因的转录水平；调节类苯丙酸途径的基因的转录水平； 调节涉及苯环型化合物生物合成的基因的转录水平；或调节芳香族 氨基酸的生物合成，特别是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成。
10. —种制备挥发性气味化合物的情况被改变的植物的方法，所述方法 包括将权利要求2的(a)或(b)所述的多核苷酸引入植物基因组中。
11. 一种调节花的气味的方法，所述方法包括操控权利要求2的多核苷 酸所编码的蛋白质的表达水平。
12. —种区分有气味植物和无气味植物的方法，所述方法包括 —将植物与权利要求8的化合物接触；以及-检测与权利要求1的多肽的结合情况，或者检测权利要求2的(a) 或(b)中所述的核苷酸的多态性。
13. —种调节或改变植物对有害昆虫或致病生物的抗性的方法，所述方 法包括改变权利要求8的多肽的表达。
14. 一种方法，所述方法用于调节植物中莽草酸苯丙氨酸合成途径的基 因的转录水平；调节类苯丙酸途径的基因的转录水平；调节涉及苯 环型化合物生物合成的基因的转录水平；或调节芳香族氨基酸的生 物合成，特别是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成，所述方法 包括(a) 改变权利要求2的(a)或(b)中所述的多核苷酸的转录水平；(b) 改变权利要求1的多肽的表达水平；或者(c) 将权利要求8的化合物引入植物中。
15. 本发明的多核苷酸在遗传分析或标记辅助选择方法中的用途。
16. 权利要求1的多肽在植物育种中的用途。
全文摘要
本发明涉及属于R2R3型MYB家族的多肽，它调节生成苯环型化合物的莽草酸途径。莽草酸途径是植物、细菌和真菌中合成三种必需芳香族氨基酸——酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的生物合成途径。本发明首次提供了莽草酸途径的调节蛋白质，以及调节动物中不能产生的这三种必需氨基酸的生物合成的方法。同时，它为由这些必需氨基酸衍生的芳香族和非芳香族化合物的生物合成的调节开辟了道路。本发明的多肽或多核苷酸可用于操控生成苯环型化合物的莽草酸途径的基因的转录水平的方法中，所述基因例如3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸-7-磷酸合酶(DAHPS)、5-烯醇-丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)、L-苯丙氨酸解氨酶(PAL)和分支酸变位酶(CM)基因。通过这些酶，可影响较低水平上的生物合成过程。例如，本发明的化合物可用于调节花朵气味或者调节对有害昆虫或病原性生物体的抵抗力的方法中。
文档编号C12N15/29GK101166825SQ200580036679
公开日2008年4月23日 申请日期2005年9月1日 优先权日2004年9月2日
发明者A·J·范图楠, J·C·弗登科, M·A·哈林, R·C·斯凯瑞克 申请人:关键基因公司