用于检测核酸的核酸片段以及检测核酸的方法

专利名称：：用于检测核酸的核酸片段以及检测核酸的方法
技术领域：
：本发明涉及用于检测核酸试样中的目标核酸的突变或多态性的核酸片段及片段组。具体来说，本发明涉及可同时识别存在于同一条核酸链上的多个不连续的区中所含的基因信息的用于检测核酸的探针、用于检测核酸的竟争物和使用这些探针或竟争物进行的目标核酸的^f全测方法以及用于^r测核酸的试剂盒。
背景技术：
：人类基因组的解读已经完成，人类染色体的全部序列均已了解，今后人们会专注于对各个基因所具有的信息的研究。目前，对于多种疾病与基因的突变或多态性的相关性的研究已取得进展，对于基因的突变或多态性与单基因疾病、多因子疾病的病因基因的关系逐渐了解。已有报道称很多基因中都具有多态性，是在个体识别或病因基因的探索中有用的标志。还有报道指出在红细胞的ABO型多态性或在HLA基因中可见的多态性中，对于输血或骨髓移植来说，其相容性对治疗结果等有重要影响。在上述状况下，人们需求可简便且准确地检测存在于靶基因或含有该靶基因的区域内的基因突变、基因多态性的技术。检测上述突变或多态性的方法例如有根据目标片段整体序列信息检测基因的突变或多态性的方法，该方法有PCR-SSCP法(例如参照Proc.Natl.Acad.Sci.USA86,2766(1989)(非专利文献l))、PCR-PHFA法(例如参照Nucl.AcidsRes.22,1541隱(1994)(非专利文献2))、PCR國DGGE法(例如参照Proc.Natl.Acad.Sci.USA86,232(1989)(非专利文献3》、PCR-RSCA法和测序法等。从理论上讲，这些方法中，当片段内的任何区域内存在突变或多态性时，都可以根据单链结构的不同、退火方法的不同、变性方法的不同、异源双链结构的不同、或者使已经得到解读的序列本身发生变化并检测其不同，以此来了解基因突变或多态性。另一方面，作为检测非常有限的区内的基因突变或多态性的方法，有PCR-SSP法、侵入物法、PCR-RFLP法等。这些方法中，存在裂解酶(Cleavase)的切断反应、限制酶的切断反应产生影响，通过检测该影响可以了解基因突变或基因多态性。作为上述的中间方法，有PCR-SSO法、Taqman法、LightCycler法等。这些方法是基于在靶区具有突变或多态性的DNA分子与具有对应于靶区的序列的合成寡核苷酸之间的亲和性不同而实施的。这些方法中，当合成寡核苷酸的结合区存在突变或多态性时，与合成寡核香酸的亲和性发生变化，由此使得寡核苷酸探针的结合、聚合酶的切断、或者焚光能量转移的有无发生变化，通过检测该变化可以了解基因突变或多态性。HLA(人白细胞抗原)在自身或非自身识别中发挥重要作用，该基因存在非常多的多态性。主要的基因有HLA-A、-B、-C、-DR、-DP、-DQ。移植时，预先在供者和被移植者之间检查这些基因的型别，通过使它们相容，可以使骨髓移植等的治疗效果大幅提高。目前报道的多态性的种类是各基因中都有数十至数百种。确定这些基因的等位基因是不容易的，特别是在非血缘的情况下，寻找具有相容的基因型的人是非常困难的，为此组织公众骨髓库，通过许多供者的登记来寻找相容者。确定HLA等的基因多态性的方法例如有PCR-SSP法、PCR-SSO法、直接测序法等(例如今日的移植第7巻SUPPL(1994)(非专利文献4))。其中，PCR-SSO法是适合多检样处理的方法，得到最广泛的应用。该方法中，设定寡核苷酸探针，该寡核鲁酸探针相当于在各HLA基因内显示多态性的多个区，由它们的反应方式来确定基因型。但是，人的基因包含来自父亲的和来自母亲的两组，并且HLA基因具有非常多的多态性，因此使用以往探针进行PCR-SSO法是无法确定基因型的。例如，一方的等位基因的两个相邻的位置#1、#2的碱基序列分别为A和T,另一方的对应的等位基因的位置的碱基序列为T和G时，4要照通常的方法，可从W的位置检测出A和T,从#2的位置可检测出碱基T和G。这意味一方的等位基因位置上分别具有A和G、另一方对应的等位基因位置上具有T和T时结果检测出同样的碱基。即，通常的PCR-SSO法中，无法区分物理连接的状态和非连接状态。通常是由连续的基因转录、翻译成连续的蛋白质，因此通过各等位单元了解基因的序列是很重要的。如上所述，如果各等位单元中序列未特定，则无法确定正确的多态性。关于这一点，直接测序法也同样。Saito等人提出了一种用于检测核酸的探针，该探针是在一个探针分子内经核酸的碱基而互相间隔地具有两个特异性序列区(参照国际公开公报WO03/027309号(专利文献1))。存在于该探针中的两处特异性序列区(识别靶序列的探针区)分别在杂交条件下与检样核酸上的耙核酸序列形成互补链。与探针上的两处特异性区互补的靶区存在于各自的链——检样核酸中时，两个特异性的区在两条链上物理间隔，所形成的互补链并不是具有足够强度的双链。但是，当两处特异性区上的互补的靶区存在于同一条链上时，所形成的互补链是具有足够强度的双链。因此，通过利用上述探针，可以根据所形成的双链的强度区分两处特异性的序列区中互补的耙区是在两条链上物理性间隔存在，还是在一条链上物理性相邻存在。但是，为了用一个探针识别两处序列，必须将两处序列分别进行最佳化，研究其最佳组合。例如，当同时识别在同一条核酸链上存在两处(例如一处有m个候选，另一处有n个候选时)的靶序列，如果使用单链探针，则在进行该探针区的最佳化时，必须制备mxn种探针。m为10、n为20时，必须制备IOx20=200种探针并进行评价。结果，最佳化作业变得繁杂，开发时间延长，必然增大开发成本。因此，人们希望获得探针容易制备、且检测精度高、操作性优异的方法。专利文献l:国际公开第03/027309号说明书非专利文献l:Proc.Natl.Acad.Sci.USA86,2766(1989)非专利文献2:Nucl.AcidsRes.22,1541画(1994)非专利文献3:Proc.Natl.Acad.Sci.USA86,232(1989)非专利文献4:今日的移植第7巻SUPPL(1994)。
发明内容本发明人等为了检测在同一条链上具有多个靶序列的目标核酸而制备用于检测核酸的探针时，发现采用不是在一个分子上具有连续的多个探针区，而是多个探针通过互相可连接的区形成相连接探针，具有与在一个分子上的情况同等或更高的检测灵敏度。本发明根据上述认识完成。因此，本发明的目的在于提供检测精度优异、具有2个以上的多个探针区、用于检测核酸的核酸片段及其片段组，含有上述核酸片段组的用于检测核酸的探针，以及使用上述探针的检测方法。本发明的核酸片段组含有可以与多个靶序列分别杂交的多个核酸片段，各核酸片段具有可互相连接的区，且该可连接的区之间的亲和性设定为比靶序列与核酸片段之间的亲和性高。本发明的核酸片段在本发明的核酸片段组中使用。本发明的用于检测核酸的4冢针含有本发明的核酸片段组。本发明的用于检测核酸的竟争物含有本发明的核酸片段组。本发明提供检测目标核酸的方法，其中所述目标核酸是多个耙序列可存在于同一条核酸链上，该方法包含以下步骤(a)使权利要求7或8的用于检测核酸的探针和核酸试样在可杂交的条件下进行接触的步骤；和(b)通过检测上述探针与核酸试样是否进行了杂交来判定核酸试样中是否存在目标核酸的步骤。本发明的用于检测核酸的试剂盒至少含有本发明的用于检测核酸的探针和本发明的用于检测核酸的竟争物。本发明可提供本发明的核酸片段组在目标核酸的检测中的应用，其中所述目标核酸是多个靶序列可存在于同一条核酸链上。根据本发明的另一方案，本发明的核酸片段可以是下述核酸片段可与多个靶序列杂交的多个核酸片段具有互相可连接的区域，且可连接的区域之间的亲和性设定为比靶序列与核酸片段之间的亲和性高。本发明的又一方案可提供含有上述核酸片段的用于检测核酸的探针。本发明的又一方案可提供含有上述核酸片段的用于检测核酸的竟争物。本发明的一个方案可提供检测目标核酸的方法，其中所述目标核酸是多个靶序列存在于同一条核酸链上，该方法包含以下步骤(a')准备核酸试样的步骤；(b')准备上述用于检测核酸的探针的步骤；(c，)使上述用于检测核酸的探针与核酸试样杂交的步骤；以及(d，)通过检测上述用于检测核酸的探针与核酸试样之间是否有形成的特异性杂交，判定核酸试样中是否存在目标核酸的步骤。本发明的又一方案提供用于检测核酸的试剂盒，该试剂盒含有上述用于检测核酸的探针和/或用于检测核酸的竟争物。本发明的用于检测核酸的探针检测具有多处基因多态性的基因的精度高，因此可用于人白细胞抗原(HLA)基因、T细胞受体基因、红细胞型别决定基因、Rh抗原基因的检测。附图简述图l是模式表示本发明的用于检测核酸的探针(11=2时)的图。图2是表示例1中使用的HLA-DR基因与用于检测核酸的探针的关系的图。图3是表示例2中使用的HLA-DR基因与用于检测核酸的探针的关系的图。图4是表示例3中使用的HLA-DR基因与用于检测核酸的探针的关系的图。图5是表示例4中使用的HLA-DR基因与竟争物的关系的图。发明的详细说明核酸片段及其组本发明的核酸片段组含有相对于多个靶序列可分别杂交的多个核酸片段的核酸片段组，各核酸片段具有互相可连接的区域，且该可连接的区域之间的亲和性设定为比靶序列与核酸片段之间的亲和性高。本发明的核酸片段是在本发明的核酸片段组中使用的核酸片段。这里，关于由目标核酸中选择靶序列，可根据可获得的基因突变或多态性的基因信息适当确定。这里所述"连接"是指反应液中多个分子键合，可以是任意的键。优选为非共价键，进一步优选象腺噤呤-胸腺嘧啶、鸟嘌呤-胞嘧啶的键那样的氢键。为核酸时，连接的强度可根据序列的长度、核酸的种类适当调节。本发明中，"亲和性"是表示核酸片段与靶序列、或者可互相连接的区之间的键合状态的强度，如果是核酸之间，则可用Tm值(溶解温度)表示。Tm值越高则键合状态越强、越稳定。Tm值可通过常用的方法例如下述文献所述方法测定i)WallaceR.B.,ShafferJ.,MurphyR.F.,BonnerJ.,HiroseT.,andItakuraK.(1979)Hybridizationofsyntheticoligodeoxyribonucleotidestophichi174DNA(合成的寡脱氧核糖核芬酸杂交到phichi174DNA上):theeffectofsinglebasepairmismatch(单石咸基^H晉目己的岁爻果)-NucleicAcidsRes.6(11):3543~3557;或者ii)BreslauerK丄，FrankR.,BlockerH.,MarkeyL.A.(1986)PredictingDNAduplexstabilityfromthebasesequence(/人碱基序歹寸判定DNA双螺旋稳定性)-Proc.Natl.Acad.Sci.USA83，3746~3750.本发明中，"杂交"是指核酸之间的互补性高时可形成两条链。通常设计为核酸彼此互补，也可以根据需要，在检测上不出现问题的范围内，可在其中含有一或多个(例如23个)错配。可存在的错配数量受到所要求的检测精度以及核酸片段的长度限制。检测时通过适当改变核酸片段与靶核酸的杂交形成条件，可以排除错配的情况，或者调节至可允许的错配数。用于检测核酸的探针本发明的用于检测核酸的探针是可以与目标核酸中的靶序列杂交的多个核酸片段，含有下述核酸片段，即，该各核酸片段具有互相可连接的区，且设定为可连接的区之间的亲和性比耙序列与核酸片段之间的亲和性高。例如，目标核酸具有n个靶序列，使用可与其杂交的n个核酸片段作为探针时，可互相连接的区至少存在n-l个，因此，可以使用互相结合的核酸片段的组作为探针。这里，n例如为26,优选2~4,更优选2~3，进一步优选2。其中的一个例子例如可以如图l所示制备。本发明的核酸片段只要是与目标核酸的靶区特异't生结合的核酸性物质即可，没有特别限定。具体例子有DNA(脱氧核糖核酸)、RNA(核糖核酸)、PNA(肽核酸)、LNA(锁定核酸)，可以使用一种或多种，优选为DNA、PNA，更优选DNA。核酸片段可根据目标核酸的序列信息，通过采用常用的方法适当合成。对核酸片段的长度没有特别限定，例如为5100个碱基长度，优选830个碱基、进一步优选1028个碱基。本发明中的可连接的区是指存在于可以与多个靶序列杂交的核酸片段之外的部分，并可通过特异性的亲和性互相连接的区。所述区可以存在于该核酸片段的3，末端或5，末端或者两个末端。具体来说，例如有抗原-抗体、配体-受体、或核酸-具有互补序列的核酸等组合，优选核酸-具有互补序列的核酸的组合。可连接的区为核酸时，其典型的长度为450个碱基，优选840个碱基，更优选1030个碱基。这些组合中的碱基可以是任意的序列，还可以从设计成形成预先确定的组合的碱基对的序列组中选择。很多情况下通过将由4个碱基左右组成的序列单元组合，从具有多样性的一系列的序列组中选择。连接好的探针之间的Tm值(溶解温度)比靶区和探针区的Tm值高，其温度差为2。C以上，优选10。C以上。在不会对探针的功能产生影响的范围内，本发明的探针可以在多个核酸片段中进一步含有可用于至少一个核酸片段上的标记物质或任意的序列或者修饰物质。本发明的用于检测核酸的探针可以将多个核酸片段中的至少一个核酸片段固定在固相上。这种情况下所使用的固相载体只要是本发明的用于检测核酸的探针或检样核酸可非特异性吸附的载体、或者可以导入官能基团并在该官能基团与核酸之间形成共价键的载体即可，任何材质或任何形状的载体均可利用。具体例子有所谓的聚合物制造的微量板、管、平板上、珠子形状的载体。本发明中，可以采用微量板、平板上或珠子形状，但从容易采用机械化的角度考虑，特别优选珠子形状。将本发明的核酸片段固定在固相上的方法例如有化学键合法[NucleicAcidsRes.,15,53735390(1987)]。具体例子有使用EDC等水溶性碳二亚胺等交联剂，使导入了羧基的载体和向5，末端导入了氨基己基的核酸键合的方法。其它固定方法有通过吸附等非特异性结合，将核酸直接固定在载体上的方法。载体为聚苯乙烯制时，紫外线照射或者添加氯化镁可以提高吸附效率(日本特开昭61-219400号/>报)。还有通过适当的方法，将核酸与蛋白质进行化学键合或非特异性吸附，利用该蛋白质与载体的非特异性吸附进行固定的方法等。固定在固相中的可以是检样核酸，固定载体和固定方法与本发明的用于检测核酸的探针的情况相同。本发明的用于检测核酸的探针用于检测可存在于检样中的耙核酸或鉴定作为检测对象的核酸。作为本发明的探针的检测对象的核酸，只要是在同一条链中具有多个靶区的目标核酸即可，优选来自人的基因，更优选人白细胞抗原(HLA)基因、T细胞受体基因、红细胞型别决定基因或者Rh抗原基因。在检测或者捕获与序列具有类似性的一系列基因组时，该上述探针也有用。即，在一系列的基因組的碱基序列中，连续的共通序列很短，因此只凭该区无法形成稳定的双链。这种情况下，如果在相邻的区存在同样的位置，则可以通过可同时识别本发明的多个区的探针进行检测或捕获。用于;^测核酸的竟争物本发明中，可以将上述核酸片段作为用于检测核酸的竟争物使用。将本发明的核酸片段作为用于检测核酸的竟争物使用时，可与目标核酸中的多个靶序列杂交的多个核酸片段的亲和性设定为与使用该核酸片段作为用于检测核酸的探针时的亲和性同等或其以下。为了将靶序列与核酸片段的亲和性设定成与用于检测核酸的探针的亲和性同等或以下，可以设定成使可与靶序列杂交的核酸片段与探针同等，或者使可与靶序列杂交的碱基数减少。本发明中，用于检测核酸的竟争物可以是为了提高目标核酸与上述用于检测核酸的探针的杂交反应的精度，并只选择性地检测目标核酸而使用。通常，本发明的用于检测核酸的竟争物优选相对于核酸试样为1/10的量至200倍量的范围，进一步优选1/2的量至10(M咅量。因此，根据本发明的一个优选方案，用于检测核酸的竟争物中，靶序列与核酸片段之间的亲和性与权利要求7或8所记载的探针中使用的核酸片段和靶序列之间的亲和性相比，设定为低或同等。检测核酸的方法如上所述，本发明可提供^^测目标核酸的方法，其中所述目标核酸是多个靶序列可存在于同一条核酸链上，该方法包含以下步骤(a)在可杂交的条件下，使权利要求7或8的用于检测核酸的探针与核酸试样接触的步骤；和(b)通过检测上述探针与核酸试样是否杂交来判定核酸试样中是否存在目标核酸的步骤。定，可以是如下方法预先将用于检测核酸的探针之间连接，然后使核酸试样与其杂交的方法；将一部分用于检测核酸的探针与核酸试样混合，然后添加其余的用于检测核酸的探针进行杂交的方法；分别同时加入用于检测核酸的探针与核酸试样，进行杂交的方法等。其中，可以使用于检测核酸的探针与核酸试样杂交的条件可根据所使用的探针和靶核酸等而变化，通常的条件是可适当设定。杂交形成条件的具体例子是15xSSC(0.75MNaCl、75mM柠檬酸钠)，优选此时的温度为2580'C。本发明的核酸的检测方法可应用在通常的基因检测法中使用的常规方法。所述方法例如有下述(1)(5)的方法(1)预先将本发明的用于检测的探针固定在固相上，使具有可检测的标记的目标核酸、或者预先导入了标记的目标核酸与已固定的探针杂交，检测残留在固相上的标记的方法；(2)预先将目标核酸固定在固相上，使预先导入了可^f企测的标记的本发明的探针与固定的目标核酸进行杂交，检测残留在固相上的才示i己的方法；(3)将本发明的探针和目标核酸分别与各自的可悬浮的固相结合，将它们进行杂交，发生凝聚反应，确认该凝聚的方法；(4)将本发明的探针与目标核酸在液相中杂交，检测由于双链的形成而产生的荧光能量转移的方法；和(5)将上述(1卜(4)任意组合而成的方法。本发明中，优选上述(l)的方法。上述(l)的方法中，目标核酸容易被已固定的本发明的探针捕获，目标核酸以外的核酸则不被捕获，因此通过测定固相上的标平，即可以容易地检测出目标核酸。对本发明的用于检测核酸的探针或检样核酸进行标记的方法例子包括(A)向需要标记的核酸中直接导入标记物的方法；(B)使用已标记的寡核苷酸引物，合成要标记的核酸或与要标记的核酸互补的核酸的方法；和(C)在已标记的单位核酸存在下，使用寡核苷酸引物合成要标记的核酸或与要标记的核酸互补的核酸的方法。上述(A)的方法有通过光反应，向要标记的核酸中导入生物素书亍生物，通过与酶结合的链亲和素进4亍^r测的方法[NucleicAcidsRes.,13,745(1985)];将要标记的核酸进行磺化，使用酶标抗磺化抗体进行检测的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81,3466~3470(1984)]等。。例如在PCR法[Science,230,1350~1354(1985)]中，利用被标记的引物或者利用被标记的单核香酸三磷酸，可获得被标记的延伸产物或扩增产物。另外，在利用Q卩复制酶进行的扩增法[BIO/TECHNOLOGY,6,1197(1988)]中，通过利用同样标记的单核*酸三磷酸，可以获得被标记的延伸产物或扩增产物。另外，在上述以外的核酸扩增方法中，通过预先对经过延伸反应或扩增反应而掺入的单核苷酸三磷酸或寡核苷酸进行标记，可以标记延伸产物或扩增产物。这里使用的标记物只要是可以在杂交操作后检测出该物质即可，不管是放射性或非放射性。从应用的容易性、保存性、废弃处理等角度考虑，优选非放射性的标记物。非放射性的标记物例如有生物素、2,4-二硝基苯基、洋地黄毒苷等半抗原，荧光素及其衍生物[例如荧光素异^L氰酸酯(FITC)等]、罗丹明及其衍生物[例如四曱基罗丹明异硫氰酸酯(TRITC)、德克萨斯红等]、4-氟-7-硝基苯并呋喃(NBDF)和丹酰等荧光物质或吖啶等化学发光物质。通过这些物质对靶核酸或本发明的探针进行标记时，可通过任意公知的方法(参照日本特开昭59-93098号、日本特开昭59-93099号公报)进行标记。本发明中，检测本发明的探针与靶核酸之间是否形成特异性的杂交，该操作可根据所存在的标记的种类适当选择并确定。这里，标记如果可直接检测，即，标记例如为》文射线同位素、荧光物、染料等时，可在被标记的核酸与固相结合的状态下进行检测操作，或者在标记物与核酸结合的状态、或以标记物从核酸中切除的状态游离到溶液中、然后通过与该标记相适应的方法进行检测，缲作。标记可间接;险测时，即，标记例如为生物素、半抗原等特异性结合反应的配体时，如通常它们的>^测一样，可以使用直接发生信号的标记或结合了酶的受体(例如生物素受体或抗体)进行检测操作，其中所述酶催化发生信号的反应。根据本发明的一个优选方案，本发明的检测方法进一步包含在步骤(a)之前使检样中的检样核酸扩增的步骤。即，在本发明的检测方法中，优选在检测之前，以才企样核酸为模板，通过常用的基因扩增方法使检样核酸扩增。所述扩增方法例如有象PCR法(聚合酶链反应)那样的需要温度变化的方法、和象LAMP法(新式恒温核酸扩增法)那样的在恒温下进^f于的方法。根据本发明的另一个优选方案，在步骤(a)中进一步使用本发明的用于检测核酸的竟争物。通过使用竟争物，可以提高检测精度。或对作为检查对象的核酸进行鉴定。本发明的作为检测对象的核酸只要是在同一条链中具有多个靶区的靶核酸即可，可以是任何核酸，优选来自人的基因，更优选人白细胞抗原(HLA)基因、T细胞受体基因、红细胞型别决定基因、或Rh抗原基因。用于检测核酸的试剂盒本发明的用于检测核酸的试剂盒是用于检测试样核酸中是否存在目标核酸的耙系列的核酸，至少含有本发明的用于检测核酸的探针和本发明的用于检测核酸的竟争物。本发明的试剂盒优选进一步含有用于扩增目标核酸的引物。本发明的试剂盒还可以含有进行基因扩增反应而必需的试剂、进行杂交反应而必需的试剂、以及判定基因扩增产物与本发明的探针是否形成特异性杂交而必需的试剂等。这些试剂可以适当使用常用的试剂。例如，用于判断是否形成杂交的试剂可以是与双链进行特异性反应的嵌入剂等。本发明的试剂盒用于对可存在于检样中的靶核酸进行鉴定或者对作为检查对象的核酸进行鉴定。本发明的作为检测对象的核酸只要是在同一条链中具有多个靶区的靶核酸即可，可以是任何核酸，优选来自人的基因，更优选人白细胞抗原(HLA)基因、T细胞受体基因、红细胞型别决定基因、或Rh抗原基因。实施例以下通过实施例说明本发明，但本发明并不受此限定。例l:对HLA-DRB"150201和DRB1"50101、*0101、*040501以及*140701的识别使用本发明的用于检测核酸的探针，对HLA-DRBl基因(HLA-DRB1"50201(SEQIDNO:1)和DRB1"50101(SEQIDNO:2)、沐OIOI(SEQIDNO:3)、*040501(SEQIDNO:4)以及*140701(SEQIDNO:5))进行识别。作为用于检测核酸的探针，准备探针98-lLD(SEQIDNO:6)、98-2LD(SEQIDNO:7)和98-llUD(SEQIDNO:8)/Linl國9D(SEQIDNO:9)。它们具有识别HLA-DRB"150201基因中对应氨基酸编号69号72号的区(第一探针区)和对应84号88号的区(第二探针区)的探针序列。这里，探针98-lLD是两个探针区之间没有任何中断、连续存在的序列。98-2LD是两个区之间由4个胸苷酸(TTTT)相连接的序列。与此相对，98-llUD/Linl-9D是98-llUD、Linl-9D分别具有对应两个区的探针区。并且，98-llUD探针区的5'—侧具有6个(ACTC)的单元，Lml-9D探针序列的3，一侧具有6个(GAGT)的单元。两种〗笨针在该部分形成互补链，由此可以获得臂结构，两个探针区经由臂结构成为邻接的形。将这些探针使用EDC等水溶性碳二亚胺进行偶联，经由存在于寡核苷酸末端的氨基，可固定在羧基化聚苯乙烯珠上。另一方面，关于HLA-DRB1*150201、*150101基因，以掺入了各基因的质粒为模板，使用生物素标记引物进行PCR反应(这里，反应是以94。C/30秒、55。C/30秒、72。C/30秒为一个循环，实施30个循环)，得到扩增产物。对于表2中所迷的预先判定具有HLA-DRB1基因的检样#1~#5，使用染色体DNA得到扩增产物。在可形成杂交的条件下，使各基因的生物素标记的扩增产物分别与被固定的探针进行杂交。使链亲和素-藻红素(荧光物质)与其作用，洗涤，然后测定残留于珠子上的荧光强度，其相对值的结果表示在表2中。[表l]例1中制备的各探针与DRB1基因的错配数<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>表l表示了所使用的探针的第一区、第二区的序列与各DRB1基因之间的错配数。本实施例中使用的探针序列是与DRB1*150201基因在两个区均完全配对的序列，但与其它的基因则在其中一个区域存在错配。表2表示使用由各模板DNA制备的生物素标记DNA进行杂交后，残留在珠子上的荧光强度。由以质粒为模板DNA的实验例可知，本发明的探针识别第一区、第二区两者。即，对于第一区、第二区均没有错配的DRB"150201产生强的信号，而对于与第二区有错配的DRB"150101显示弱信号。另外，在其识别率方面，可知本发明的探针具有与两种比较例的探针同等或更高的性能。使用染色体DNA作为检样时，本发明的探针和比较例的探针均对含有DRB"150201的检样显示强烈的信号，而对于不含有该基因的检样产生弱信号。本发明的探针设计成笫一区、第二区存在于不同的分子上，通过可连接的区连接。如本实施例所示，具有上述结构的探针与实施例中其它形状的探针同样，可识别两处碱基序列，两个序列均配对时，其碱基对更稳定，可特异性检测。例2:对HLA-DRBin50201和DRB"150101、*030101、*040301、*070101、*130201、*140101和*140701的识别使用本发明的用于检测核酸的探针，对HLA-DRBl基因(HLA-DRB"150201和n50101、*030101(SEQIDNO:10)、*040301(SEQIDNO:11)、*070101(SEQIDNO:12)、*130201(SEQIDNO:13)、*140101(SEQIDNO:14)以及*140701)进行识别。用于检测核酸的探针使用将探针98-llUD、Linl-9D、Lin2GT-l(SEQIDNO:15)、Lin3GT-l(SEQIDNO:16)四种单独固定所得的探针；以及98-llUD和Linl-9D的混合物；98-11UD和Lin2GT-l的混合物；98-llUD和Lm3GT-l的混合物。这里，98-llUD具有对应氨基酸编号6972(第一区)的探针区，在其5'—侧具有6个(ACTC)的单元。Linl-9D具有对应氨基酸编号84~88(第二区)的探针区，在其5，一侧具有6个(GAGT)的单元。Lin2GT-1具有第二探针区，在其5，一侧具有6个(GTAG)的单元。Lin3GT-l具有第二探针区，在其5'—侧具有6个(ATGG)的单元。其中，98-llUD与Linl-9D组合时，各个单元形成互补的序列，可连接形成臂结构。按照与例1同样的方法，将各探针以单独或两种混合物的形式固定在羧基化珠上。另外，以质粒或染色体DNA为模板，通过生物素标记引物进行PCR扩增，得到生物素标记PCR产物。对于各基因的生物素标记扩增产物，在可形成杂交的条件下与分别固定有探针的珠子进行杂交。使链亲和素-藻红素(焚光物质)与其作用，洗涤后测定残留在珠子上的荧光强度，其相对值如表4所示。例2中制备的各探针与DRB1基因的错配数<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>[表4]残留在珠子上的荧光强度<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>表3表示所使用的探针的第一区、笫二区的序列与各DRB1基因之间的错配数。本实施例中使用的探针区是与DRBP150201基因在两个区均完全一致的序列，但与其它基因至少其中之一的区存在错配。具有对应第一区的探针区的98-llUD与DRBin50101和n50201具有完全一致的序列，与其它基因存在错配。使用染色体DNA作为检样时，对于该探针，对于含有与该探针完全一致的*150201基因的检样*1、*2,可得到比较高的信号。但是，对于使用质粒作为模板扩增的产物，比起完全配对的DRB"150201,对含有错配的*040301、*070101得到了高信号，未发挥原本的探针性能。具有对应第二区的探针序列的Linl-9D、Lin2GT-l、Lin3GT-l均与DRBP070101、*130201、*150201完全一致，与*030101、*040301、*140701和*150101有2个碱基的错配。这三种探针的探针部分的序列相同，只是单元的序列不同。这些探针中，对于完全配对和错配基因未见信号差异。由以上可知分别单独具有第一区、第二区的探针分子不可能同时识别两个区。另一方面，在以染色体DNA作为检样时，对于同时固定的、对应两个区的4笨针98-llUD/Linl-9D、98-11UD/Lin2GT-l、98-11UD/Lin3GT-l,在含有与两个区完全配对的*150201的染色体DNA检样#1、2中产生了高信号，在不含有*150201的检样#3、#4中产生低信号。这里，两个探针中所含的单元部分可形成互补序列的98-11UD/Linl-9D组合比不互补的其它两种探针进行的识别更明确。以质粒DNA为模板时，98-11UD/Linl-9D探针只对两个区完全配对的DRB"150201产生特异性信号，关于另外两种探针，98-llUD探针对具有错配的DRB"040301、*070101产生强信号，未见所期待的探针性能。由以上可知，在两个区通过互补的单元相连接的探针中，可以猜想到两个区经由臂结构形成相邻的结构，结果，同时识别两个区的探针的识别能力高。例3:对HLA-DRB"130201和HLA國DRBin30101、HLA-DRB1*1403的识别使用本发明的用于检测核酸的探针，对HLA-DRB"130201和*130101(SEQIDNO:17)、HLA-DRB1*1403(SEQIDNO:18)进行识别。作为用于检测核酸的探针，将只识别一个区的95-26UD(SEQIDNO:19)固定，在杂交的当时添加识别另一个区的LinGT2-2D(SEQIDNO:20)、GT2-2(SEQIDNO:21)或者GT2-2T(SEQIDNO:22)。这里，95-26UD具有对应氨基酸编号6972(第一区)的探针区，在其3，一侧具有5，-CACACCTCCTCTCCACCACACCTC-3'标记序列(SEQIDNO:23)。LinGT2-2D具有对应氨基酸编号8488(第二区)的探针区，在其5，一侧具有5，-GAGGTGTGGTGGAGAGGAGGTGTG-3，标记序列(SEQIDNO:24)和4个胸苷酸。GT2-2具有第二区的探针区，但在5，一侧没有任何序列。GT2-2T具有第二区的探针区，在其5'—侧具有含28个碱基的胸苷酸的序列。其中，95-26UD和LinGT2-2D的组合中，其各自的标记序列互补，通过在固定95-26UD的载体上添加LinGT2-2D,可以通过形成互补链而获得壁结构，形成识别第一区的部分和识别第二区的部分经由臂部分连接的结构。另一方面，在95-26UD与GT2-2或者95-26UD与GT2-2T的组合中，无法通过互补链形成臂结构，因此没有形成识别第一区、第二区的部分相邻接的结构。按照与例1同样的方法，将95-26UD单独固定在羧基化珠子上。生物素标记扩增产物是以掺入了各基因的质粒DNA作为模板，通过生物素标记引物进行PCR扩增来制备。使各基因的生物素标记扩增产物在可杂交的条件下与固定有95-26UD的珠子杂交。此时，液相中共存LinGT2-2D、GT2-2或GT2-2T。将链亲和素-藻红素(荧光物质)与其作用，洗涤后测定残留在珠子上的荧光强度，其相对值如表6所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>表5表示所使用的探针的第一区、第二区的序列分别与DRB1基因之间的错配数。本实施例中使用的探针区是与DRB"130201基因在两个区均完全一致的序列，但与DRBin30101在第二区存在错配，与DRB"1403在第一区存在错配。表6表示使用由各模板DNA制备的生物素标记扩增产物进行杂交后残留在珠子上的荧光强度。通过与被固定的探针形成互补链，只要在杂交中添加可形成第一、第二区相邻接结构的探针，即可识别第一区、第二区两者。即，在杂交时混合具有可与被固定的探针95-26UD互补的单元、并可通过形成互补链来形成两个区相邻接的结构的LinGT2-2D,对于与笫一区、第二区均没有错配的DRBin30201显示强信号，而对于与一个区有4晉配的DRBP130101、DRB"1403显示低信号。与此相对，在杂交时添加第二区的序列相同、但不能与固定探针获得臂结构、无法形成两个区相邻的结构的GT2-2和GT2-2T，与未添加的情况显示同等的低焚光强度。本发明的探针-没计成存在于第一区、笫二区不相同的分子上，并通过各自可连接的区相邻接。如本实施例所示，在只将一方的区固定、将另一方添加到液相中时，如果是两个区的碱基序列分别配对、并且两个区形成相邻接结构的探针，所形成的碱基对更稳定，可进行特异性检测。例4:通过添加核酸片段提高对HLA-DRB1"30101与DRB"130201和DRB"1403的识别能力使用本发明的核酸片段作为竟争物，对HLA-DRB1基因(HLA-DRB"130101和n30201、DRB1M403)进行识别。特异性检测核酸序列时，为了提高其特异性，已知有使探针序列、或与检样序列类似的序列的核酸共存的方法。本申请的核酸片段也有望具有同样的作用。作为用于检测核酸的探针，将本发明所示的核酸片段固定在固相上使用。在这里，将本发明的核酸片段添加在液相中，通过使其和检样竟争与探针的结合，判定是否可以提高杂交的特异性。本实施例中，预先将识别其中一个区的探针固定在固相上，在杂交时添加识别另一区的探针，也可以将两种探针同时固定。还可以在杂交时同时添加具有可互相连接的区、识别一个区的探针和识别另一个区的探针，使其互相连接，也还可以制成预先连接的形式然后添加。将只识别第一区的95-42UD(SEQIDNO:25)进行固定，在杂交时添加只识别第二区的LinTG3-5(SEQIDNO:26),由此制备识别两个不同的区的探针。另外，与此同时，作为竟争物，在杂交时添加识别第一区的95-25UD(SEQIDNO:27)、识别第二区的LinGT2-2D、或者同时添加两者。这里，95-42UD具有对应氨基酸编号69一2(第一区)的探针区，在其3，一侧具有含6个(ACTC)单元的标记序列。LinTGS-S具有对应氨基酸编号8488(第二区)的探针区，在其5，一侧具有含6个(GACT)单元的标记序列和4个胸苷酸。两者具有互补的标记序列，混合时可容易地连接。作为竟争物使用的95-25UD具有对应氨基酸编号69-72(第一区)的探针区，在其3，一侧具有5，-CACACCTCCTCTCCACCACACCTC-3，标记序列(SEQIDNO:23)。LinGT2-2D的序列如例3所示，除对应第二区的探针区之外，还具有标记序列5，-GAGGTGTGGTGGAGAGGAGGTGTG-3'(SEQIDNO:24)。其中，95-42UD与LinTG3-5的各标记序列互补，通过向固定有95-42UD的载体中添加LinTG3-5，可形成互补链，进而形成臂结构，形成识别第一区的部分和识别第二区的部分经由臂部分邻接的结构。另外，95-25UD与LinGT2-2D的各标记序列互补,分别添加到液相中，可通过形成互补链来形成臂结构，形成识别第一区的部分和识别笫二区的部分经由臂部分邻接的结构。按照与例1同样的方法，将95-42UD单独固定在羧基化珠子上。生物素标记的扩增产物如下制备以掺入了各基因的质粒DNA作为模板，通过生物素标记引物进行PCR扩增制备。使各基因的生物素标记扩增产物在可杂交的条件下与固定有95-42UD的珠子杂交。此时，液相中有与被固定的探针95-42UD形成互补链的LinTG3-5共存，形成笫一区和第二区邻接的探针结构。并且作为竟争物，只存在95-25UD、只存在LinGT2-2D、或者95-25UD、LinGT2-2D两者共存。使链亲和素-藻红素(荧光物质)与其作用，洗涤后测定残留在珠子上的荧光强度，其相对值如表8所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>之间的错配数。本实施例中使用的探针区是与BRD"130101基因在两个区均完全一致的序列，但与DRB"130201在笫二区、与DRB"14(B在笫一区、第二区存在错配。<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>表8表示使用由各模板DNA制备的生物素标记扩增产物进行杂交后残留在珠子上的荧光强度。未添加竟争物时，与DRB1"30201可见交叉杂交中可见的高荧光值。而添加可形成互补链的竟争物时，与未添加的相比，DRBin30201的荧光值明显下降，这表明通过使用竟争物，显著抑制了交叉杂交。即，使用本发明的用于检测核酸的探针作为竟争物时，可抑制交叉杂交，可以提高检测探针的识别精度。权利要求1.核酸片段组，该核酸片段组含有可与多个靶序列分别杂交的多个核酸片段，其中各核酸片段具有互相可连接的区，且该可连接的区之间的亲和性设定成比靶序列与核酸片段之间的亲和性高。2.权利要求l的核酸片段组，其中互相可连接的区由核酸组成。3.权利要求1或2的核酸片段组，其中多个核酸片段中的至少一个核酸片段被固定在固相上。4.权利要求3的核酸片段组，其中固相为珠状或平面状。5.权利要求14中任一项的核酸片段组，其中当多个靶序列存在于同一条核酸链上时，该核酸片段组可以与该核酸链杂交。6.核酸片段，该核酸片段在权利要求15中任一项的核酸片段组中使用。7.用于检测核酸的探针，该探针由权利要求15中任一项的核酸片段组组成。8.权利要求7的探针，该探针用于检测选自人白细胞抗原(HLA)基因、T细胞受体基因、红细胞型别决定基因和Rh抗原基因的基因。9.用于检测核酸的竟争物，该竟争物由权利要求15中任一项的核酸片段组組成。10.权利要求9的竟争物，其中靶序列与核酸片段之间的亲和性设定成比权利要求7或8的探针中使用的核酸片段与靶序列之间的亲和性低或同等。11.检测目标核酸的方法，其中所述目标核酸是多个耙序列可存在于同一条核酸链上，该方法包含以下步骤(a)在可杂交的条件下，使权利要求7或8的用于检测核酸的探针与核酸试样接触的步骤；和样中是否存在目标核酸的步骤。12.权利要求ll的检测方法，其中在步骤(a)中，进一步使用权利要求9或10的用于检测核酸的竟争物。13.权利要求11或12的检测方法，该方法进一步包含在步骤(a)之前，使核酸试样中的目标核酸扩增的步骤。14.权利要求1113中任一项的方法，其中目标核酸选自人白细胞抗原(HLA)基因、T细胞受体基因、红细胞型别决定基因和Rh抗原基因。15.用于检测核酸的试剂盒，该试剂盒至少含有权利要求7或8的用于检测核酸的探针和权利要求9或10的用于检测核酸的竟争物。16.权利要求15的用于检测核酸的试剂盒，该试剂盒进一步含有用于扩增目标核酸的引物。17.权利要求1~5中任一项的核酸片段组在检测目标核酸中的应用，其中所述目标核酸是多个靶序列可存在于同一条核酸链上。全文摘要本发明的核酸片段组含有可以与多个靶序列分别杂交的多个核酸片段，各核酸片段具有可互相连接的区，且该可连接的区之间的亲和性设定为比靶序列与核酸片段之间的亲和性高。本发明的核酸片段在核酸片段的组中使用。本发明的核酸片段可用作用于检测核酸的探针或用于检测核酸的竞争物。根据本发明，例如可以高精度地进行人白细胞抗原(HLA)基因、T细胞受体基因、红细胞型别决定基因、Rh抗原基因的检测。文档编号C12M1/00GK101103107SQ20058004665公开日2008年1月9日申请日期2005年11月21日优先权日2004年11月19日发明者冈孝纪,川井信太郎,直原宽申请人:湧永制药株式会社