细胞的培养方法及其应用的制作方法

专利名称：细胞的培养方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及细胞的培养方法及其应用，更具体而言，涉及细胞的培养方法和应用该方法在细胞中生产蛋白质的方法。
背景技术：
培养动物细胞，想要得到由该动物细胞产生的天然型蛋白质的情况下，或者培养导入了编码期望的蛋白质的基因的动物细胞，以制备期望的蛋白质等的情况下，除了盐类、糖类、氨基酸类、以及维生素类等的基础营养物之外，为了使该动物细胞增殖，通常将来源于哺乳动物的提取物、具体而言，在5～20％的范围内将胎牛血清等血清添加到培养基中。不过，所涉及的来源于哺乳动物的血清存在占培养基的成本的75～95％、且常因为品质有批次间的差异不能获得稳定的增殖的缺点。此外，由于来自哺乳动物的血清不能用高压灭菌器等设备灭菌，可能会被病毒或者支原体污染，尽管其中多数是无害的，但将成为附加于稳定生产方面的重要的未知因素。此外，血清中含有500种以上的蛋白质，由于这个原因，造成了从培养中的培养基分离、纯化作为细胞产物的所期望的蛋白质的复杂化。为了消除此类在稳定生产上的问题，进行了使用胎球蛋白、胰岛素、转铁蛋白等的来源于血清的纯化的蛋白质以替代血清的方法。此外，从制备成本的观点出发，也尝试了使用从哺乳动物提取的培养基成分的方法。
不过，由于近年来对于来源于哺乳动物的成分，存在与疯牛病(mad cow disease)、牛海绵状脑症(Bovine SpongiformEncephalopathyBSE)、传染性海绵状脑症(TransmissibleSpongiform EncephalopathyTSE)、或者人海绵状脑病(Creutzfeld-Jakob DiseaseCJD)等有关的担心，所以从安全性的观点出发，期望出现一种不含有这些来源于哺乳动物的成分的动物细胞培养用培养基。
培养动物细胞的时候，如果不向使用的培养基中添加上述这样的来源于哺乳动物的成分的话，将会发生下述问题在培养的早期细胞的生存率的显著降低，培养液中的活细胞数减少，因而不能进行长期培养或者大量培养。
为了解决上述问题，报道了向培养用培养基中添加鱼肉的酶分解物或者鱼肉提取物的方法(专利文献1、2)。通过该方法，即使不用使用通常必须使用的胎牛血清，也可以高产量地生产蛋白质。
不过从制备成本的角度出发，优选尽可能提高蛋白质的产量的情况，因此期待得到进一步的改良。
专利文献1国际公开第99/63058号小册子专利文献2特开2003-334068号公报发明内容发明所要解决的问题本发明的目的在于，通过使用含有鱼肉的酶分解物或者鱼肉提取物的培养基进行流加培养，在细胞中高产量地生产蛋白质。
用于解决问题的方法本发明人等为了解决上述课题，进行了深入研究，结果发现通过使用添加了鱼肉的酶分解物或者鱼肉提取物的培养基进行流加培养，能够在细胞中以更高的产量产生期望的蛋白质，由此完成了本发明。
本发明的内容如下所示。
(1)细胞的培养方法，其特征在于，在用初始培养基开始细胞的培养，并向正在进行细胞培养的培养基中再至少加入一次流加培养基的培养方法中，向初始培养基或者流加培养基的至少一方中添加鱼肉的酶分解物或者鱼肉提取物。
(2)细胞的培养方法，其特征在于，用添加了鱼肉的酶分解物或者鱼肉提取物的培养基开始细胞的培养，向正在进行细胞培养的培养基中再至少加入一次鱼肉的酶分解物或者鱼肉提取物。
(3)第(2)项中记载的培养方法，其中，使用流加培养法培养细胞。
(4)第(1)～(3)的任一项中记载的培养方法，其中，细胞是导入了编码期望的蛋白质的基因的细胞。
(5)第(4)项中记载的培养方法，其中，所期望的蛋白质是抗体。
(6)第(1)～(5)中任一项所记载的培养方法，其中，细胞是动物细胞。
(7)第(6)项中记载的培养方法，其中，细胞是哺乳动物细胞。
(8)第(7)项中记载的培养方法，其中，哺乳动物细胞是CHO细胞。
(9)制备方法，是使用初始培养基开始细胞的培养，通过向正在进行细胞培养的培养基中再至少加入一次流加培养基以培养细胞的制造蛋白质的方法，其特征在于，在初始培养基或者流加培养基的至少一方中添加鱼肉的酶分解物或者鱼肉提取物。
(10)蛋白质的制备方法，其特征在于，用添加了鱼肉的酶分解物或者鱼肉提取物的培养基开始细胞的培养，向正在进行细胞培养的培养基中再至少加入一次鱼肉的酶分解物或者鱼肉提取物。
(11)第(10)项中记载的制备方法，其中，用流加培养法培养细胞。
(12)第(9)～(11)中任一项记载的制备方法，其中，细胞是导入了编码期望的蛋白质的基因的细胞。
(13)第(12)项记载的制备方法，其中，所期望的蛋白质是抗体。
(14)第(9)～(13)中任一项记载的制备方法，其中，细胞是动物细胞。
(15)第(14)项中记载的制备方法，其中，细胞是哺乳动物细胞。
(16)第(15)项中记载的制备方法，其中，哺乳动物细胞是CHO细胞。
发明的效果在本发明中，通过不仅向在细胞的培养开始时的培养基中添加鱼肉的酶分解物或者鱼肉提取物，还向正在进行细胞培养的培养基中加入鱼肉的酶分解物或者鱼肉提取物，能够以更高的产量在细胞中生产期望的蛋白质。
本说明书包括作为本申请的优先权的基础的日本专利申请、特愿2005-000747号的说明书以及/或者附图所记载的内容。


图1是表示使用添加了5g/L狐鲣水解物的不含来自哺乳动物成分的培养基(初始培养基)以及添加了30g/L狐鲣水解物的不含来自哺乳动物成分的培养基(流加培养基)培养的CHO细胞在培养基中产生的抗体蛋白质浓度(g/L)的图。
图2是表示用添加了15g/L狐鲣水解物的不含来自哺乳动物成分的培养基(初始培养基)以及添加了75g/L狐鲣水解物的不含来自哺乳动物成分的培养基(流加培养基)培养的CHO细胞在培养基中产生的抗体蛋白质浓度(g/L)的图。
图3是表示用添加了5g/L狐鲣水解物的不含来自哺乳动物成分的培养基(初始培养基)以及添加了30g/L狐鲣水解物的不含来自哺乳动物成分的培养基(流加培养基)培养的CHO细胞在培养基中产生的抗体蛋白质浓度(g/L)的图。
具体实施例方式
下面对本发明的实施方式进行更详细的说明。
在本发明中以初始培养基开始细胞的培养，然后，向正在进行细胞培养的培养基中至少一次加入流加培养基。此处，初始培养基或者流加培养基的至少一方添加有鱼肉的酶分解物或者鱼肉提取物。
此外，作为本发明的优选的实施方案，使用添加了鱼肉的酶分解物或者鱼肉提取物的培养基开始细胞的培养，然后，向正在进行细胞培养的培养基中至少1次加入鱼肉的酶分解物或者鱼肉提取物。
根据本发明，即使不在目前通常作为动物细胞培养用培养基使用的培养基中添加来源于哺乳动物细胞的成分，也能很好地进行细胞的培养。
通常，细胞培养的方法分类为分批法(batch culture)、连续法(continuous culture)、流加培养法(fed-batch culture)。本发明的方法中可以使用任何一种培养方法，但优选使用流加培养法或者连续法，特别优选使用流加培养法。
分批法是向培养基中加入少量的种培养液，在培养过程中添加新的培养基或者不排出培养液，使细胞增殖的培养方法。
连续法是在培养过程中连续地加入培养基，并且连续地使之排出的培养方法。需要说明的是，连续法也包含灌流培养。
流加培养法因为介于分批法和连续法之间，所以也称为半分批法(semi-batch culture)，是在培养过程中连续地或者逐次地加入培养基，但不像连续法那样地进行连续的培养液的排出的培养方法。流加培养的时候加入的培养基(以下称为流加培养基)无需是和已经在培养中使用的培养基(下面称为初始培养基)相同的培养基，可以添加不同的培养基，也可以仅添加特定的成分。
本发明中初始培养基指的是通常在细胞培养的最初的阶段所使用的培养基。不过在多次分开添加流加培养基成分的情况下，也可以将分别添加流加培养基之前的培养基作为初始培养基。
在本发明的方法中，采用流加培养法的情况下，可以在流加培养基或者初始培养基的任何一方中含有鱼肉的酶分解物或者鱼肉提取物，但优选在流加培养基以及初始培养基二者中含有鱼肉的酶分解物或者鱼肉提取物。此外，与初始培养基中的鱼肉的酶分解物或者鱼肉提取物的浓度相比较，优选流加培养基中的鱼肉的酶分解物或者鱼肉的提取物的浓度高。初始培养基中的鱼肉的酶分解物或者鱼肉提取物的浓度通常在1～30g/L是适当的，优选3～20g/L、更优选5～15g/L。流加培养基中的鱼肉的酶分解物或者鱼肉的提取物的浓度通常在5～150g/L10～120g/L是适当的，优选10～120g/L，进一步优选20～90g/L，更优选30～75g/L。培养之初的培养基和流加培养基的量之比没有特别的限定，不过通常将培养之初的培养基的体积定为1的情况下，流加培养基为0.01～10，优选0.1～1，进一步优选0.2～0.3。流加培养基可以连续地进行添加，也可以逐次地添加。在逐次添加的情况下，对添加的次数没有特别的限定，添加1次也可以，也可分成数次添加。
用于本发明的鱼肉的实例红肉鱼的鱼肉、如狐鲣、护卫(frigate)鲭、金枪鱼、鲭、太平洋竹刀鱼、沙丁鱼、马(horse)锖、和鲑鱼，和白肉鱼的鱼肉如、鳕鱼、日本海刺鳍鱼、右眼鲜鱼、左眼鲜鱼和海鲷科鱼。优选的实例是狐鲣、护卫(frigate)锖、鳕鱼、鲭鱼、鲑鱼和沙丁鱼。
在本发明中使用的鱼肉提取物可以通过例如、将上述鱼肉切成适当的小块或者切碎成为糊状，用热水、例如90-95℃的热水提取数十分钟到数十小时得到可溶性成分。具体而言，可列举狐鲣节制备时的狐鲣煮汤或者罐头制备时的烹调污水(cook drain)等。
此外鱼肉的酶分解物可以通过例如、将鱼肉煮过后原封不动地、或者切碎成糊状物、或者如上所述向得到的鱼肉提取物中加入适量的水，根据需要加热，使蛋白质变性后，用蛋白质分解酶处理，通过适当的离心分离或者过滤等操作除去油分或者不溶物而得到。可以将所说的鱼肉提取物或者鱼肉的酶分解物的pH调节到7-7.4左右使用。
作为蛋白质分解酶，可以列举蛋白酶和/或肽酶。本说明书中，蛋白酶这一用语指的是指以蛋白质作为底物水解蛋白质的酶，肽酶这一用语指的是将肽作为底物的肽键水解酶。即，可以通过蛋白酶对蛋白质底物的活性为蛋白酶活性，对肽底物的活性为肽酶活性进行区分。蛋白酶这一用语用于通过对蛋白质底物的蛋白酶活性催化肽键链之间的断裂的情况，因此肽内切酶在本说明书中作为蛋白酶的1种而使用。
具体而言，如木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶、菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶等来源于植物的酶、以及来源于霉菌、细菌、酵母等的微生物的酶，可列举出肽内切酶、肽外切酶、氨肽酶、羧肽酶、二肽酶等酶等。这些酶可以单独或者合并使用。合并使用的情况下，可以将其同时添加，也可以阶段性地添加。
作为本发明中鱼肉的酶分解物，优选用上述的蛋白酶处理，然后用肽酶处理得到的鱼肉的酶分解物。
酶处理根据所使用的酶的种类而不同，通常为pH2-12，优选pH4-8，在30-90℃，优选40-65℃的温度下，进行30分钟-72小时，优选3-24小时。此时，酶的使用量为作为底物的蛋白质的0.001-10W/W％、优选0.1-1W/W％、进一步优选0.2-0.6W/W％左右。可通过加热等使上述得到的鱼肉的酶分解物中的酶失活后，经适当地进行离心分离或者过滤等操作，除去油分或者不溶物以制备酶分解物。
鱼肉中包含鱼的内脏和真正的鱼肉，内脏和真正的鱼肉的比例没有特别的限定，可以使用任何比例，例如可以使用在特开2003-334068号中记载的比例。
作为在本发明中使用的培养基的其它的成分，可以适当使用通常在细胞(优选动物细胞)培养用培养基中使用的各成分，其中含有氨基酸、维生素类、脂类成分、能量源、渗透压调节剂、铁源、pH缓冲剂。除了上述成分以外，也可以添加例如微量金属元素、表面活性剂、增殖辅助因子、核苷等。
具体而言，可例举出含有下述物质的培养基L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-蛋氨酸、L-鸟氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸等、优选L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-胱氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸等的氨基酸类，i-肌醇、生物素、叶酸、硫辛酸、烟酸酰胺、烟酸、对氨基苯甲酸、泛酸钙、盐酸吡哆醛、盐酸吡哆醇、核黄素、盐酸硫胺素、维生素B12、抗坏血酸等，优选生物素、叶酸、硫辛酸、烟酸酰胺、泛酸钙、盐酸吡哆醛、核黄素、盐酸硫胺素、维生素B12、抗坏血酸等的维生素类；氯化胆碱、酒石酸胆碱、亚油酸、油酸、胆固醇等、优选氯化胆碱等的脂类物质；葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖等、优选葡萄糖等能量源；氯化钠、盐化钾、硝酸钾等、优选氯化钠等的渗透压调节剂；EDTA铁、柠檬酸钠铁、氯化铁、氯化亚铁、硫酸铁、硫酸亚铁、硝酸亚铁等、优选氯化亚铁、EDTA铁、柠檬酸铁等的铁源类物质；碳酸氢钠、氯化钙、磷酸二氢钠、HEPES、MOPS等、优选碳酸氢钠等pH缓冲剂。
除了上述成分以外，还可以添加例如硫酸铜、硫酸锰、硫酸锌、硫酸镁、氯化镍、氯化锡、氯化镁、亚硅酸钠等、优选硫酸铜、硫酸锌、硫酸镁等微量金属元素；Tween80、普流尼克F68等的表面活性剂；以及重组胰岛素、重组IGF、重组EGF、重组FGF、重组PDGF、重组TGF-α、盐酸乙醇胺、亚硒酸钠、视黄酸、盐酸腐胺等、优选亚硒酸钠、盐酸乙醇胺、重组型IGF、盐酸腐胺等的增殖辅助因子；脱氧腺嘌呤核苷、脱氧胞嘧啶核苷、脱氧鸟嘌呤核苷、腺嘌呤核苷、胞嘧啶核苷、鸟嘌呤核苷、尿嘧啶核苷等核苷等。需要说明的是上述本发明的优选例子中，还可以含有链霉素、青霉素G钾以及庆大霉素等抗生素、酚红等的pH指示剂。
培养基可以通过向市售的动物细胞培养用培养基、例如D-MEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)、D-MEM/F-12 1∶1 Mixture(Dulbecco’s Modified Eagle MediumNutrient Mixture F-12)、RPMI1640、CHO-S-SFMII(Invitrogen公司)、CHO-SF(Sigma-Aldrich公司)、EX-CELL301(JRH biosciences公司)、CD-CHO(Invitrogen公司)、IS CHO-V(Irvine Scientific公司)、PF-ACF-CHO(Sigma-Aldrich公司)等培养基中添加鱼肉提取物或者鱼肉的酶分解物来制备。
本发明中对添加鱼肉提取物或者鱼肉酶分解物的培养基没有特别的限定，可以使用任何培养基，不过优选不含来源于哺乳动物的血清的无血清培养基，特别是优选不含从哺乳类动物分离的来源于哺乳动物的成分的不含来源于哺乳动物的成分的培养基。
添加鱼肉提取物或者鱼肉的酶分解物的培养基是无血清培养基或者不含来源于动物的成分培养基的情况下，通常对上述培养的细胞进行驯化，以使培养的细胞在无血清培养基或者不含来源于动物的成分培养基中也能繁殖发育。细胞的驯化方法是本领域技术人员所熟知的。
另外，培养基中其它成分的含量的适当的范围是，氨基酸为0.05-1500mg/L、维生素类为0.001-10mg/L、脂类物质为0-200mg/L、能量源为1-20g/L、渗透压调节剂为0.1-10000mg/L、铁源为0.1-500mg/L、pH缓冲剂为1-10000mg/L、微量金属元素为0.00001-200mg/L、表面活性剂为0-5000mg/L、增殖辅助因子为0.05-10000μg/L以及核苷为0.001-50mg/L，可以根据培养的细胞的种类、期望的蛋白质的种类等进行适当确定。
培养基的pH根据培养的细胞而不同，一般情况下pH为6.8～7.6，多数情况下pH为7.0～7.4是合适的。
本发明的培养方法没有特别的限定，可以在各种细胞(例如细菌细胞、真菌细胞、昆虫细胞、植物细胞、动物细胞等)的培养中使用。例如，可以通过基因工程操作，培养重组了编码期望的蛋白质的基因的COS细胞或者CHO细胞、或者能够产生抗体的小鼠-人、小鼠-小鼠、小鼠-大鼠等的以杂交瘤为代表的融合细胞。本发明的方法也可用于培养动物细胞，得到由该动物细胞产生的天然型蛋白质的情况，除了上述细胞以外，还可以在BHK细胞、HeLa细胞等的培养中使用。
本发明中特别优选的动物细胞是导入了编码期望的蛋白质的基因的CHO细胞。期望的蛋白质没有特别限定，可以是由抗体(天然抗体、低分子化抗体、嵌合抗体、人源化抗体等)、或生理活性蛋白质(粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、红细胞生成素、干扰素、IL-1或者IL-6等白细胞介素、t-PA、尿激酶、血清白蛋白、血液凝固因子等)等构成的蛋白质，其中特别优选抗体。
本发明的制备方法所生产的抗体不仅包含人、小鼠、大鼠、仓鼠、兔子、猴子等来源于动物的单克隆抗体，还包含嵌合抗体、人源化抗体、双特异抗体等人工改造的基因重组型抗体。此外，抗体的免疫球蛋白的类型没有特别的限定，可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等的IgG、IgA、IgD、IgE、IgM等任何一种类型，但作为药物使用的情况下，优选IgG以及IgM。此外，作为本发明的抗体，不仅包含完整抗体，而且还包含Fv、Fab、F(ab)2等抗体片段、或者通过肽连接子结合抗体的可变区域的1价或2价以上的单链Fv(scFv、sc(Fv)2等)的低分子化抗体等。
培养条件根据使用的细胞的种类而不同，确定合适的条件即可。例如是CHO细胞时，通常可以在如下条件下进行培养气体CO2浓度为0-40％、优选在2-10％的气体环境下，30-39℃、优选37℃左右，培养1-14天时间。
另外，作为动物细胞培养用的各种的培养装置可以使用例如发酵罐型罐培养装置、气升悬浮型培养装置、培养烧瓶型培养装置、旋转烧瓶型培养装置、微载体型培养装置、流动层型培养装置、中空纤维型培养装置、转瓶型培养装置、充填罐型培养装置等进行培养。
采用本发明的方法，能够通过培养细胞(优选动物细胞)实现大量生产蛋白质。
动物细胞的蛋白质的产生，可仅仅单独对其进行培养，也可能存在必须进行特殊操作的情况，其操作或条件等可根据培养的动物细胞进行适当的决定。例如通过基因工程操作，在含有编码小鼠-人嵌合抗体的基因载体转化的CHO细胞中，在上述的条件下实施培养，能够在1～14天、优选7～10天左右，在培养基中得到期望的蛋白质。这可以按照常规方法(例如参照例如，抗体工程导论，Chijin Sho Kan出版公司，第102-104页；亲合色谱原理与方法、Amersham PharmaciaBitech，第56-60页)进行分离和纯化，得到所需要的蛋白质。
通过本发明，能够高产量的制备重组抗体(天然抗体、抗体片段、低分子化抗体、嵌合抗体、人源化抗体、双特异抗体等)、基因重组蛋白质(粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、红细胞生成素、干扰素、IL-1或者IL-6等的白细胞介素、t-PA、尿激酶、血清白蛋白、血液凝固因子等)等。
实施例下面根据实施例以及参考例对本发明进行具体的说明。需要说明的是，这些实施例等只是用于说明本发明，并不限定本发明的范围。
〔实施例1〕使用狐鲣水解物的流加培养培养基的组成以及制备方法如下所述。
初始培养基向不含来源于哺乳动物成分的培养基中添加5g/L在参考例1中制备的狐鲣水解物，溶解后过滤灭菌。
流加培养基将初始培养基中使用的不含来源于哺乳动物成分的培养基成分调整到相对初始培养基为约2倍浓度，加入30g/L狐鲣水解物，溶解后过滤灭菌。
细胞是国际公开第2005/005636号小册子记载的产生重组型抗神经节苷脂GM3人抗体(L612)的CHO细胞株。本抗体的分类是IgM。
向罐型细胞培养装置中加入初始培养基，向其中加入上述CHO细胞株使之达到2×105个细胞/mL，在37℃、10％CO2的条件下开始培养。在流加培养中，从培养的第3天开始，以一定的流速进行流加培养基的流加操作，一直培养到第14天。在培养开始时以及第3、7、10、14天时取样。针对各样品的培养上清，测定通过分子排阻层析而得到的抗体蛋白质浓度。如图1所示，不进行流加的情况下的抗体蛋白质浓度在培养到第10天时为0.6g/L左右。与此相对，如果流加含有狐鲣水解物的溶液，在培养到第10天时，能够得到1.2g/L以上，在第14天时得到超过1.7g/L的很高的抗体蛋白质浓度。
〔实施例2〕使用狐鲣水解物的流加培养培养基组成以及制备法如下所述。
初始培养基向不含来源于哺乳动物的成分的培养基中添加15g/L在参考例1中制备的狐鲣水解物，溶解后，过滤灭菌。
流加培养基将在初始培养基加入75g/L狐鲣水解物，使不含来自哺乳动物的成分培养基成分调整到相对初始培养基约4倍浓度，溶解后过滤灭菌。
细胞利用国际公开第92/19759号小册子的实施例10记载的利用人延伸因子1α启动子，按照特开平8-99902号公报的参考例2中记载的方法制备的产生人源化PM-1抗体(抗人IL-6受体抗体)的CHO细胞株。该抗体的分类是IgG1。
向罐型细胞培养装置中加入初始培养基，在其中将上述的CHO细胞株分别按照下述条件进行培养进行流加的情况下使之为1×106个细胞/mL，不进行流加的情况下，使之为0.5×106个细胞/mL地加入，在37℃、10％CO2的条件下开始培养。在流加培养中，从培养第2天开始以一定流速进行流加培养基的流加操作，一直培养到第10天。在培养开始时以及第3、5、7、10天时取样。对于各样品的培养上清，测定使用蛋白质A柱的亲和层析得到的抗体蛋白质浓度。如图2所示，在不进行流加的情况下的抗体蛋白质浓度在进行了7天的培养时，为0.5g/L左右。与此相对，如果流加含有狐鲣水解物的溶液，在进行了7天的培养时能够得到1.1g/L以上、第10天时超过1.4g/L的高的抗体蛋白质浓度。
〔实施例3〕使用狐鲣水解物的流加培养培养基组成以及制备法如下所述。
初始培养基向不含来源于哺乳动物的成分的培养基中添加5g/L在参考例1中制备的狐鲣水解物，溶解后过滤灭菌。使用不含狐鲣水解物的培养基作为比较对照。
流加培养基使不含来自哺乳动物的成分的培养基成分相对初始培养基为2倍浓度，加入30g/L狐鲣水解物，溶解后过滤灭菌。使用不含狐鲣水解物的培养基作为比较对照。
细胞用国际公开第2005/056604号小册子中记载的方法制备的、产生MPL结合性单链(Fv)2(sc(Fv)2)的重组CHO细胞。
培养结果向罐型细胞培养装置中加入初始培养基，在其中加入上述CHO细胞株使其达到3×105个细胞/mL，在37℃、10％CO2的条件下开始培养。培养第3天开始将按照一定的流速进行流加培养基的流加操作，直至培养到第14天。培养过程中适当取样。对于各样品的培养上清，使用与MPL的氨基酸序列中sc(Fv)2结合的部分，通过BIACORE法测定产生的蛋白质的浓度。
如图3所示，在不含狐鲣水解物的流加培养中，蛋白质浓度在培养到第14天时为450mg/L左右。与此相对，如果流加含有狐鲣水解物的溶液，能够在培养到第14天时得到超过760mg/L的很高的蛋白质浓度。
〔参考例1〕狐鲣的酶分解物的制备使用市售的狐鲣作为鱼肉。向840kg切成碎肉状的狐鲣中加入1200kg水，用3.2kg来源于植物的木瓜蛋白酶在pH6.0，65℃的条件下温育1小时，进行酶分解。然后，以3.2kg来自霉菌的外肽酶再在上述条件下进行15小时的酶分解后，通过在95℃加热使酶失活。之后离心分离，通过过滤除去不溶物、油分，浓缩制备鱼肉(狐鲣)的酶分解物约150kg。
在本说明书中引用的全部出版物、专利以及专利申请直接作为参考引入到本说明书中。
产业上的可应用性通过本发明可以在无需使用胎牛血清等昂贵且品质差异大的蛋白质的情况下，稳定地培养细胞。此外，通过用本发明的方法培养细胞，能够消除近年来令人困扰的诸如由异常朊病毒或者病毒等导致的污染的风险等问题，提供高产量的生产安全的生物药品的途径。
权利要求
1.细胞的培养方法，其特征在于，在用初始培养基开始细胞的培养，进一步向正在进行细胞培养的培养基中再至少加入一次流加培养基的培养方法中，向初始培养基或者流加培养基的至少一方中添加鱼肉的酶分解物或者鱼肉提取物。
2.细胞的培养方法，其特征在于，在添加了鱼肉的酶分解物或者鱼肉提取物的培养基中开始细胞的培养，向正在进行细胞培养的培养基中再至少加入一次鱼肉的酶分解物或者鱼肉提取物。
3.权利要求2记载的培养方法，其中，用流加培养法培养细胞。
4.权利要求1～3中任一项记载的培养方法，其中，细胞是导入了编码期望的蛋白质的基因的细胞。
5.权利要求4记载的培养方法，其中，所期望的蛋白质是抗体。
6.权利要求1～5中任一项所记载的培养方法，其中，细胞是动物细胞。
7.权利要求6记载的培养方法，其中，细胞是哺乳动物细胞。
8.权利要求7记载的培养方法，其中，哺乳动物细胞是CHO细胞。
9.制备方法，其是通过用初始培养基开始细胞的培养、向正在进行细胞培养的培养基中再至少加入一次流加培养基培养细胞的制造蛋白质的方法，其特征在于，在初始培养基或者流加培养基的至少一方中添加鱼肉的酶分解物或者鱼肉提取物。
10.蛋白质的制备方法，其特征在于，在添加了鱼肉的酶分解物或者鱼肉提取物的培养基中开始细胞的培养，向正在进行细胞培养的培养基中再至少加入一次鱼肉的酶分解物或者鱼肉提取物。
11.权利要求10记载的制备方法，其中，用流加培养法培养细胞。
12.权利要求9～11中任一项记载的制备方法，其中，细胞是导入了编码期望的蛋白质的基因的细胞。
13.权利要求12记载的制备方法，其中，所期望的蛋白质是抗体。
14.权利要求9～13中任一项记载的制备方法，其中，细胞是动物细胞。
15.权利要求14记载的制备方法，其中，细胞是哺乳动物细胞。
16.权利要求15记载的制备方法，其中，哺乳动物细胞是CHO细胞。
全文摘要
本发明涉及使用含有鱼肉的酶分解物或鱼肉提取物的培养基，使细胞高产量地生产蛋白质。还涉及细胞的培养方法，其特征在于，用添加了鱼肉的酶分解物或鱼肉提取物的培养基开始细胞的培养，向正在进行细胞培养的培养基中再至少加入一次鱼肉的酶分解物或者鱼肉提取物。以及利用该培养方法，制备期望的蛋白质的方法。
文档编号C12N5/10GK101061215SQ20058003954
公开日2007年10月24日 申请日期2005年12月26日 优先权日2005年1月5日
发明者后藤进, 岸下昇平, 田熊晋也, 平岛亲 申请人:中外制药株式会社